层面交界处，有许多小颗粒物分布， 呈白色条带。去庶糖后，可见浓缩纯化的册N2CIV呈黄白色斑块，如图1。试验共获得4mL 病毒悬液，HAU为1 ;3, 200,分光光度计测得蛋白浓度为1. 65mg/mL;在其它各浓度庶糖层面 也发现流感病毒存在，但HAU均相对较低。
[00測 4、小鼠免疫程序
[0040] 将纯化好的册N2CIV免疫3只雌性8周龄BALB/c小鼠，共免四次（如表1)。首 次免疫使用FCA与纯化的册N2CIVW1 ;1超声乳化，取0. 3血腹腔注射。在第14d和第 28d分别进行加强免疫时，WFICA与纯化的H3N2CIV按1 ; 1混合，免疫剂量和免疫方式与 首免相同。S免结束后尾尖采血，分离血清，用间接化ISA方法测其抗体效价。细胞融合的 前3d对抗体效价最高的小鼠腹腔注射纯化好的H3N2CIV0. 3mL进行第四次免疫，3d后取 小鼠脾脏进行细胞融合。
[00川表1小鼠免疫程序
[0042]
[004引 5、间接化ISA最佳册N2CIV包被浓度的确定
[0044]a.包被；将纯化的册N2CIV按 1 ;100、1 ;200、1 ;400、1 ;800、1 ;1，600 的比例用包 被液稀释后包被96孔酶标板，100yL/孔。W包被液作空白对照，4°C过夜解育后，弃包被 液，PBST洗漆 5 次（200yL/ 孔，2min/ 次）。
[0045]b.封闭；用含0. 5%PVA的封闭液，200yL/孔，37°C封闭比后，弃封闭液，PBST 洗漆 3 次（200yL/ 孔，2min/ 次）。
[0046] C.加样；BALB/c小鼠阳性血清作一抗，WPBST按 1 ;200、1 ;400、1 ;800、1 ;1，600、 1 ;3,200、1 ;6, 400的比例系列梯度稀释；小鼠阴性血清W相同比例稀释，作为阴性对照， 100yL/孔，37°C解育比后，弃一抗，PBST洗漆5次（200yL/孔，2min/次）。
[0047]d.解育二抗；力日 1 ;10, 000 稀释的Goatanti-MouseIgG化&U-HRP二抗，100yL/ 孔，37°C解育，进行ELISA方阵试验。比后，弃二抗，PBST洗漆5次（200yL/孔，2min/次）。 [004引e.显色；加入TMB底物显色液，100yL/孔，37°C避光显色15min。
[004引f.加终止液；加入2M恥0游止显色反应，100yL/孔。
[0050]g.测0D值；迅速用提前30min预热的酶标仪进行双波长检测，参考波长设定为 630皿，测定ODasoJ直。
[005。 间接化ISA试验结果的判断标准；（1)抗原最适包被浓度的确定；阴性对照的A值 在0.2左右，阳性孔的A值在1.0左右，且P/N值最大。P/N=(阳性值一空白值）/(阴性 值一空白值）。
[005引 似待检样品阴阳性的确定；待检样本P/N> 2. 1为阳性，反之为阴性。
[0053] (3)待检样品化ISA效价的确定；待检样品按不同方式梯度稀释后，测定各孔的0D 值，WP/N> 2. 1时的最大稀释度，即仍出现阳性反应的最大稀释度作为待检样品化ISA效 价。
[0054] 实验结果；根据方阵试验所得结果确定，册N2CIV最适包被浓度为8. 25yg/ mL(200倍稀释）（表2)。W此浓度H3N2CIV包被酶标板，测定3免后7d小鼠血清抗体效 价。将采集的小鼠血清从1 ;5, 000倍比稀释至1 ;320, 000,测得效价均在1 ;80, 000W上， 抗体水平达到融合需要（表3)。
[00巧]表2册N2CIV纯化后化ISA最适包被浓度测定结果
[0056]
[0060] 6、杂交瘤制备
[006。a.饲养细胞的制备；本实验WBALB/c小鼠腹腔巨瞻细胞作为饲养层细胞，于细胞 融合前Id将其均匀铺在96孔细胞板中。饲养细胞的制备过程如下；
[0062]S1.取一只8周龄的雌性BABL/c小鼠，摘眼球采血收集至1. 5血EP管内，分离到 的血清作杂交瘤细胞筛选时的阴性对照，-20°C备用。小鼠处死后于75%酒精中浸泡5min;
[0063]S2.无菌条件下剪开小鼠腹部皮肤，充分暴露，但不要破坏腹膜。吸取8mLHAT选 择性培养液注入腹腔。反复吸打十余次，完毕后将含有腹腔巨瞻细胞的培养基转移至无菌 细胞培养皿中。先取少量在显微镜下计数细胞个数，然后在培养皿中补加HAT培养液混匀， 调整细胞浓度为1〇5个/mL;将含饲养细胞的HAT培养液混匀后加至96孔细胞培养板中，每 孔lOOuL。之后，于37°C、5%C02细胞培养箱中培养。2化后，观察细胞状态，细胞应无污 染，呈多形性，折光性好且贴壁紧密。
[0064]b.小鼠免疫脾细胞的制备
[0065] 本次实验中，为提高融合细胞数量和防止单只小鼠脾细胞数量不足，取1号和3号 (表3)小鼠脾细胞混在一起使用，小鼠脾细胞制备为常规方法。
[006引C.细胞融合
[0067]S1.分别取出准备好的SP2/0骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞，悬浮混匀，按细胞个数1 ; 10的比例吸取两种细胞于50ml离屯、管中。混匀后，1，0(K)r/min离屯、10min,弃上清。用手 指轻轻拍打管底，将沉淀细胞弹成泥浆状。在W下各步试验中应保持离屯、管置于含37°C灭 菌dd&O的烧杯中。
[0068]S2.吸取37°C预热的1ml50%阳G-1000细胞融合剂，在Imin内加至细胞泥浆， 静止Imin。接下来开始滴加DMEM基础培养基W终止融合，在第一个Imin内加ImU第二个 Imin内加2血，第S个Imin内加3血，第四个Imin内加4血，第五个Imin内加5血。在进行 该步操作时要均匀缓慢滴加培养基和轻轻晃动离屯、管。最后用DMEM基础培养基缓慢补加 至40血。轻轻混匀后，1，OOOr/min离屯、lOmin，弃上清。缓慢加入HAT选择性培养液并轻轻 摇匀；将融合后的细胞加到已铺好饲养细胞的96孔板中，每孔100y以于37°C、5%C〇2细 胞培养箱中培养。使用HAT培养液每3d半量换液一次。待培养孔中出现细胞集落且长至 孔底面积约20 %~30 %时，及时采集该些孔的上清液，鉴定是否有特异性抗体产生。第lOd W后，采用HT培养液半量换液。第17dW后采用完全DMEM培养基培养细胞。
[0069]S3.阳性杂交瘤细胞株的亚克隆
[0070] 在融合细胞集落长到孔底面积20 %~30 %时，采用间接化ISA方法对有融合细胞 生长的细胞培养上清液及时鉴定，W确定其中是否存在针对H3N2CIV的特异性抗体。方法 同上述步骤5。不同之处为，一抗采用融合细胞培养上清液。试验中同时取骨髓瘤细胞培养 上清液、免疫小鼠阳性血清及正常小鼠血清做对照，阳性孔需及时进行下一步的亚克隆和 扩大培养。
[0071] 在阳性孔细胞亚克隆化前一天，使用完全DMEM培养基在96孔板内制备好饲养层 细胞，1〇4个/100化/孔。用完全DMEM培养基将待亚克隆的细胞从培养板轻轻冲下，计算 细胞数。采用有限稀释法将细胞逐步均匀稀释至10个/mU加至含饲养细胞的96孔培养板 中，100uL/孔。每天观察细胞状态，第4d时，用完全培养基半量换液。待杂交瘤细胞长至 孔底面积20%~30%时，用间接ELISA法再次检测上清。从中选取仅单个细胞集落生长且 阳性值较高孔进行第二次亚克隆。之后如此重复，直至所有克隆细胞孔都为阳性。获得稳 定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株后，先用24孔细胞板，再用6孔细胞板及时逐步扩大培 养并冻存（-8〇°C冰箱中梯度过夜降温后，转移至液氮罐内，长期保存备用）。
[0072] 实验结果：将融合后的细胞分装于4块96孔细胞培养板中，经HAT培养液的选择 性培养，细胞于融合后前2d有大量死亡，从第5d开始出现杂交瘤细胞，如图2。待其长至孔 底面积约20%~30%时，取培养上清液进行化ISA检测，结果见表4至表8。
[0073] 表4细胞融合后第lidELISA检测结果（第1板）
[0074]
[0084] 注；小鼠阳性血清均提前稀释40, 000倍。
[0085] 根据表4至表8的数据并结合显微镜观察，对11株阳性孔杂交瘤细胞进行第一次 亚克隆。其中，仅2C5(第2板的巧孔）第一次亚克隆后有阳性孔，其它株未筛出阳性。对 2巧使用有限稀释法连续进行第二次和第=次亚克隆，阳性率均为100%。=次亚克隆的检 测结果见表9。
[0086] 表9 2巧的亚克隆检测结果
[0087]
[008引注；各次亚克隆中，小鼠阳性血清均提前稀释20, 000倍。其中，E1为小鼠阳性血 清对照，E2为小鼠阴性血清对照，F1为SP2/0细胞上清对照，巧为空白对照。
[0090] 将2巧进行保藏，该细胞株于2015年5月13日保藏在中国典型培养物保藏中屯、， 将该杂交瘤细胞株命名为；册N2-CIV-HA-2C5,保藏编号为CCTCCC201555。
[0091] 实施例2单克隆抗体的制备
[009引雌性BALB/c小鼠腹腔内注射FICA，0. 5血/只。7d后用灭菌生理盐水洗漆悬浮对 数期生长的杂交瘤细胞2C5(取对数生长期细胞培养液上清，测定McAb效价），细胞密度调 至2 X 106个/血。每只小鼠腹腔注射0. 5血细胞悬液，逐日观察小鼠腹部是否膨大，待其明 显鼓起时抽取腹水，置于邸TA处理过的抗凝管中，5, OOOr/min，离屯、lOmin，除去细胞沉淀。 将收集到的上清于56°C灭活30min，10, OOOr/min，离屯、15min，然后进行纯化。在抽取小鼠 腹水前