成I X 106个/ml的细胞悬 液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37°C水浴中速融，离心去除冻存液后， 移入培养瓶内培养。
[0030] 单克隆抗体的生产与纯化：将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0. 5ml/只，7天后 腹腔注射稳定的单克隆杂交瘤细胞株5 X 105个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸 钱法进彳丁腹水纯化，_20°C保存。
[0031] (3)细胞冻存和复苏 将杂交瘤细胞用冻存液制成IX 106个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取 出冻存管，立即放入37°C水浴中速融，尚心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
[0032] (4)单克隆抗体的制备与纯化 增量培养法：将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37°C条件下进行培养，用辛酸-饱和 硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，_20°C保存。
[0033] 所述细胞培养基为向RPMI1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清 在细胞培养基中的终浓度为20% (质量百分含量)，使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为 0. 2% (质量百分含量）；所述细胞培养基的pH为7. 4。
[0034] 5、羊抗鼠抗抗体的制备 以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。
[0035] 6、单克隆抗体-胶体金标记物的制备 (1)胶体金的制备 用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释成0. 01% (质量百分含量)，取100mL置于锥形瓶中， 用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入2. 5ml 1%柠檬酸三钠，继续 匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4°C保 存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。
[0036] (2)金标抗体的制备 在磁力搅拌下，用〇. 2mol/L碳酸钾溶液调胶体金的pH值至7. 0,按每毫升胶体金溶液 中加入20-50 μ g抗体的标准向胶体金溶液中加入甲霜灵抗体，继续搅拌混勾30min，加入 10%BSA，使其在胶体金溶液中的终浓度为1%(体积百分含量)，静置lOmin。12000r/min、4°C 离心40min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶 缓冲液将沉淀重悬，置4°C备用。
[0037] 复溶缓冲液：含牛血清白蛋白（BSA) 0. 1%-0. 3% (体积百分含量)、吐温-80 0. 05%-0. 2% (质量百分含量)、pH 7. 2的0. 02mol/L磷酸盐缓冲液。
[0038] 7、结合物释放垫的制备 将结合物释放垫浸泡于含有牛血清白蛋白（牛血清白蛋白在缓冲液中的浓度为〇. 5%) 和pH 7. 2,0. 5mol/L磷酸盐缓冲液中，均匀浸湿lh，37°C烘3h备用。用百道公司生产 ZXlOOO型喷膜仪，将制备好的甲霜灵单克隆抗体-胶体金标记物均匀包被在结合物释放垫 上，每Icm结合物释放垫包被0.0 lml甲霜灵单克隆抗体-胶体金标记物后，置于37°C环境 中（湿度< 20%) 60min后取出，密封置于干燥环境(湿度< 20%)中保存备用。
[0039] 8、反应膜的制备 将甲霜灵半抗原-牛血清蛋白偶联物包被到反应膜上构成检测线（T线)，将羊抗鼠抗 抗体包被在反应膜上构成质控线（C线)。
[0040] 包被过程：用磷酸缓冲液将甲霜灵半抗原-牛血清蛋白偶联物稀释到l〇mg/ml， 用百道公司生产ZXlOOO型点膜仪，将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线（T线)，包被量为 1. O μ g/cm2;用0· 01mol/L、pH7. 4的磷酸盐缓冲液将兔抗羊抗抗体稀释到200 μ g/ml，用点 膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线（C线)，包被量为1.0 μ g/cm2。将包被好的反应 膜置于37°C条件下干燥2h，备用。
[0041] 9、样品吸收垫的制备 将样品吸收垫置于含〇. 5%牛血清白蛋白（体积百分含量)、PH7. 2 0. lmol/L磷酸盐缓 冲液中浸泡2h，37°C烘2h备用。
[0042] 10、试纸的组装 将样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次按顺序粘贴在PVC底板上；结合物 释放垫从起始端有1/3区域被样品吸收垫覆盖，结合物释放垫的末端与反应膜的始端连 接，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与PVC底板的始端对齐，吸水垫 的末端与PVC底板的末端对齐；所述反应膜上有检测线和质控线，检测线（T线)和质控线（C 线)均为与所述试纸的长相垂直的条状带；检测线位于靠近结合物释放垫的末端的一侧；质 控线位于远离结合物释放垫的末端的一侧；将试纸用机器切成3_宽的小条，装在特制的 塑料制卡中，形成试纸卡，4-30°C条件下可保存12个月。
[0043] 实施例2样品中甲霜灵残留的检测 1、样品的前处理 取I. 0g±0. 05g均质样本至50ml聚苯乙稀离心管中，加入5ml提取液，用振荡器振荡 5min，3000g室温离心5min，取上清待测。
[0044] 2、用试纸进行检测 用吸管吸取待检样品溶液垂直滴加2-3滴于加样孔，液体流动时开始计时，反应5min， 判定结果，其他时间判定无效。
[0045] 3、分析检测结果 阴性（-):T线和C线都显色，表示样品中甲霜灵药物浓度低于检测限，如图3。
[0046] 阳性（ + ):Τ线无显色C线显色，表示样品中甲霜灵药物浓度等于或高于检测限，如 图3。
[0047] 无效：未出现C线，表明不正确的操作过程或试纸已变质失效，如图3。在此情况 下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试纸卡重新测试。
[0048] 实施例3样品检测实例 1、检测限试验 取空白烟草样本，在其中分别添加甲霜灵至终浓度为l、2、4mg/kg，取试纸进行检测，每 个样本重复测定三次。
[0049] 用试纸检测烟草、茶叶、蔬菜样本时，当其中甲霜灵添加浓度为lmg/kg时，试纸上 显示出肉眼可见的两条红色线条，成阴性；当其中甲霜灵添加浓度为2、4mg/kg时，试纸质 控线显示，但检测线不显示，成阳性；表明本试纸对甲霜灵的检测线为2mg/kg。
[0050] 2、假阳性率、假阴性率试验 取已知甲霜灵含量大于2mg/kg的烟草阳性样本20份和含量小于2mg/kg烟草阴性样 本20份，用三批试纸进行检测，计算其阴阳性率。结果见表1、表2。
[0051] 表1检测阳性样本结果
表2检测阴性样本结果
结果表明：用3个批次生产的试纸检测阳性样本时，结果全为阳性，可知阳性样本符合 率为100%，假阴性率为〇 ;检测20份阴性样本时，有一批次出现一个假阳性检测结果，可知 阴性符合率为98%，假阳性率小于5%。说明本发明的检测甲霜灵残留的试纸可以对烟草中 甲霜灵残留进行快速检测。
[0052] 3、特异性试验 特异性常用交叉反应率表示，是指抗体与结构不同的抗原决定簇发生结合的能力。将 常检的多菌灵、三唑醇、菊酯类药物500 μ g/L的样品，用甲霜灵胶体金试纸进行检测。结 果显示，用该试纸检测多菌灵、三唑醇、菊酯类药物500 μ g/L时，试纸质控线和检测线均显 色，呈现阴性，说明本试纸对这些药物无交叉反应。
【主权项】
1. 一种检测甲霜灵的试纸，包括样品吸收垫（1)、结合物释放垫（2)、反应膜（3)、吸水 垫（4)和底板（7)，其特征在于所述反应膜上具有包被有甲霜灵半抗原-载体蛋白偶联物的 检测线（5)和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线（6)，所述结合物释放垫（2)包被有甲霜灵单克 隆-胶体金标记物。2. 如权利要求1所述的试纸，其特征在于所述样品吸收垫（1)、结合物释放垫（2)、反应 膜（3 )、吸水垫（4 )依次粘贴在底板（7 )上。3. 如权利要求1-2任一项所述的试纸，其特征在于所述结合物释放垫（2)叠放于结合 物释放垫（3)上，并且结合物释放垫1/3-1/2被覆盖于样品吸收垫下。4. 如权利要求1所述的试纸，其特征在于所述甲霜灵半抗原-载体蛋白偶联物由甲 霜灵药物半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋 白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。5. 如权利要求1或4任一项所述的试纸，其特征在于所述甲霜灵半抗原是由甲霜灵水 解反应得到，其分子结构式为：6. 如权利要求1所述的试纸，其特征在于所述甲霜灵单克隆抗体是以甲霜灵半抗 原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，所述羊抗鼠抗抗体是将鼠源抗体免疫羊得到 的。7. -种制备权利要求1-6任一项所述试纸的方法，其包括步骤： 1) 制备包被有甲霜灵单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫（2); 2) 制备具有包被有甲霜灵半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体 的质控线的反应膜； 3) 将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和PVC底板组装成 试纸。
【专利摘要】本发明公开了一种检测甲霜灵试纸及应用。试纸包括样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)和底板(7)，所述反应膜上具有包被有甲霜灵半抗原-载体蛋白偶联物的检测线(5)和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线(6)，所述结合物释放垫(2)包被有甲霜灵单克隆抗体-胶体金标记物。本发明还提供了一种应用上述甲霜灵试纸检测茶叶、烟草和蔬菜中甲霜灵残留的方法。本发明所提供的试纸可用于检测茶叶、烟草和蔬菜中甲霜灵的残留，具有操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低等特点，适合大量样本的筛查和现场监控。
【IPC分类】G01N33/577, G01N33/558
【公开号】CN105259351
【申请号】CN201510530296
【发明人】冯才伟, 谢体波, 陆苇, 何方洋, 汪善良, 易重任, 李平
【申请人】贵州勤邦食品安全科学技术有限公司
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年8月26日