评价化学实体与其靶标分子之间的相互作用的全基因组方法
【专利说明】评价化学实体与其靶标分子之间的相互作用的全基因组方 法
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求2012年6月14日提交的美国临时申请N〇.61/659,750和2012年 7月6日提交的美国临时申请N 〇.61/668,718和2012年9月14日提交的美国临时申请 No. 61/701,434和2013年3月15日提交的美国临时申请No. 61/800,060的利益。
[0003] 将以上申请的完整教导按引用并入本文中。
[0004] 政府支持
[0005] 本发明是用来自国家卫生研宄院（National Institutes of Health)的 R01-HG002688和来自美国癌症协会的PF-11-042-01-DMC下的政府支持进行的。政府在本 发明中具有一定的权利。
[0006] 发明背景
[0007] 最近的技术发展已经允许通过将蛋白质定位于特定的DNA区域或相关染色质的 基因调控网络的全基因组（genome -wide)研究。与目标蛋白质相关的DNA的株度测序，使 用定向抗体的下拉（pulled-down)，提供了基因组组织的高分辨率空间图谱。所称的具有 深度测序的染色质免疫沉淀（ChIP-seq)，生物学家现在具有新的透镜，他们可以通过其了 解细胞和疾病生物学。然而，对于这个技术存在重大的限制。该程序需要验证的、特定的免 疫球蛋白的存在，并且仅单个蛋白质/DNA复合物可以分离。这种实验的复杂性限制了使用 ChIP-seq来了解和表征染色质定向的小分子的作用。
[0008] 发明概述
[0009] 本文中描述的是化学实体与其靶标分子之间的相互作用的全基因组评价，称为 Chem-seq 技术。
[0010] 因此，在一个方面中，本发明涉及对药物或药物候选物与基因组相关的一个或多 个因子的相互作用进行基因组范围的作图的方法。所述方法包括将包含染色质的细胞、细 胞裂解物或核提取物与药物接触。将所述包含染色质的细胞、细胞裂解物或核提取物维持 在所述药物或药物候选物可以与基因组相关的一个或多个因子相互作用的条件下。将所述 包含染色质的细胞、细胞裂解物或核提取物的基因组片段化，由此产生包含基因组片段的 混合物，其中一个或多个基因组片段与一个或多个与药物相互作用的因子相关。测定与药 物或药物候选物与其相互作用的一个或多个因子相关的一个或多个基因组片段的全部或 部分的序列，由此对药物或药物候选物与基因组相关的一个或多个因子的相互作用进行基 因组范围的作图。
[0011] 在另一个方面中，本发明涉及鉴别基因组上药物或药物候选物与其相互作用的一 个或多个位点的方法。所述方法包括将包含染色质的细胞、细胞裂解物或核提取物接触药 物或药物候选物，并将所述包含染色质的细胞、细胞裂解物或核提取物维持在所述药物或 药物候选物可以与基因组相关的一个或多个因子相互作用的条件下。将所述包含染色质的 细胞、细胞裂解物或核提取物的基因组片段化，由此产生包含基因组片段的混合物，其中一 个或多个基因组片段与一个或多个与药物相互作用的因子相关。测定与药物或药物候选物 与其相互作用的一个或多个因子相关的一个或多个基因组片段的全部或部分的序列，由此 鉴别基因组上药物或药物候选物与其相互作用的一个或多个位点。
[0012] 在另一个方面中，本发明涉及一种在基因组范围鉴别病症或疾病（例如，综合征） 印记的方法。所述方法包括将包含染色质的细胞、细胞裂解物或核提取物接触用于或可能 潜在用于治疗所述疾病的药物或药物候选物，并将所述包含染色质的细胞、细胞裂解物或 核提取物维持在所述药物或药物候选物可以与基因组相关的一个或多个因子相互作用的 条件下。在一些方面中，所述细胞或其裂解物是获自一个或多个患病个体的细胞或其裂解 物。将所述包含染色质的细胞、细胞裂解物或核提取物的基因组片段化，由此产生包含基因 组片段的混合物，其中一个或多个基因组片段与一个或多个与药物相互作用的因子相关。 测定与所述药物或药物候选物与其相互作用的一个或多个因子相关的一个或多个基因组 片段每一个的全部或部分的序列，由此在基因组范围鉴别所述病症或疾病的印记。
[0013] 还在另一个方面中，本发明涉及一种确定药物或药物候选物是否有效地治疗需要 的个体中的病症（例如，综合征；疾病，如癌症、心脏病等）的方法。所述方法包括将包含个 体的染色体的细胞、细胞裂解物或核提取物接触药物或药物候选物，并将所述包含染色质 的细胞、细胞裂解物或核提取物维持在所述药物或药物候选物可以与基因组相关的一个或 多个因子相互作用的条件下。将所述包含染色质的细胞、细胞裂解物或核提取物的基因组 片段化，由此产生包含基因组片段的混合物，其中一个或多个基因组片段与一个或多个与 药物相互作用的因子相关。测定与药物或药物候选物与其相互作用的一个或多个因子相关 的一个或多个基因组片段的全部或部分的序列，由此获得个体基因组范围的药物相互作用 的印记，其中如果个体基因组范围的药物相互作用的印记与阳性对照的印记相似、基本上 相似或相同，则所述药物或药物候选物将有效地治疗所述个体的病症，和/或如果个体基 因组范围的药物相互作用的印记与阴性对照的印记相似、基本上相似或相同，则所述药物 或药物候选物将不能有效地治疗所述个体中的病症。
[0014] (a)在一个方面中，本公开特征在于一种试剂盒，所述试剂盒包含以下的一个或多 个（例如，以下的每一个）；
[0015] (b)包含染色质的细胞或细胞裂解物或核提取物或者用于制备包含染色质的细胞 裂解物或核提取物的试剂；
[0016] (C)药物或药物候选物，其中所述药物或药物候选物连接可检测标记（如，生物 素）或与固体支持物偶联（例如，直接或间接地）；
[0017] (d)与标记相互作用的因子（例如，其中所述因子连接固体支持物，如珠子）（示例 性因子包括抗体（例如，连接于固体支持物））；
[0018] (e)任选地，用于测序通过试剂盒的说明书的方法鉴别的一个或多个序列的试剂， 例如，引物或寡聚物，如PCR寡聚物；和
[0019] 将所述药物或药物候选物和所述包含染色质的细胞或细胞裂解物或核提取物维 持在所述药物或药物候选物可以与基因组相关的一个或多个因子相互作用的条件下的说 明，并且所述与基因组相关的一个或多个因子与细胞的基因组共价连接；将包含染色质的 细胞或细胞裂解物或核提取物的基因组片段化从而产生包含基因组片段的混合物的说明， 其中一个或多个基因组片段与一个或多个药物或药物候选物与其相互作用的因子相关；和 测定与药物或药物候选物与其相互作用的一个或多个因子相关的一个或多个基因组片段 的序列的全部或一部分，由此在基因组范围将所述药物或药物候选物与基因组相关的一个 或多个因子的相互作用进行作图的说明。
[0020] 附图简述
[0021] 图1是Chem-Seq方法的示意图。
[0022] 图2显示了 JQl-PEG-生物素的合成。
[0023] 图3显示了 JQl-PEG-生物素的差示扫描荧光测定法（DSF)的结果。
[0024] 图4显示了 bio-JQl和接近MYC和MITF基因座的基因组区域的关系的chem-seq 分析。针对DMSO(阴性对照）、bi〇-JQl和Brd4(JQl的蛋白质靶标）的测序阅读片段的富集 显示出在基因组范围的区域处bio-JQl和Brd4的高重叠度，包括在接近MYC (A)和MITF (B) 基因的区域。
[0025] 图5是体内和体外方法的Chem-seq的图示。体内Chem-Seq允许活细胞中药物-基 因组结合的分析。体外Chem-Seq是用于测定非细胞渗透的药物或化学实体的基因组结合 位点的可选Chem-Seq方法。
[0026] 图6显示了癌细胞中bio-JQl和基因组区域的关系的Chem-Seq体内分析。体内 Chem-Seq揭示了活细胞中药物JQl结合的基因组位点。为了比较，显示了 JQl靶标蛋白 BRD4的基因组位置分析（ChIP-Seq)。注意体内JQl结合的位点和BRD4占据的那些之间 的重叠程度。A :染色体1的区域上JQl占据位点的可视化。B :CCNL1基因座的JQl体内 Chem-Seq 分析。
[0027] 图7说明了癌细胞中结合于基因组区域的bio-JQl的Chem-Seq体外分析。体 外Chem-Seq揭示了药物JQl结合的基因组位点（红色）。为了比较，显示了 JQl靶标蛋白 BRD4(黑色）的基因组位置分析（ChIP-Seq)。注意体外JQl结合的位点和BRD4占据的那 些之间的重叠程度。A :染色体1的区域上JQl占据位点的可视化。B :IRF4基因座的JQl 体外Chem-Seq分析，其说明了体外Chem-Seq产生了与体内Chem-Seq相同的结果：JQl革巴 标位点与BRD4-结合的位点重叠。
[0028] 图8显示了用于通过本文中所述的Chem-Seq方法分析的生物素化化合物的实例。
[0029] 图9显示了化合物Bio-JQl (S)的合成。
[0030] 图10.生物素化JQl (bio-JQl)的生化表征。A.使用纯化的BRD4布罗莫结构域 (bromodomain)，BRD4(1)和DMS0、JQ1、bio-JQl和JQlR的差示扫描荧光测定法的结果。 B.生物素化JQl (nio-JQl)的等温滴定量热法的结果和解离常数的测定。
[0031] 图11.基于Chem-Seq和ChIP-Seq数据之间的重叠的特异性分析。A.在丽I. S 细胞中CCND2基因处通过ChIP-Seq的BRD4和通过Chem-Seq的JQl的重复的占