一种草果与草豆蔻的指纹图谱鉴别方法
【专利摘要】本发明提供一种可用于快速鉴别草果与草豆蔻的指纹图谱鉴别方法。该法以乙酸乙酯、石油醚或二氯甲烷为萃取溶剂，采用超声辅助萃取或冷浸法提取制备供试液，应用GC-MS方法在一定条件下测得指纹图谱并用于草果与草豆蔻的鉴别。科学试验证明，该法操作简便、快速；测得的指纹图谱重复性高，特征性强，可用于草果和草豆蔻的快速鉴别与质量控制。
【专利说明】一种草果与草豆蔻的指纹图谱鉴别方法
【技术领域】 _
[0001] 本发明涉及中药鉴别领域，具体涉及一种草果与草豆蔻药材的指纹图谱鉴别方 法。
【背景技术】
[0002] 草果别名草果子，草果仁，始载于《本草纲目》，2〇1〇年版《中国药典》记载草果为 姜科植物草果Amomum tsao-ko Crevost et Lemaire的干燥成熟果实，具燥湿温中，除痰截 疱的功效；而草豆蔻为姜科植物Alpinia Katsumadai Hayata的干燥近成熟的种子，具燥湿 行气，温中止呕的功效；草果与草豆蘧功效不同，临床应用也有差异，但由于两者同为姜科 药材，其外形、气味非常相似，常常容易混淆使用。为区别鉴定草果与草豆蔻，余南才等人从 性状，来源，显微，薄层色谱等方面对草果与草豆蘧进行了鉴别比较。
[0003] 目前草果与草豆蔻药材的鉴别主要是根据外观气味及显微形态特征等传统方法 来进行，这些方法有的比较繁琐，有的不够客观，有时仍不容易准确鉴别；因此，建立一种与 国际接轨的、客观先进、快速准确的草果与草豆蔻药材的指纹图谱鉴别方法，具有重要的意 义。
[0004] 近年来，色谱指纹图谱已成为国际公认的用于鉴别与控制中药材质量的最有效的 手段，它是现代分析科学的优秀成果与中医药整体综合观的有机融合，是一种到目前为止 在国际上较为认可的利用现代科学技术手段所能达到的用于表现中药复杂体系特性的最 好方法。GC-MS指纹图谱是近年来发展起来的用于中药挥发油成分分析与鉴别的一种方法， 与普通色谱指纹图谱相比，它不仅可给出类似普通色谱指纹图谱的峰型特征，还可同时对 各色谱峰的多个组份同时进行快速定性，给出各个特征指纹峰的成分以及结构。因此，在中 药定性与鉴别方面，GC-MS指纹图谱比普通色谱指纹图谱的选择性更强，具有更多的优势。 最近曾有应用水蒸汽蒸馏或超临界流体提取草果或草豆蔻挥发油，然后用GC-MS方法测定 其挥发油指纹图谱的报道，但由于这些方法通常所需的药材量较多，提取过程比较麻烦，提 取时间一般都比较长；而且水蒸汽蒸馏法因为温度高、提取时间长，可能还会造成部分有效 成分的破坏及损失，均不适用于作为药材的快速鉴别方法。
【发明内容】
[0005] f发明的目的是提供一种可用于准确快速鉴别草果与草豆蔻的指纹图谱鉴别方 法。该法采用乙酸乙酯、二氯甲烷或石油醚为萃取溶剂，采用超声辅助萃取或冷浸提取制备 供试品溶液，用GC-MS方法在一定条件下测得指纹图谱并用于草果与草豆蔻的鉴别。科学 试验证明，该法简便、快速；所需药材量少，测得的指纹图谱特征及差异明显，重复性高，可 用于草果和草豆蔻的准确快速鉴别与质量控制。
[0006]本发明的草果与草豆蔻药材的指纹图谱鉴别方法具体包括以下步骤：
[0007] ⑴供试品溶液的制备：取草果和草豆蔻药材粉末4-6克，精密称定，分置于两个 锥形瓶中，分别加入乙酸乙酯、二氯甲烷或石油醚20-30ml，冷浸24小时或超声辅助提取 30-40分钟，放冷，加相应溶剂补足失去的重量，过滤，取续滤液置离心管中，用无水硫酸钠 千燥去除水分，以l3〇〇〇r/min离心10分钟，取上清液，即得草果和草豆蔻药材的供试品溶 液；
[0008] (2)色谱分析条件：弹性石英毛细管色谱柱，以高纯He为载气，流量1. 〇ml/min ; 进样口温度230°C -25〇°C ;不分流进样；采用程序升温进行分析；
[0009] (3)质谱分析条件：电离方式为EI，电子能量70eV，检测器温度250? -280°c，离 子源温度230Γ，四级杆温度150°C，倍增电压1782v，发射电流34. 6μΑ，扫描质量范围： 50-500amu ;溶剂延迟 3. Omin ;
[0010] ⑷测定方法：分别取草果和草豆蔻的供试液各1 μ 1，注入GC-MS联用仪，测定草 果和草豆蔻的总离子流图，即得两药材的鉴别用指纹图谱。
[0011] 经过研究，本发明优化的草果与草豆蓮药材的指纹图谱鉴别方法按以下步骤实 施：
[0012] (1)供试品溶液的制备：取草果和草豆蔻药材粉末5克，精密称定，分置于两个锥 形瓶中，分别加入乙酸乙酯20ml，超声辅助提取30分钟，放冷，加乙酸乙酯补足失去的重 量，过滤，取续滤液置离心管中，用无水硫酸钠干燥去除水分，以13〇〇〇r/min离心10分钟， 取上清液，即得草果和草豆蔻药材的供试品溶液；
[0013] (2)色谱分析条件：HP-5MS UI弹性石英毛细管色谱柱，其规格为 3〇111\0.2511111^0.254111;载气为高纯拖，纯度彡 99.99%，流量1.〇1111/1^11;进样口温度 250°C ;不分流进样；程序升温程序为：初始温度80°C，保持3min，以6°C /min升至180°C， 保持3min ;
[0014] ⑶质谱分析条件：电离方式为EI，电子能量70eV，检测器温度280°C，离子源温度 2 3〇°C，四级杆温度l5〇°C，倍增电压1782v，发射电流34. 6μ A，扫描质量范围：50-500amu ; 溶剂延迟3. Omin ;
[0015] (4)测定方法：分别取草果和草豆蔻的供试液各1 μ 1，注入GC-MS联用仪，测定草 果和草豆蘧的总离子流图，即得两药材的鉴别用指纹图谱；
[0016] (5)标准指纹图谱的建立：测定10批不同产地草果与草豆蔻的GC-MS指纹图谱， 应用计算机对指纹图谱的数据进行分析对比，计算得出草果与草豆蔻的GC-MS指纹图谱的 共有模式，作为草果与草豆蔻药材的鉴别用标准指纹图谱；草果指纹图谱共有模式中具有 16个共有特征指纹峰，各特征峰对应的化学成分分别是1号峰： α -蒎烯；2号峰：β -菠 烯；3号峰：α -水芹烯；4号峰：桉油精；5号峰：α -松油醇；6号峰：顺式-柠檬醛；7号 峰：香叶醇；9 号峰：反式-抒檬醛；10 号峰：trans-2,3,3α，7a-tetr-ahydro-lH-indene -4-carbaldehyde ;11 号峰：cis-2,3,3a，7a -tetr-ahydro-lH-indene-4-carbaldehyde ; l2号峰：2,3-二氢-1H-茚-4-甲醛；13号峰：乙酸香叶酯；14号峰：顺式-环癸烯；15号 峰：反式-2-十二烯醛；16号峰：橙花叔醇。其中以桉油精的相对含量为最高。草豆蔻指纹 图谱共有模式有13个共有特征峰，各特征峰对应的化学成分分别是1号峰： α -蔽烯；2号 峰：莰烯；3号峰：α -水芹烯；4号峰：对-聚伞花烃；5号峰：桉油精；6号峰：樟脑；7号峰： L-(-)-龙脑；8号峰：(-)-4-萜品醇；9号峰：4-苯基-2-丁酮；10号峰：反式-桂皮醛；11 5峰：α -石竹痛；I2号峰：δ -杜松烯；I3号峰：金合欢醇。其中以金合欢醇的相对含量为 最高。
[0017] (6)应用：将待测药材样品的GC-MS指纹图谱分别与草果与草豆蔻药材的标准指 纹图谱进行对比，根据特征指纹峰位及主要特征峰面积的大小，即可确定药材的品种与质 量。
[0018] 本发明与现有技术相比，其主要优点及积极效果在于：
[0019] ⑴本发明草果和草豆蔻药材GC-MS指纹图谱的鉴别方法，系采用超声辅助提取 的方法制备供试品溶液，与现有水蒸汽蒸馏法或超临界流体法提取草果和草豆蘧挥发油测 定指纹图谱的技术相比，所需药材量要少得多，提取分析过程更加简单快捷，从供试品制备 到完成指纹图谱分析所需时间不到1个小时，并可避免水蒸汽蒸馏提取挥发油过程中由于 提取温度高、提取时间长所造成的部分化学成分的破坏与损失，方法重复性及稳定性更好。
[0020] ⑵与传统鉴别方法相比，本法操作简便，过程简单且易于控制，方法重复性及与 准确性好，特征性强，只需通过视觉直观辨识待测图谱与标准图谱的异同便可进行药材的 快速鉴别，结果更加客观准确。
[0021] (3)本发明的草果和草豆蔻药材的指纹图谱鉴别方法，不仅可给出色谱指纹图谱 的特征峰型，还可同时给出各特征指纹峰的成分以及结构，方法特征性更好，具有更多的优 势。
[0022] ⑷本发明的指纹图谱鉴别方法，通过观察待测药材特征指纹峰的有无及主要成 分特征峰面积的大小，可用于判断药材质量的优劣，保证药材质量的稳定、均一和可控。 [0023]本发明的检测方法，是通过大量实验摸索得到的切实可行的方法，具有可重复性 和较好的稳定性，根据本发明所公开的技术内容，本领域技术人员将很清楚本发明的其它 实施方案，但只要使用本发明所述的检测方法，均在本发明保护范围之内。
【专利附图】
【附图说明】：
[0024] 附图1草果GC-MS指纹图谱共有模式
[0025] 附图2草豆蔻GC-MS指纹图谱共有模式
[0026] 附图3石油醚超声辅助萃取测得的草果GC-MS指纹图谱
[0027]附图4二氯甲烷超声辅助萃取测得的草果GC-MS指纹图谱
[0028] 附图5乙酸乙酯超声辅助萃取测得的草果GC-MS指纹图谱
[0029] 附图6乙酸乙酯冷浸提取法测得的草果GC-MS指纹图谱 [0030]附图7乙酸乙酯回流提取法测得的草果 GC-MS指纹图谱
【具体实施方式】
[0031]下面将结合实施例对本发明作进一步说明，本发明的实施例仅作为示例，旨在说 明本发明，并不构成对本发明的限制。
[0032]实施例1草果与草豆蔻药材的指纹图谱共有模式的测定 [0033] 1实验材料
[0034] 1.1实验药材：实验用草果、草豆蔻药材购于全国各省市的大药房。草果药材经 广西中医药大学中药鉴定教研室蔡毅教授鉴定为姜科豆蔻属植物草果（Amomum tsao-ko Crevost et Lemaire)的干燥成熟果实；草豆蔻为姜科山姜属植物草豆蔻（Alpinia Katsumadai Hayata)的干燥成熟果实。
[0035] 1· 2实验药材的前处理：取各产地草果、草豆蘧果仁，用粉碎机粉碎，过40目筛网， 备用。
[0036] 1.3实验试剂：乙酸乙酯（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），无水硫酸钠（分 析纯，天津市大茂化学试剂厂）。
[0037] 2.实验仪器：美国安捷伦公司6890Ν-5973Ν气相色谱质谱联用仪；HP-5MS UI弹性 石英毛细管色谱柱（30mX0_25mmX0_25ym) :LG16_WA台式高速离心机（北京医用尚心机 厂）；离心管；KQ5200B型超声波清洗器（250W,频率50KHz)，40目筛网，G1701DA MSD化学 工作站。
[0038] 3. GC-MS 分析条件
[0039] 3. 1色谱条件：载气He (彡99· 99% )流量（1. Oml/min);进样口温度25〇°C ;不分 流进样；气化温度250? ;进样量1 μ 1 ;溶剂延迟3. Omin ;程序升温：初始温度8〇°C,保持 3min，以 6°C /min 升至 180°C保持 3min。
[0040] 3.2质谱条件：电离方式EI，电子能量70eV，检测器温度：280°C，离子源温度 230°C，四级杆温度150°C，倍增电压1782v，发射电流34.6μΑ，扫描质量范围：50-500amu。
[0041] 4.供试品溶液的制备：取草果，草豆蘧药材粉末5g，精密称定，置锥形瓶中，加入 20ml乙酸乙酯，超声提取 3〇min，提取液补足失重后用滤纸过滤，取续滤液置离心管中，用 无水硫酸钠干燥去除水分，以13〇〇〇r/min离心10分钟，取上清液备测。
[0042] 5.测定方法：分别取草果和草豆蔻的供试液各1 μ 1，注入GC-MS联用仪，测定草果 和草豆蘧的总离子流图，即得。
[0043] 6.草果与草豆蔻GC-MS特征指纹峰的确定
[0044] 通过对10批不同产地草果药材测得的指纹图谱进行分析比对，确定了草果药材 具有16个特征指纹峰，分别为1号峰：α -菔烯；2号峰：β -蔽痛；3号峰：α -水芳^希；4号 峰：桉油精；5号峰：α -松油醇；6号峰：顺式-柠檬醛；7号峰：香叶醇；8号峰：未知；9号 峰：反式-梓檬醛；1〇 号峰：trans_2,3,3a，7α -tetr-ahydro-lH-indene-4-carbaldehyd e ;11 号峰：cis-2,3,3α，7α -tetr-ahydro-lH-indene-4-carbaldehyde ;12 号峰：2,3-二 氢-1H-茚-4-甲醛；13号峰：乙酸香叶酯；14号峰：顺式-环癸烯；15号峰：反式-2-十二 烯醛；16号峰：橙花叔醇。通过对测得的各产地草豆蔻药材指纹图谱的分析对比，确定了 草豆蓮药材具有13个特征指纹峰，各特征峰对应的化学成分分别是1号峰：α -蒎烯；2号 峰：茨稀；3号峰：α -水斧燥；4号峰：对-聚伞花烃；5号峰：桉油精；6号峰：樟脑；7号峰： L-龙脑；8号峰：(-)-4-萜品醇；9号峰：4_苯基-2-丁酮；10号峰：反式-桂皮醛；11 号峰：α -石竹烯；12号峰：δ -杜松烯；13号峰：金合欢醇。
[0045] 7.指纹图谱方法学考察及结果
[0046] 草果指纹图谱中13号峰为乙酸香叶酯，是草果的主要成分之一，且此峰在指纹图 谱中位置居中，峰面积稳定，分离度良好，故选取乙酸香叶酯作为草果指纹图谱的参照峰 (S)，用来计算各特征峰与参比峰的保留时间比值（相对保留时间）和各特征峰与参比峰的 峰面积比值（相对峰面积）。在仪器精密度考察中各特征峰与参照峰的相对保留时间RSD 值在0· 01%?0· 04%之间，相对峰面积的RSD值在0. 95%?2. 8%之间；在方法重复性考 察中各特征峰与参比峰的相对保留时间RSD值在0· 01%?0. 07%之间，相对峰面积的RSD 值在1. 2%?2. 9%之间；在稳定性考察中各特征峰与参比峰在24小时内其相对保留时间 RSD值在0· 02%?0· 11 %之间，相对峰面积的RSD值在1. 1 %?2. 8%之间，符合指纹图谱 测定的相关技术要求。
[0047] 8.草果及草豆蘧药材GC-MS指纹图谱共有模式的测定
[0048] 分别取10批不同产地的草果与草豆蘧按"供试品溶液的制备"方法制备供试品溶 液，按"GC-MS分析条件"注入仪器检测分析，用峰面积归一化法计算各特征指纹峰成分的相 对百分含量。
[0049] 应用计算机对测得的10批草果与草豆蔻的GC-MS指纹图谱的数据进行分析对比， 计算得出草果与草豆蔻的GC-MS指纹图谱的共有模式，分别见附图1与附图2。
[0050]将草果与草豆蔻的GC-MS指纹图谱中各特征指纹峰相应的质谱图通过用伩器配 置的化学工作站NIST〇8标准谱库进行检索，并结合相关质谱文献进行分析比对，鉴定得出 草果与草豆蔻GC-MS指纹图谱共有模式中各特征指纹峰所对应的化学成分名称，分别见表 1和表2。
[0051] 表1草果GC-MS指纹图谱中16个特征指纹峰特征成分表
[0052]
【权利要求】
1. 一种草果与草豆蘧的指纹图谱鉴别方法，其特征在于该法是一种采用溶剂超声辅助 萃取或冷浸提取制备供试液，采用GC-MS方法在一定条件下测得指纹图谱并用于鉴别的方 法，具体包括以下测定条件及步骤： (1)供试品溶液的制备：取草果和草豆蘧药材粉末4-6克，精密称定，分置于两个锥形 瓶中，分别加入萃取溶剂20-30ml，冷浸24小时或超声辅助萃取30-40分钟，放冷，加萃取 溶剂补足失去的重量，过滤，取续滤液置离心管中，用无水硫酸钠干燥去除水分，以13000r/ min离心10分钟，取上清液，即得草果和草豆蘧药材的供试品溶液； ⑵色谱分析条件：HP-5MS Π 弹性石英毛细管色谱柱，其规格为 30mX0. 25mmX0. 25μπι;载气为高纯He，纯度彡99. 99 %，流量1. Oml/min ;进样口温度 250°C ;不分流进样；程序升温程序为：初始温度80°C，保持3min，以6°C /min升至180°C， 保持3min ; (3)质谱分析条件：电离方式为EI，电子能量70eV，检测器温度280°C，离子源温度 230°C，四级杆温度150°C，倍增电压1782v，发射电流34. 6μΑ，扫描质量范围：50-500amu; 溶剂延迟3. Omin ; ⑷测定法：分别取草果和草豆蘧的供试液各1 μ 1，注入GC-MS联用仪，测定草果和草 豆蘧的总离子流图，即得两药材的GC-MS指纹图谱； (5) 标准指纹图谱的建立：测定10批不同产地草果与草豆蘧的GC-MS指纹图谱，应用 计算机对指纹图谱的数据进行分析对比，计算得出草果与草豆蘧的GC-MS指纹图谱的共有 模式，作为草果与草豆蘧药材的鉴别用标准指纹图谱； (6) 应用：将待测样品的GC-MS指纹图谱分别与草果与草豆蘧药材的标准指纹图谱进 行对比，根据特征指纹峰位及主要特征峰面积的大小，即可确定药材的品种与质量。
2. 如权利要求1所述的指纹图谱鉴别方法，其特征在于所述的萃取溶剂是乙酸乙酯、 二氯甲烷或石油醚。
3. 如权利要求1所述的指纹图谱鉴别方法，其特征在于所述的最佳萃取溶剂为乙酸乙 酯，所需最佳萃取溶剂量为药材的4-5倍，超声萃取时间为30分钟。
4. 如权利要求1所述的指纹图谱鉴别方法，其特征在于：草果指纹图谱共有模式中具 有16个共有特征峰，各特征峰对应的化学成分分别是：1号峰：α -菔烯，2号峰：β -菔烯， 3号峰：α -水疗烯，4号峰：桉油精，5号峰：α -松油醇，6号峰：顺式-朽1檬醒，7号峰：香 叶醇，9 号峰：反式-朽1 樣醒，10 号峰：trans-2, 3, 3 α，7 α -tetr-ahydro-lH-indene-4-ca rbaldehyde，11 号峰：cis_2,3,3 α，7 a-tetr-ahydr〇-lH-indene-4-ca;rbaldehyde，12 号 峰：2, 3-二氢-1H-茚-4-甲醒，13号峰：乙酸香叶酯，14号峰：顺式-环癸烯，15号峰：反 式-2-十二烯醛，16号峰：橙花叔醇，其中以桉油精的相对含量为最高；草豆蘧指纹图谱共 有模式中具有13个共有特征峰，各特征峰对应的化学成分分别是1号峰：α -菔烯，2号 峰：莰烯，3号峰：α -水芹烯，4号峰：对-聚伞花烃，5号峰：桉油精，6号峰：樟脑，7号峰： L-(-)_龙脑，8号峰：(-)-4-萜品醇，9号峰：4_苯基-2-丁酮，10号峰：反式-桂皮醛，11 号峰：α -石竹烯，12号峰：δ -杜松烯，13号峰：金合欢醇；其中以金合欢醇的相对含量为 最1?。
5. 权利要求1所述的指纹图谱鉴别方法在草果和草豆蘧药材的鉴别与质量控制方面 的应用。
【文档编号】G01N30/06GK104297373SQ201410528048
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年10月10日 优先权日:2014年10月10日
【发明者】覃洁萍, 何俏明, 李耀华, 梁臣艳 申请人:广西中医药大学