一种花粉管装载荧光染料的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及花粉管的极性生长领域，尤其涉及一种花粉管装载荧光染料的方法。
【背景技术】
[0002]花粉管的正常生长是多种信号分子调控的结果，而钙离子在其中发挥着重要作用。在多种植物中已观察到花粉管细胞质尖端较高的钙梯度，钙浓度梯度的消失会导致花粉管生长停止。花粉管顶端高钙梯度可能有以下功能:第一，它可能参与囊泡分泌的调节，因为高浓度的钙利于分泌囊泡与质膜的融合，促进外排作用，使花粉管延伸；第二，高浓度钙使微丝解聚，细胞器的运动减慢，所以钙梯度可以通过控制微丝的组装来影响细胞器的运输;第三，高浓度的钙与花粉管定向生长有关，花粉管顶端高浓度的游离钙离子会抑制肌动蛋白-肌球蛋白调控的运动使囊泡沉淀，如果在花粉管一侧增加胞质游离钙浓度，会使花粉管改变原来的生长方向，向高钙浓度一侧生长。为了进一步研究花粉管中钙离子的作用，我们可以使用荧光标记技术。在这一过程中荧光指示剂是不可缺少的标记物质，在植物花粉管构造及生长特性研究中起着越来越重要的作用。目前常用的荧光指示剂具有在不破坏细胞结构、维持组织活性的前提下，通过荧光显微镜、激光共聚焦显微镜以及流式细胞仪等特点仪器的测定，能够得到花粉管特定细微结构及组织荧光图像。这种方法的成功要基于将染料成功地装载到花粉(管)中，目前，钙离子荧光探针的种类有:单波长荧光探针，包括fluo-3、quin_2、Calcium Green、Calcium Orange等；和双波长焚光探针，主要有indo-Ι、fura-2、fura-red等。钙离子荧光指示剂的装载方法有:电穿孔(这种方法对细胞损伤大，设备贵，现在一般不用)、显微注射(这种方法对细胞有一定程度的损伤，另外操作复杂、工作量大、成功率低、不适用于个体较小的细胞、不适用于批量细胞等缺点都限制了这一方法的广泛应用、膜片钳(速度慢、设备昂贵)、低温法(时间长)、高温法(影响存活)。为了克服以上的不足，需要探索快速有效地装载荧光染料的方法。
【发明内容】
[0003]为了克服现有技术中的缺陷，提供一种花粉管装载荧光染料的方法。
[0004]本发明通过下述方案实现:
[0005]—种花粉管装载荧光染料的方法，包括以下步骤:
[0006]第一步，将花粉包裹于称量纸中，放置于密闭的硅胶瓶中保存于低温冰箱中；
[0007]第二步，花粉从冰箱中取出后，在常温下放置2h后加入培养液中，将其搅拌均匀后置于25°C恒温箱中培养2h，
[0008]第三步，将培养液与裂解液、染色剂对应混合，避光10-30min，然后置于25°C恒温箱中避光培养2h。
[0009]在所述第二步中，所述培养液是将溶质溶解在30mM的2-(N_吗啉)乙磺酸一水合物溶液中，所述溶质包括蔗糖、聚乙二醇、硼酸硝酸钙；
[0010]其中，在所述培养液中溶质的质量百分比如下所示:10%蔗糖，20%聚乙二醇，0.01%硼酸，0.03%硝酸钙。
[0011 ]所述培养液与裂解液、染色剂的体积比为48:1:1。
[0012]所述裂解液中的CTAB质量百分比为2%，Tris-HC 1的浓度为1 OOmM，EDTA的浓度为40mMo
[0013]所述染色剂为乙酰甲酯衍生物，可以穿透细胞膜，进入细胞后会被胞内酯酶所水解，产生的Fluo-4随后会和钙离子结合并发出荧光。
[0014]本发明的有益效果为:
[0015]本发明一种花粉管装载荧光染料的方法采用的染色剂(Fluo-4AM-ester)是一种可以穿透细胞膜的荧光染料，主要通过与细胞内和细胞间游离的钙离子结合对Ca2+信号分布进行定量分析，它可以灵敏反映细胞内游离钙离子浓度变化，染色剂进入细胞后经非特异性酯酶脱去AM成为Fluo-4留在细胞内，Fluo-4与细胞内游离钙结合后其荧光强度是本身的四十多倍以上。使用钙离子荧光探针结合荧光分析技术研究细胞内钙离子时，荧光染料的装载是这一方法中的关键步骤，本发明采用裂解液处理，破坏花粉的细胞膜，使得染色剂能够快速有效地进入细胞。本发明通过使用裂解液及染色剂(Fluo-4AM-ester)，在常温(25°C)下对花粉管处理20min，能够对花粉管中钙离子成功染色。
【具体实施方式】
[0016]下面结合具体实施例对本发明进一步说明:
[0017]本发明中，mM为物质的量浓度单位，为豪摩尔每升。
[0018]—种花粉管装载荧光染料的方法，包括以下步骤:
[0019]第一步，将花粉包裹于称量纸中，放置于密闭的硅胶瓶中保存于低温冰箱中；
[0020]第二步，花粉从冰箱中取出后，在常温下放置2h后加入培养液中，将其搅拌均匀后置于25°C恒温箱中培养2h，
[0021]第三步，将培养液与裂解液、染色剂对应混合，避光10-30min，然后置于25°C恒温箱中避光培养2h。
[0022]在所述第二步中，所述培养液是将溶质溶解在30mM的2-(N_吗啉)乙磺酸一水合物溶液中，所述溶质包括蔗糖、聚乙二醇、硼酸硝酸钙；
[0023]其中，在所述培养液中溶质的质量百分比如下所示:10%蔗糖，20%聚乙二醇，0.01%硼酸，0.03%硝酸钙。
[0024]所述培养液与裂解液、染色剂的体积比为48:1:1。
[0025]所述裂解液中的CTAB质量百分比为2 %，Tri s-HC 1的浓度为1 OOmM，EDTA的浓度为40mMo
[0026]所述染色剂为乙酰甲酯衍生物，可以穿透细胞膜，进入细胞后会被胞内酯酶所水解，产生的Fluo-4随后会和钙离子结合并发出荧光。
[0027]其中Fluo-4的分子式为C51H5QF2N2O23，其分子量为1096.94。
[0028]在实际使用中，还可在第三步完成后在花粉溶液中加入LaCl3，能使花粉管中游离钙离子浓度显著增加。
[0029]本发明一种花粉管装载荧光染料的方法采用的染色剂(Fluo-4M-ester)是一种可以穿透细胞膜的荧光染料，主要通过与细胞内和细胞间游离的钙离子结合对Ca2+信号分布进行定量分析，它可以灵敏反映细胞内游离钙离子浓度变化，染色剂进入细胞后经非特异性酯酶脱去AM成为Fluo-4留在细胞内，Fluo-4与细胞内游离钙结合后其荧光强度是本身的四十多倍以上。使用钙离子荧光探针结合荧光分析技术研究细胞内钙离子时，荧光染料的装载是这一方法中的关键步骤，本发明采用裂解液处理，破坏花粉的细胞膜，使得染色剂能够快速有效地进入细胞。本发明通过使用裂解液及染色剂(Fluo-4AM-ester)，在常温(25°C)下对花粉管处理20min，能够对花粉管中钙离子成功染色。
[0030]尽管已经对本发明的技术方案做了较为详细的阐述和列举，应当理解，对于本领域技术人员来说，对上述实施例做出修改或者采用等同的替代方案，这对本领域的技术人员而言是显而易见，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1.一种花粉管装载荧光染料的方法，其特征在于，包括以下步骤: 第一步，将花粉包裹于称量纸中，放置于密闭的硅胶瓶中保存于低温冰箱中； 第二步，花粉从冰箱中取出后，在常温下放置2h后加入培养液中，将其搅拌均匀后置于25°C恒温箱中培养2h， 第三步，将培养液与裂解液、染色剂对应混合，避光10-30min，然后置于25°C恒温箱中避光培养2h。2.根据权利要求1所述的一种花粉管装载荧光染料的方法，其特征在于:在所述第二步中，所述培养液是将溶质溶解在30mM的2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物溶液中，所述溶质包括蔗糖、聚乙二醇、硼酸硝酸钙； 其中，在所述培养液中溶质的质量百分比如下所示:10%蔗糖，20%聚乙二醇，0.01%硼酸，0.03%硝酸钙。3.根据权利要求1所述的一种花粉管装载荧光染料的方法，其特征在于:所述培养液与裂解液、染色剂的体积比为48:1:1。4.根据权利要求1或者3所述的一种花粉管装载荧光染料的方法，其特征在于:所述裂解液中的CTAB质量百分比为2%，Tris-HCl的浓度为100mM，EDTA的浓度为40mM。5.根据权利要求1或者3所述的一种花粉管装载荧光染料的方法，其特征在于:所述染色剂为乙酰甲酯衍生物(Flu0-4AM-ester)，可以穿透细胞膜，进入细胞后会被胞内酯酶所水解，产生的Fluo-4随后会和钙离子结合并发出荧光。
【专利摘要】本发明公开了一种花粉管装载荧光染料的方法，包括以下步骤：第一步，将花粉包裹于称量纸中，放置于密闭的硅胶瓶中保存于低温冰箱中；第二步，花粉从冰箱中取出后，在常温下放置2h后加入培养液中，将其搅拌均匀后置于25℃恒温箱中培养2h，第三步，将培养液与裂解液、染色剂对应混合，避光10-30min，然后置于25℃恒温箱中避光培养2h。本发明采用裂解液处理，破坏花粉的细胞膜，使得染色剂能够快速有效地进入细胞。本发明通过使用裂解液及染色剂(Fluo-4AM-ester)，在常温(25℃)下对花粉管处理20min，能够对花粉管中钙离子成功染色。
【IPC分类】G01N1/30, G01N21/64
【公开号】CN105486565
【申请号】CN201510944828
【发明人】屈海泳, 王永章, 刘成连, 原永兵, 邢文曦, 吴芬芬, 管押琴
【申请人】青岛农业大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月16日