体液中细胞成分的解离的制作方法
【专利说明】体液中细胞成分的解离
[0001] 本申请是申请日为2009年7月23日、发明名称为"体液中细胞成分的解离"的发 明专利申请No. 200980129078. 0的分案申请。 【技术领域】
[0002] 本发明指通过在提供细胞成分的基本上定量解离而基本上无流体成分的沉积，沉 淀，变性，凝集及胶凝发生的条件下快速冷冻/解冻处理来处理包括细胞成分的生物流体 的方法及装置。方法对于制备用于分析物检测的生物样品特别有用。 【【背景技术】】
[0003] 已在各种研究中研究血细胞的冷冻及溶血效应。Scheiwe等人 (Cry〇bi 〇l〇gyl9, 1982, p. 461-477)研究了以不同线性冷却速度用或不用冷冻保护剂羟乙 基淀粉（HES)降至-196°C的小的玻璃毛细管中分离的及浓缩的红细胞的悬浮液的冷冻。从 作为冷却速度的函数的溶血的U-形曲线得出，对于例如0. 6的血细胞比容（Hct)，及在缺乏 HES的情况下，必需用大致100°C /分钟的冷却速度处理细胞悬浮液，以便实现100%溶血。 具有更低的分别〇. 4和0. 2的Hct的红细胞悬浮液，在这些条件下产生80~90 %溶血。在 HES的存在下可实现50~60%的溶血率。大致5000°C /分钟的冷却速度显示大致40 %溶 血。
[0004] Rapatz及Luyet以保存人红细胞的方式研究了冷冻温度，冷冻速度或保护 试剂（例如冷冻保护剂）对全血样品的效应（Cryobiology 4, 1968, PP. 215-222)。 相应实验已在具有I. 5+/-0. 5mm外径及0· 3+/-0. 5mm的壁厚度的玻璃毛细管中进 行。在另一出版物中，作者研究了血的快速冷冻后几种动物物种中的溶血（J. Cell. Physiol. 77, 1970, pp. 373-376)。对红细胞溶血的新近结果也在综述〃A review on basic researches on the cryopreservation of red blood cells〃中总结（Luyet and Rapatz，Cryobiology 6, 1970, pp. 425-482)。
[0005] 但是，无出版物应对全血样品的冷冻给出线索，有关如何获得来自包括细胞成分 的生物样品的经处理的流体，从而将含于生物样品的基本上全部细胞成分定量解离，然而 基本上无流体成分的沉积，沉淀，变性，凝集及胶凝发生。也无在分析中使用经处理的全血 的导向。
[0006] 在来自生物流体的样品中的分析物的测定常要求复杂的及繁琐的预处理过程，以 便去除来自流体样品的细胞成分。别的细胞成分或沉积物将阻塞样品注射装置，毛细管，分 离柱等。例如，全血含成分，即红细胞，白细胞及血小板。为测定血样品中的分析物，这些细 胞成分常必需通过预处理过程（例如离心，过滤或沉积）除去。
[0007] 关于代表主要血级分的红细胞，样品预处理涉及使用（生物）化学试剂，渗透压休 克（即通过低-或高渗溶液）和/或机械处理溶血。但是，溶血产生由血浆及所谓的源于 红细胞的血影组成的裂解产物。这些血影耗尽了血红蛋白及仍具有天然的红细胞的尺寸。 这意味着，也必需在分析之前通过离心，过滤或沉积除去血影。
[0008] 但是，这些过程常难以整合进自动化的测试形式。尤其是在靶分析物存在于细胞 成分的胞质溶胶或膜的情况中，例如红细胞中的免疫-抑制药物。此情况中，将细胞成分在 添加裂解试剂之前通过离心和/或过滤分离富含，或通过将变性剂（例如ZnS0 4&乙腈的 混合物）添加到原样品来将它们变性，然后离心。
[0009] 刚刚提议用于处理用于分析物测定的生物流体的新方法。此方法基于热处理，及 适宜于自动化的过程（W0 2008/003451)。但是，此方法强烈依赖于小的温度范围的温度，从 而需要复杂的温度控制。处理也被〖_，发生凝固的温度限制。此外，添加有机修饰物（例 如甲醇）影响加热处理从而处理参数。而且，非每含于生物流体的分析物在推荐的热处理 期间稳定。因此，如果要测定热不稳定的分析物，此方法不太优选。
[0010] 【发明概述】
[0011] 由此，本发明的课题是提供在以下条件下包括细胞成分的生物流体的新处理方 法：
[0012] (i)提供所述细胞成分的基本上定量解离，
[0013] (ii)不导致流体成分的实质性沉积，沉淀，变性，凝集及胶凝，
[0014] (iii)不局限于小的温度范围，及
[0015] (iv)允许添加其他不影响处理的流体，例如甲醇等。
[0016] 以上问题的解决通过提供权利要求中表征的实施方式来实现。
[0017] 根据本发明的第一方面，提供在以下条件下产生经处理的生物流体的方法：
[0018] (i)提供所述细胞成分的基本上定量解离，及
[0019] (ii)不导致流体成分的实质性沉积，沉淀，变性，凝集及胶凝，
[0020] 包括下列步骤：
[0021] (a)提供包括细胞成分的生物流体，
[0022] (b)冷冻所述生物流体，及
[0023] (c)解冻步骤（b)的冷冻的流体。
[0024] 本发明的再一方面是经处理的生物流体，包括基本上定量解离的细胞成分，其基 本上无沉积，沉淀，变性，凝集及胶凝产物。优选地，生物流体不稀释，即处理期间或之前无 其他流体加入。
[0025] 本发明又一方面是在生物流体样品测定分析物的方法，其中所述生物流体如上所 述处理，及在经处理的生物流体中测定分析物。
[0026] 本发明又一方面是处理包括细胞成分的生物流体的装置，其中所述装置包括：
[0027] (a)流体处理单元，其至少部分可冷冻/可加热，
[0028] (b)冷却元件，其用于冷冻预定部分的流体处理单元，
[0029] (C)加热元件，其用于加热预定部分的流体处理单元，
[0030] (d)任选流体运输元件，例如抽栗元件，
[0031] (e)控制元件，其用于在以下条件下控制流体的冷冻/加热
[0032] (i)提供所述细胞成分的基本上定量解离，及
[0033] (ii)不导致流体成分的实质性沉积，沉淀，变性，凝集及胶凝，
[0034] (f)任选清洁元件，及
[0035] (g)任选样品分析元件。
[0036] 【发明详述】
[0037] 意外地，本发明人发现，可通过在预定时间及温度条件下冷冻/解冻处理来实现 生物样品中细胞成分，优选来自高等生物的细胞或细胞群集，更优选动物细胞（例如哺乳 动物细胞（包括人细胞）），及最优选血细胞（例如红细胞，白细胞和/或血小板）的完全解 离。根据本发明的方法的步骤（b)及（c)的冷冻/解冻处理可进行至少一次，优选两次或 最优选3次或甚至更多次。
[0038] 利用根据本发明的处理，将含于生物流体的细胞成分基本上定量解离，以产生无 流体成分的实质性沉积，沉淀，变性，凝集和/或胶凝的亚细胞粒子。由此，本发明的经处理 的生物流体包括亚细胞粒子，以及包括离子，气体，低分子物质（如糖，及蛋白）的液体成 分。
[0039] 本发明利用的〃生物流体〃涉及包括细胞成分及液体成分的生物悬浮液，及其选 自体液或细胞培养液。细胞成分是细胞，细胞群集或细胞影，液体成分是血浆，尿，唾液等或 细胞培养基。体液的特定实施例是全血，尿，脑脊液，唾液，淋巴液，及细胞培养液的特定实 施例是哺乳动物细胞培养液。
[0040] 本发明中使用的〃细胞成分〃涉及细胞，细胞群集或细胞影，特别是红细胞影。
[0041] 在本发明中，含于经处理的生物流体的〃亚细胞粒子〃涉及细胞碎片（例如通过 本发明的方法产生及由重封的膜的非常小的球和/或非常小的粒子构成的膜囊泡），其特 征在于，它们
[0042] (a)静置状态下，在至少约24小时的时间内不沉淀，及
[0043] (b)不像红细胞影（约5~8 μπι尺寸）或完整的细胞，在以约3000g重力离心至 少10分钟的时间后不沉淀，及
[0044] (c)在以高于约IlOOOg重力离心至少20分钟的时间后沉淀。
[0045] 含于生物样品流体的〃细胞成分的基本上定量解离