2ml新配的4mg/ml NaBH4液，混匀，于4°C放置2小时。
[0029] 6)将上述液装入透析袋中，于pH7. 4,0. 15M的PBS透析，4°C过夜。
[0030] 实施例2检测人KIM-I的酶联免疫试剂盒的组建
[0031] 组建检测人KIM-I的酶联免疫试剂盒，包含以下试剂：
[0032] 1)小鼠抗人KM-I单克隆包被抗体；
[0033] 2) HRP标记的小鼠单克隆抗体；
[0034] 3)重组人KM-I蛋白标准品；
[0035] 4)包被缓冲液为pH7. 4的磷酸盐缓冲液；
[0036] 5)封闭液是含有2 %牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；
[0037] 6)样品稀释液为含有0. 1 %牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；
[0038] 7)浓缩洗涤液为含有2%吐温的磷酸盐缓冲液洗涤液；
[0039] 8)显色液A和显色液B组成，显色液A为过氧化氢或过氧化脲，显色液B为四甲基 联苯；
[0040] 9)终止液为2mol/L的硫酸
[0041] 实施例3检测人KIM-I的酶联免疫试剂盒的制备
[0042] 1.利用正交试验摸索酶联免疫试剂盒的最佳抗体浓度
[0043] 按照紫外分光光度计法，测定抗体及抗原的浓度。采用正交试验方法，将抗KIM-I 单克隆抗体稀释至浓度为4μ g/ml、2y g/ml、l μ g/ml，重组KIM-I蛋白浓度稀释至4000pg/ ml、400pg/ml、0pg/ml，HRP标记的抗KIM-I小鼠克隆抗体稀释浓度至4 μ g/ml、2 μ g/ml、 I μ g/ml、0. 5μ g/ml。综合考虑背景及重组蛋白的光吸收值,选择抗体的包被浓度为2μ g/ ml, HRP标记抗体的工作浓度为0. 5 μ g/ml。
[0044] 2.试剂盒的批量制备
[0045] 1)包被酶标板：用磷酸盐缓冲液（PBS)包被，将抗KM-I抗体稀释至浓度为2 μ g/ ml, 100 μ L/孔,包被96孔酶标板,4°C孵育过夜。
[0046] 2)封闭：倒去未包被的液体，用含0. 1 % Tween的PBS (PBST) 200 μ 1/孔，洗板1次。 加入300 μ 1封闭液封闭非特异性结合位点，室温孵育1小时。PBST洗板2次，拍干后用真 空包装机包装，4 °C保存备用。
[0047] 3)蛋白标准品的制备：用含0. 5% BSA的PBS稀释重组的KM-I蛋白，分装后冻 干，4°C保存备用。
[0048] 4)酶标抗体的制备：将作为检测抗体的抗KM-I单克隆抗体纯化后，HRP标记，加 入50%甘油，分装后-20°C保存备用。
[0049] 实施例4试剂盒主要参数的测定
[0050] 对影响试剂盒质量的主要参数包括线性范围、特异性、灵敏度、精密度、线性、回收 率等，其测定具体方法和结果如下：
[0051] 1.试剂盒的线性范围：
[0052] 1)将 KIM-I 蛋白用含 0· 1%BSA 的 PBST 稀释成，10,000pg/mL，1000pg/mL，0.1 pg/ mL，0pg/ml，100l·! 1/孔加入到上述包被好的酶标板中，室温孵育2小时。PBST洗板3遍。
[0053] 2)将HPR标记抗体用含0. 1 % BSA的PBST稀释成1 μ g/ml，100 μ 1/孔加入反应 孔中，室温孵育1小时。PBST洗板3遍。
[0054] 3)加入200 μ 1新鲜配置的TMB底物，室温避光显色20分钟，加入50 μ 12Μ硫酸终 止反应，酶标仪450nm波长的下读值。
[0055] 4)试验结果表明，当KM-I蛋白在浓度为10, 000pg/mL时已经饱和，在1000pg/mL 时，450nm吸光值在线性范围内。
[0056] 5)重复试验步骤1)、2)、3);调整KM-I蛋白的标准曲线各点为：4000pg/mL， 2000pg/mL，1000pg/mL，500pg/mL，250pg/mL，125pg/mL，62. 5pg/mL，0pg/mL·使其线性相关 系数在0. 99以上；即该试剂盒的线性范围为62. 5pg/mL-4000pg/mL。
[0057] 2.试剂盒的特异性：将重组的小鼠 KM-1、大鼠 KM-1、犬KM-I和猴KM-I稀释 至1250ng/ml，用人KIM-I酶联免疫检测试剂盒测试，试验结果证明，该试剂盒与1250ng/ml 的小鼠 KM-1、大鼠 KM-1、犬KM-I和猴KM-I无交叉反应。
[0058] 3.试剂盒的灵敏度
[0059] 以20个空白样品的平均光吸收值加上三倍标准偏差，计算相应KM-I含量，得到 试剂盒的最低检出限即灵敏度为〇. 〇〇8pg/mL ;说明本试剂盒有较高的检测灵敏度。
[0060] 4.试剂盒的精密度测定
[0061] 1)试验内精密度的测定
[0062] 选择4份含有不同KIM-I浓度的尿液样品，每个样品20个重复，在同一块酶标板 检测，分别计算每个检测结果的变异系数（C. V)，平均变异系数为3. 1% (见表1)。
[0063] 表1KIM-1ELISA试剂盒的试验内精密度实验
【主权项】
1. 一种检测人肾损伤分子的检测试剂盒，其特征在于，包括以识别人肾损伤分子不同 表位的单克隆抗体分别作为捕获抗体和检测抗体，以重组表达的人肾损伤分子作为抗原标 准品。
2. 权利要求1所述的抗原标准品为哺乳细胞表达的重组人肾损伤分子。
3. 权利要求2所述的抗原标准品为293细胞表达的重组人肾损伤分子。
4. 权利要求1所述的捕获抗体为小鼠单克隆抗体或兔单克隆抗体。
5. 权利要求1所述的捕获抗体是固定在微量滴定板或其他固相支持物上的。
6. 权利要求1所述的捕获抗体的量为2~4ug/mL。
7. 权利要求1所述的检测抗体量为0. 5~lug/mL.
8. 权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，包括包被缓冲液、封闭液、浓缩洗涤液、样品 稀释液、显色液、反应终止液。
9. 权利要求8所述的包被缓冲液为磷酸盐缓冲液；所述封闭液是含有2%牛血清白蛋 白的磷酸盐缓冲液；所述浓缩洗涤液为含有2%吐温的磷酸盐缓冲液；所述样品稀释液为 含有0. 1%牛血清白蛋白和0. 1%吐温的磷酸盐缓冲液；所述显色液由显色液A和显色液B 组成，显色液A为过氧化氢或过氧化脲，显色液B为四甲基联苯胺；所述终止液为2M的硫 酸。
【专利摘要】本发明公开了一种人KIM-1双抗夹心法检测试剂盒，主要包括抗KIM-1小鼠单克隆包被抗体，酶标KIM-1小鼠单克隆抗体以及重组表达的KIM-1蛋白标准品。本发明可以用于定性或定量检测样本中的KIM-1水平，优点是检验方法方便易行，检测灵敏度和准确度高、特异性强，能同时快速检测大批样本，可在KIM-1相关基础和临床研究中发挥重要作用。
【IPC分类】G01N33-535, G01N33-68
【公开号】CN104730250
【申请号】CN201310706630
【发明人】张 杰, 颜艳, 黄序
【申请人】北京义翘神州生物技术有限公司
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2013年12月20日