45% A - 49% A ;105~125min， 49% A - 49% A);检测波长：220nm ;柱温：30°C;流速：0. 75mL/min ;进样量：5 μ 1。昆明山 海棠对照品及样品色谱图见图1。
[0064] 实施例2制备样品条件的考察
[0065] 1.提取条件中离子液体种类的考察
[0066] 取7份昆明山海棠粉末（过三号筛）各0· 5g，精密称定，分别加入0· 6mol·L1[15] 的6种离子液体{ 1- 丁基-3-甲基咪唑溴盐（[BMIm]Br)，1- 丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸 盐（[BMIm]BF4)，l-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（[BMIm]PF6)，l-己基-3-甲基咪唑四 氟硼酸盐（[HMIm]BF4)，l-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐（[HMIm]PF6)，l-辛基-3-甲基 咪唑四氟硼酸盐（[0MIm]BF4) }的甲醇溶液及纯甲醇溶剂各2mL，超声提取30min，离心 5min(12000r·min^，微孔滤膜滤过，注入高效液相色谱仪，记录峰面积，计算各成分的提 取率，考察离子液体对昆明山海棠粉末超声微萃取效率，选择能有效提取昆明山海棠中雷 公藤晋碱、雷公藤碱庚、雷酚内酯、雷公藤次碱和雷公藤醌A的离子液体。结果见图2-6。
[0067] 由图2-6可知，6种离子液体中萃取雷公藤晋碱、雷公藤碱庚、雷酚内酯、雷公藤次 碱和雷公藤醌A时[BMIm]PF6的提取率均为最高，为0. 047%、0. 005%、0. 003%、0. 018%和 0.086%，因此选择[BMIm]PF6里萃取昆明山海棠中雷公藤晋碱、雷公藤碱庚、雷酚内酯、雷 公藤次碱和雷公藤醌A。
[0068] 2.离子液体的浓度考察
[0069] 取6份昆明山海棠粉末（过三号筛）各0.5g，精密称定，分别加入0.2,0.4,0.6， 0· 8,1.Omol.L1 的[BMIm]PF6甲醇溶液各 2mL，超声提取 30min，离心 5min(12000r.min3， 微孔滤膜滤过，注入高效液相色谱仪，记录峰面积，计算各成分的提取率，考察[BMIm]卩匕离 子液体的浓度对5种成分提取率的影响。结果见图7。
[0070] 由图7可知，[BMInJPF#醇溶液浓度为0. 6mol·L1时雷公藤晋碱、雷公藤碱庚、 雷酚内酯、雷公藤次碱和雷公藤醌A的提取率都显著高于其它浓度，因此选择[810!11]?&甲 醇溶液离子液体的浓度为〇. 6mol·L、
[0071] 3.固液比的考察
[0072] 取3份昆明山海棠粉末（过三号筛）适量，精密称定，精密加入0.6mol·L1的 [BMInJPF#醇溶液，分别配制成固液比l:4、l:10、l:20(g*mL3的样品，超声提取30min， 离心5min(12000r·min》，微孔滤膜滤过，注入高效液相色谱仪，记录峰面积，计算各成分 的提取率，考察不同的固液比对5种成分的提取率的影响，结果见图8。
[0073] 由图8可知，固液比为1:4和1:10时，雷酚内酯和雷公藤碱庚的提取率相差不大， 溶剂比例大时略有下降，但雷公藤晋碱、雷公藤次碱和雷公藤醌A的提取率都有不同程度 的提高，综合5个成分的提取率，选择提取昆明山海棠固液比为1:10。
[0074] 4.分散剂的考察
[0075] 分别考察了甲醇、无水乙醇、乙腈、乙酸乙酯4种分散剂对昆明山海棠中5种 成分的提取率。取4份昆明山海棠粉末（过三号筛）各O.lg，精密称定，分别加入 0. 6mo1 ·L1的[BMIm]PF6甲醇、无水乙醇、乙腈、乙酸乙酯溶液各lmL，超声提取30min，离心 5min(12000r·min^，微孔滤膜滤过，注入高效液相色谱仪，记录峰面积，计算各成分的提 取率。结果见图9-13。
[0076] 由图9-13可知，无水乙醇为分散剂时，雷公藤晋碱、雷公藤碱庚和雷公藤次碱的 提取率均远远高于甲醇、乙腈和乙酸乙酯。甲醇为分散剂时，雷酚内酯和雷公藤醌A的提取 率远远高于无水乙醇、乙腈和乙酸乙酯。因此测定雷公藤晋碱、雷公藤碱庚和雷公藤次碱时 选择无水乙醇为分散剂；测定雷酚内酯和雷公藤醌A时选择甲醇为分散剂。
[0077] 5.提取方式的考察
[0078] 取4份昆明山海棠粉末（过三号筛）适量，精密称定，其中2份精密加入 0. 6mol.LiBMInJPFe(分散剂甲醇、无水乙醇）溶液超声30min，2份0. 6mol.L1精密加入 [BMIm]PF6(分散剂用甲醇、无水乙醇）溶液回流30min，离心5min(12000r·min3，微孔滤 膜滤过，注入高效液相色谱仪，记录峰面积，分别计算各成分的提取率，考察离子液体不同 提取方式对昆明山海棠各成分的提取率，结果见图14-18。
[0079] 由图14-18可知，样品采用回流和超声两种提取方式时雷公藤晋碱、雷公藤碱庚、 雷酚内酯、雷公藤次碱、雷公藤醌A的提取率相差不大，考虑到超声提取工艺简单，溶剂用 量小，因此选择提取方式为超声。
[0080] 6.超声时间的考察
[0081] 取6份昆明山海棠粉末（过三号筛）0.lg，精密称定，加入0.6mol吨1[810111]?卩6甲 醇溶液各lmL，分成3份，每个2份（分别用分散剂甲醇、无水乙醇）超声提取20min、30min、 40min，离心5min(12000r·min^，微孔滤膜滤过，注入高效液相色谱仪，记录峰面积，按选 择的分散剂计算各成分的提取率，考察离子液体在不同超声时间对昆明山海棠各成分的提 取率，结果见图19-23。
[0082]由图19-23可知，仅雷公藤晋碱的提取率超声40min时稍高于超声30min，雷公藤 碱庚、雷酚内酯、雷公藤次碱和雷公藤醌A的提取率在超声30min时均比超声40min要高， 因此选择超声提取的时间为30min。
[0083] 7.不同粉碎度的考察
[0084] 取昆明山海棠粉末（分别过二、三、四、五号筛）0.lg(8份），分别加入 0. 6mol.L1 [BMIm]PF6甲醇溶液和无水乙醇溶液各lmL(各4份），精密称定，超声30min，离 心5min(12000r·min^，微孔滤膜滤过，注入高效液相色谱仪，记录峰面积，计算各成分的 提取率，考察离子液体在不同超声时间对昆明山海棠各成分的提取率，结果见图23-28。
[0085] 由图24-28可知，综合不同粉碎度雷公藤晋碱、雷公藤碱庚、雷酚内酯、雷公藤次 碱和雷公藤醌A的提取率，昆明山海棠粉碎后过三号筛能有效的提取5种成分。因此选择 粉碎昆明山海棠后过三号筛来进行提取。
[0086] 根上述优选条件，对昆明山海棠原药材粉末进行检测，证明试验离子液体中仅 [810!11]?? 6提取雷公藤晋碱、雷公藤碱庚、雷酚内酯、雷公藤次碱和雷公藤醌A时均比甲醇的 提取率高。采用离子液体提取5中成分的含量相比单纯用甲醇提取，雷公藤晋碱、雷公藤碱 庚、雷酚内酯、雷公藤次碱和雷公藤醌A含量分别高出104. 7%、83. 1 %、28. 8%、141. 8%和 11. 1% ;采用离子液体提取5种成分的含量相比单纯用无水乙醇提取，雷公藤晋碱、雷公藤 碱庚、雷酚内酯、雷公藤次碱和雷公藤醌A含量分别高出23. 9%、9. 8%、48. 7%、15. 6%和 61. 7%。采用离子液体结合超声波提取法的优势，有效的测定了昆明山海棠中5种活性成 分，结果表明该方法稳定、简单、绿色环保。
【主权项】
1. 一种基于离子液体-超声辅助-HPLC的昆明山海棠活性成分检测方法，包括制备样 品和HPLC检测，其特征在于：所述制备样品为采用1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐的溶液 作为提取液提取昆明山海棠药材。2. 根据权利要求1所述的基于离子液体-超声辅助-HPLC的昆明山海棠活性成分检测 方法，其特征在于：所述提取液中1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐的分散剂为甲醇。3. 根据权利要求2所述的基于离子液体-超声辅助-HPLC的昆明山海棠活性成分检 测方法，其特征在于：所述提取液中1- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐的浓度为0. 2-1. 0 mol·L、4. 根据权利要求3所述的基于离子液体-超声辅助-HPLC的昆明山海棠活性成分检测 方法，其特征在于：所述制备样品为采用提取液与昆明山海棠药材10:1的固液质量比超声 微萃取30min。5. 根据权利要求4所述的基于离子液体-超声辅助-HPLC的昆明山海棠活性成分检测 方法，其特征在于：所述制备样品包括以下步骤： 1) 精密称定过三号筛昆明山海棠粉末，置于具塞离心试管中； 2) 按照固液质量比1:10的比例加入0· 6mol·L1 [BMIm]PF6甲醇溶液； 3) 超声萃取30min，然后用1 2000r离心5min，上清液微孔滤膜滤过，即得 供试样品。6. 根据权利要求5所述的基于离子液体-超声辅助-HPLC的昆明山海棠活性成分检测 方法，其特征在于：所述HPLC检测的条件为： 色谱柱：Inertsil0DS-4 (3Mm, 4.6*250mm); 流动相：乙腈（A)-0. 1%磷酸溶液（B); 梯度洗脱条件：〇~55min，37%A- 37%A; 55 ~75min，37%A- 45%A; 75 ~100min，45%A- 45%A; 100 ~105min，45%A- 49%A; 105 ~125min，49%A- 49%A; 检测波长：220nm; 柱温：30°C;流速：0· 75mL/min; 进样量：5μ1。
【专利摘要】本发明提供了一种基于离子液体-超声辅助-HPLC的昆明山海棠活性成分检测方法，其中技术关键为，在所述制备样品为采用1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐的溶液作为提取液提取昆明山海棠药材。采用本发明提供的方法检测效率明显高于传统单成分简称方法，更重要的是本发明提供过程中活性成分的转移率明显高于传统的甲醇提取方法，有效的并避免了检测误差。
【IPC分类】G01N30/14
【公开号】CN105372358
【申请号】CN201510910038
【发明人】陈一龙, 张小梅, 励娜, 姚媛媛, 梁旭明, 杨大坚, 张毅, 祝卢艺
【申请人】重庆市中药研究院
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年12月8日