立不同来源的空白基质，按照上述样品预处理获得含基质 的上清液，加入一定量的标准品溶液，进样测定的结果与化学品标准品溶液的结果比较，结 果未发现基质效应对STS测定有干扰；
[0046] (4)常见合并用药：阿司匹林、氯吡格雷、卡托普利、福辛普利、缬沙坦、氯沙坦、美 托洛尔、比索洛尔、氨氯地平、硝苯地平、阿托伐他汀钙、瑞舒伐他汀，二甲双胍、格列苯脲、 格列吡嗪、阿卡波糖、瑞格列奈、头孢唑啉、头孢呋辛钠、地西泮等对测定没有干扰；STS和 内标的典型色谱保留时间分别为1. 47、I. 17min，整个色谱分析过程时间为3min ;
[0047] 线性试验
[0048] 精密称取STS标准物质适量，用甲醇溶解，稀释成系列工作液，再加入适量空白人 血浆，配制成含STS血浆浓度分别为2,4, 20,100,400,800和1000ng/mL的标准血样，取血 浆0. lmL，按"血浆样品预处理"方法操作，内标法以待测组分与内标的峰面积比㈧和待测 组分浓度（C)作加权（1/C2)线性回归，线性范围均为2~1000ng/mL，最低定量限为2ng/ mL，STS的标准曲线回归方程分别为：A = 0. 00648C+0. 000433, r = 0. 9977 ;
[0049] 准确度和精密度
[0050] 精密称取STS标准物质适量，甲醇溶解并稀释成系列工作液，再加入适量空白人 血浆，配制成含STS血浆浓度分别为6, 200和750ng/mL的系列血样，各取血浆0. lmL，按 "血浆样品预处理"方法操作，考察日内和日间的精密度和准确度；根据线性回归方程计算 其实测浓度，计算每种浓度的实测平均值、偏差和相对标准差（RSD)，其中（C $iM -Ciaife)/Cia 论X 100%为偏差；表1显示了 STS的日内、日间精密度和准确度，结果表明STS的日内和日 间精密度均小于10 %，相对偏差小于10% ;
[0051 ] 表1实施例1中STS的日内、日间精密度和准确度
[0053] 本发明中进行了健康受试者血浆中STS的测定，图3为健康受试者的典型分析色 谱图，STS浓度为198. 3ng/mL。
[0054] 实施例2
[0055] 色谱条件
[0056] 日本岛津UFLC系统：SIL-30AC自动进样器（1台），LC-30AD输液栗（2台）， D⑶-20A5R在线脱气仪（1台），CBM-20A控制器（1台），CT0-30A柱温箱（1台），美国AB Sciex公司数据采集与处理软件：Analyst 1.6. 1。美国Waters公司XSELECTTM HSS T3， 2. I X 100謹，3. 5 μ m，柱温：室温。流动相：含0· 40mmol/L甲酸铵和16ppm甲酸水溶液：乙 腈（45 : 55, V/V);流速 0· 3mL · min S
[0057] 质谱条件：
[0058] 美国AB Sciex公司Triple Quad? 5500串联质谱仪，质谱电离方式：电喷雾离子 源，离子源参数：GS1 :60psi ;GS2 :60psi ;气帘气：25psi ;喷雾电压：-4500V ;毛细管温度： 550°C;碰撞气：氮气，扫描方式：多反应离子检测扫描（MRM) ;STS和DHEAS-D5的碰撞能量： 50± IOeV ;离子通道选择：STS :373. 3 - 357. lamu，DHEAS-D5 :373. 0 - 97. 8amu ;扫描间隔： 5ms ；
[0059] 血浆样品预处理
[0060] 取0.1 mL血样于离心管中，加入10 μ L内标工作液、5 μ L-定浓度的甲酸水溶液和 200 μ L甲醇、乙腈的混合物沉淀蛋白，混旋10s，15000rpm离心10min，吸取上清液10 μ L，加 50 μ L含0. 1 %甲酸的50%甲醇水溶液，混匀，待测；内标法以峰面积定量，血浆样品处理在 无紫外线黄光安全灯（去除420nm以下波长的光线）条件下进行；
[0061] 专属性
[0062] (1)内源性物质的干扰：取不同来源的8名未使用STS的受试者的空白血浆（其 中含一份空白溶血血浆和一份空白高脂血浆），按照上述样品预处理和测定方法进行测定， 结果未发现血浆内源性物质对STS和内标有干扰；
[0063] (2)内标对STS的干扰：方法验证的每个含标准曲线的批次都需用空白基质配制2 份只含有内标化合物而不含STS的样品，按上述方法处理分析，未发现内标化合物对STS测 定有干扰；
[0064] (3)基质效应：取6个独立不同来源的空白基质，按照上述样品预处理获得含基质 的上清液，加入一定量的标准品溶液，进样测定的结果与化学品标准品溶液的结果比较，未 发现基质效应对STS测定有干扰；
[0065] (4)常见合并用药：阿司匹林、氯吡格雷、卡托普利、福辛普利、缬沙坦、氯沙坦、美 托洛尔、比索洛尔、氨氯地平、硝苯地平、阿托伐他汀钙、瑞舒伐他汀，二甲双胍、格列苯脲、 格列吡嗪、阿卡波糖、瑞格列奈、头孢唑啉、头孢呋辛钠、地西泮等对测定没有干扰，STS和内 标的典型色谱保留时间分别为I. 58、1. 24min，整个色谱分析过程时间为3min ;
[0066] 线性试验
[0067] 精密称取STS标准物质适量，用甲醇溶解，稀释成系列工作液，再加入适量空白人 血浆，配制成含STS血浆浓度分别为2,4, 20,100,400,800和1000ng/mL的标准血样；取血 浆0. lmL，按"血浆样品预处理"方法操作；内标法以待测组分与内标的峰面积比（A)和待测 组分浓度（C)作加权（1/C2)线性回归，线性范围均为2~1000ng/mL，最低定量限为2ng/ mL，STS的标准曲线回归方程分别为：A = 0· 00705C+0. 0007, r = 0· 9988 ;
[0068] 准确度和精密度
[0069] 精密称取STS标准物质适量，甲醇溶解并稀释成系列工作液，再加入适量空白人 血浆，配制成含STS血浆浓度分别为6, 200和750ng/mL的系列血样，各取血浆0. lmL，按 "血浆样品预处理"方法操作，考察日内和日间的精密度和准确度，根据线性回归方程计算 其实测浓度，计算每种浓度的实测平均值、偏差和相对标准差（RSD)，其中（C $iM -Ciaife)/Cia 论X 100%为偏差；表2显示了 STS的日内、日间精密度和准确度，结果表明STS的日内和日 间精密度均小于10%，相对偏差小于10%。
[0070] 本发明中进行了患者血浆中STS的测定，图4为某患者的分析色谱图，STS浓度为 358.3ng/mL。
[0071] 表2实施例2中STS的日内、日间精密度和准确度
【主权项】
1. 一种测定人血浆中丹参酮IIA磺酸钠浓度的方法，其特征在于，待测样品经预处理 后，在酸性流动相下，经色谱柱分离，用串联质谱检测，包括以下步骤： 1) 样品预处理 取待测样品于离心管中，加入内标工作液、经甲酸酸化后加入定量的有机溶媒沉淀蛋 白，混旋，15000rpm离心后，吸取上清液，加含0. 1 %甲酸的50%甲醇水溶液，混匀，4°C待 测； 2) 样品分离 采用通用型的液相色谱柱，其填料为高强度硅胶颗粒C18,高效液相系统采用通用型高 压栗和进样器，采用甲酸铵缓冲盐溶液和乙腈的混合液作为流动相，等度洗脱；等度洗脱模 式为甲酸铵缓冲盐溶液：乙腈为60±10 : 40±10，V/V; 3) 样品检测 采用通用型串联质谱检测器检测丹参酮IIA磺酸钠和内标的峰面积； 质谱电离方式：电喷雾离子源；极性：负离子检测；扫描方式：多反应离子检测扫描 (MRM);离子通道选择：STS:373. 3 - 357.lamu，DHEAS-D5 :373. 0 - 97. 8amu;碰撞气：氮 气； 4) 浓度计算 采用串联质谱法以样品浓度为X轴，STS峰面积（As)和内标峰面积（Ai)的比值为Y轴，进行加权回归分析，采用标准曲线法获得未知血样的浓度值（在标准曲线范围内）。2. 根据权利要求1所述的测定人血浆中丹参酮IIA磺酸钠药物浓度的方法，其特征在 于，所述的步骤1)中，采用氘5-脱去氢表雄酮硫酸钠盐（DHEAS-D5)所述的为内标。3. 根据权利要求1所述的测定人血浆中丹参酮IIA磺酸钠药物浓度的方法，其特征在 于，所述的步骤1)中，采用无紫外线黄光安全灯条件控制STS降解。4. 根据权利要求1所述的测定人血浆中丹参酮IIA磺酸钠药物浓度的方法，其特征在 于，所述的步骤1)中，所述甲酸为蛋白沉淀剂，其溶液浓度为5~15%，所述有机溶媒为甲 醇、乙腈的混合物。5. 根据权利要求1所述的测定人血浆中丹参酮IIA磺酸钠药物浓度的方法，其特征在 于，所述的步骤2)中，所述甲酸铵缓冲盐溶液含0. 3-0. 5mmol/L甲酸铵，10-20ppm甲酸。6. 根据权利要求1所述的测定人血浆中丹参酮IIA磺酸钠药物浓度的方法，其特征在 于，所述的步骤2)中， 仪器参数设定为：扫描间隔：5±lms;离子源参数：GS1 :60±10psi;GS2 :60±10psi; 气帘气：25psi±10 ;喷雾电压：-4500±500V;毛细管温度：550±100°C;STS和DHEAS-D5 的 碰撞能量：50±10eV;运行时间：3±lmin。7. 根据权利要求1所述的测定人血浆中丹参酮IIA磺酸钠药物浓度的方法，其特征在 于，所述的步骤3)的串联质谱法中，采用电喷雾离子源和负离子多反应离子检测扫描，离 子通道373. 3 - 357.lamu检测STS的峰面积，373. 0 - 97. 8amu检测DHEAS-D5的峰面积， 用标准曲线方程换算成浓度。8. 根据权利要求7所述的测定人血浆中丹参酮IIA磺酸钠药物浓度的方法，其特征在 于，所述的步骤3)中，以样品浓度为X轴，STS峰面积（As)和内标峰面积（Ai)的比值为Y 轴，进行加权回归分析，获得的未知血样的浓度值在标准曲线范围内。
【专利摘要】本发明属医学检验领域，涉及体内药物的分析测定方法，具体涉及一种可测定人血浆中丹参酮IIA磺酸钠浓度的方法。本方法采用氘5-脱去氢表雄酮硫酸钠盐(DHEAS-D5)为内标，在血样品处理过程中采用无紫外线黄光安全灯(去除420nm以下波长的光线)条件控制STS降解，保证方法的准确度；采用甲酸酸化血样后加入定量的有机溶媒甲醇和乙腈混合液沉淀蛋白，采用串联质谱法测定丹参酮IIA磺酸钠和内标的浓度，定量线性范围为2-1000ng/mL，能满足人体药代动力学研究的要求；本方法样品取样少，预处理简单、快速、灵敏，仅需通用型的设备和试剂，分析周期短，成本低，适合于丹参酮IIA磺酸临床常规血药浓度的监测。
【IPC分类】G01N30/88
【公开号】CN105301155
【申请号】CN201510467646
【发明人】王斌, 覃韦苇, 王俐, 焦正, 钟明康, 施孝金, 李中东
【申请人】复旦大学附属华山医院
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年7月31日