卵巢癌生物标志物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及用于进行卵巢癌评估的生物标志物。
【背景技术】
[0002] 卵巢癌是北美妇女中妇科癌症死亡的主要原因和癌症死亡的第五主要原因，其主 要缘于缺乏早期症状或有效筛查。卵巢癌的早期检测使5年存活率从低于30 %增加至70 % -90%，但早期确诊病例低于20%。来自前列腺、肺、结肠直肠 W及卵巢癌筛查试验(PLCO)的 结果提供了结论性证据，目前针对CA-125蛋白的验血W及经阴道超声的监护标准并不能改 善卵巢癌早期检测率或存活。近年来出现几种新的早期检测标志物，但迄今经验证均无效。 本发明解决运些问题。
[0003] 发明概述
[0004] 提供生物标志物和生物标志物组，用于进行卵巢癌评估，例如，诊断卵巢癌、预测 卵巢癌对卵巢癌治疗的反应性W及监测卵巢癌。可向评估患者提供报告。还提供使用运些 生物标志物进行卵巢癌评估的方法、试剂、装置和试剂盒。可进一步根据反应性评估对患者 进行治疗。
[0005] 附图简要说明
[0006] 根据W下详细说明，并结合附图，对本发明进行最优理解。本专利或申请文件包含 至少一副彩图。如有需要并支付必要费用，专利局将提供本专利或专利申请的彩图公开副 本。应当强调，根据惯例，附图的不同特征并非等比例。相反，为了清楚起见，不同特征的尺 寸可任意扩大或缩小。附图中包括下列各图。
[0007] 图1描述用于鉴定人类基因组中与卵巢癌最为相关的160种基因的方法。A.从化e Gene Expression Omnibus下载7个数据集，其包含高级别浆液性卵巢癌和对照的基因表 达。B.森林图，代表在(A)中针对单个基因（基因并不特定于运一病例，其仅为该方法的概 览）的元分析(meta-analysis)的输出。y轴列出基因表达的编号，X轴绘出表达的Log 2倍变 化(0表示该研究中病例和对照之间无差别，1表示病例中表达是对照中的两倍，等等）。蓝色 方块的大小与该研究中患者数成比例，并位于该研究的平均log倍数变化的中间。水平线示 出该单项研究估计量的95%置信区间。概况统计量(summary StatiStic)如黄色菱形所示。 运是所有单个研究的加权平均值(因此具有较小置信区间的较大研究对最终的概况统计量 影响较大）。菱形的宽度表明该概况统计量的95%置信区间。每种经测量基因均由运样一幅 图表示，并基于概况统计量(又名效应量(effect size))和统计显著性对基因进行排列。基 于用于考虑某些显著过表达（log倍数变化〉.75，p值<.OOl，FDR<. OOl)的过滤器，鉴定出在 所有7项研究中均过表达的160种基因。
[000引图別正实在独立组中，由图1中所述方法鉴定的优选基因比本领域认可的生物标志 物组能更好地区分癌症病例和对照。A.使用来自591例卵巢癌病例和8例对照的癌症基因组 图谱(TCGA)微阵列数据对优选候选基因进行验证。4种基因表达的组合区分癌症与对照组。 B.作为对比，OvaSure是2008年才上市的用于卵巢癌早期检测的基于血液的生物标志物组。 OvaSure含有4种在癌症病例血清中升高的蛋白。每个绿点是一名患者，沿y轴的位置表示此 人基于所有4种基因的综合分数。4种基因数值的几何平均数用作微阵列实验的输出（4个数 值相乘，并取4次方根）。
[0009] 图3证实排在前列的早期检测生物标志物如何明确区分早期卵巢癌病例（I期或II 期)与正常个体。基于生物标志物多大程度上能区分正常对照与早期癌症，W及多大程度上 与TCGA组中的患者存活相关，对候选生物标志物的最初列表进行先后排列。最佳组由列表 中前5种生物标志物组成。晚期卵巢癌病例获得类似的结果。
[0010] 图4证实在独立组中，早期检测生物标志物候选者的表现优于OvaSure。在第二个 独立组(GSE4122)中验证早期检测生物标志物组，该组由32名卵巢浆液性腺癌病例和32名 正常或良性对照组成。在该组中测量的巧中候选生物标志物获得了比巧中OvaSure基因更高 的 AUC。
[0011] 图5示出人血浆中两种新的早期检测生物标志物的试验验证研究结果。在针对蛋 白质组数据库对来自元分析的候选生物标志物列表进行过滤后，选出两种蛋白（PRKDC和 RAD4化），在12名预处理的卵巢癌患者和12名年龄、性别、种族匹配的对照血浆中进行试验 验证研究。将不连续OvaSure组中6种生物标志物中的4种(CA125、0PN、LEP、ILGF2)作为阳性 对照进行测试。每个点代表一名患者的化ISA值。蓝色箭头标出I期样品的结果，红色箭头标 出II期样品的结果。剩余样品是HI期或IV期。每组中，右侧图示出癌症病例的数值，左侧图 示出年龄、种族和性别匹配的对照的数值。
[0012] 发明详述
[0013] 提供生物标志物，用于卵巢癌评估，例如，诊断卵巢癌、预测卵巢癌对卵巢癌治疗 的反应性，W及监测卵巢癌。可向评估患者提供报告。还提供使用运些生物标志物进行卵巢 癌评估的方法、试剂、装置和试剂盒。可进一步根据反应性评估对患者进行治疗。本领域技 术人员在阅读W下更为全面描述的组合物和方法的详细内容后，会清楚本发明的诸多目 的、优势和特征。
[0014] 在描述本发明的方法和组合物之前，应当理解本发明并不限于所述特定方法或组 合物，因为其当然是可变的。还应理解，本文所用术语仅旨在描述特定实施方案，无意进行 限制，因为本发明的范围仅由所附权利要求限定。
[0015] 当提供数值范围时，应当理解，该范围上下限之间W下限单位的十分之一存在(除 非本文另有明确说明）的每个居中数值也具体公开。本发明包含指定范围内的任意指定数 值或居中数值与该指定范围内的任意其他指定或居中数值之间的每个较小范围。该较小范 围的上下限可独立地包括或排除在该范围内，并且其上下限的一个、没有或两个包括在该 较小范围内的每个范围也包含在本发明中，隶属于指定范围中任意具体排除的限定。指定 范围包括一或两个限定，排除运些被包括限定的一个或两个的范围也包括在本发明中。
[0016] 除非另有说明，本发明所用科技术语与本发明所属技术领域的普通技术人员所通 常理解的含义相同的含义。尽管与本发明所述方法和材料相似或等同的任意方法和材料均 可用于本发明的实施或测试，但W下描述的是潜在的和优选的方法和材料。所有本文提及 的出版物均通过引用并入本文，W公开和描述与引用所述出版物相关的方法和/或材料。应 当理解，如与引入的出版物内容有冲突，W本发明公开为准。
[0017] 本领域技术人员在阅读该公开时会明白，本文描述并例举的每个实施方案均具有 分离的成分和特征，其可与任意其他几个实施方案的特征分离或组合，而不背离本发明的 范围和精神。任意所述方法均可按照所述事件的顺序或按照符合逻辑的任意其他顺序执 行。
[0018] 必须注意的是，除非文中另有明确指明，用于本发明及所附权利要求，单数形式一 个（"a)"、" 一种(an)"和"所述(the)"包括复数指示物。因此，例如"一个细胞"包括多个该细 胞，"所述肤"包括本领域技术人员知晓的一或多种肤或其等价物，例如多肤，诸如此类。
[0019] 本文所讨论的出版物仅因其公开早于本申请的申请日而提供。本文不应理解为承 认本发明就在先发明而言不早于运些出版物。另外，提供的出版日期可能与实际出版日期 不同，需要单独确认。
[0020] 如上总结，本发明包括组合物、方法、系统和试剂盒，其可用于提供卵巢癌评估，例 如，诊断、预后、监测和/或治疗对象中的卵巢癌。在描述本发明时，首先描述用于提供卵巢 癌评估的组合物，然后是用于该用途的方法、系统和试剂盒。
[0021 ]卵巢癌生物标志物和生物标志物组
[0022] 在本发明一些方面，提供卵巢癌生物标志物。"生物标志物"或"标志物"是指分子 实体，其在样品中的表现与疾病表型相关。"卵巢癌"是指起源于卵巢的任何癌性生长，例如 表面上皮-间质肿瘤(腺癌，包括例如乳头状浆液性囊腺癌、内膜样瘤、浆液性囊腺癌、乳头 状粘液性囊腺癌、透明细胞卵巢肿瘤、粘液腺癌、囊腺癌及其他）、癌(例如，性索-间质肿瘤、 其他癌）、生殖细胞瘤(例如，崎胎瘤、无性细胞瘤及其他）、苗勒管肿瘤、表皮样瘤(鱗状细胞 癌）、布伦纳瘤等等，如本领域已知或本文所述。因此，卵巢癌"生物标志物"或"卵巢癌标志 物"是指分子实体，其在样品中的表现与卵巢癌表型相关，例如卵巢癌的存在、卵巢癌阶段、 与卵巢癌相关的预后、预测卵巢癌对治疗的反应性等。换言之，标志物可W说是在具有卵巢 癌表型的样品中差异表现。
[0023] 卵巢癌生物标志物包括在卵巢癌表型中差异表现的蛋白及其对应的遗传序列，即 mRNA、DNA等。"基卸'或"重组基卸'是指包含开放式阅读框的核酸，其编码所述蛋白。编码序 列的界限由5'（氨基)末端的起始密码子和3'（簇基)末端的翻译终止密码子确定。转录终止 序列可位于编码序列的3'。另外，基因可任选地包括其天然启动子（即与基因的外显子和内 含子在非重组细胞，即天然存在的细胞中可操作地连接的启动子），W及相关调控序列，并 且可W或者可W不具有AUG起始位点上游序列，并且可W或者可W不包括非翻译先导序列、 信号序列、下游非翻译序列、转录起始和终止序列、多腺巧酸化信号、翻译起始和终止序列、 核糖体结合位点等等。用在本文中，术语"基因产物"或"表达产物"是指基因的RNA转录产物 (转录子），包括mRNA; W及该RNA转录子的多肤翻译产物，即由基因编码的氨基酸产物。基因 产物可W是，例如，基因的RNA转录子，例如非剪接RNA、mRNA、剪接变体mRNA、microRNA、片段 化RNA等;或者由基因编码的氨基酸产物，包括例如，全长多肤、全长多肤的剪接变体、翻译 后修饰多肤W及基因产物的片段，例如肤等。在一些情况下，标志物或标志物活性水平升高 可与卵巢癌表型相关。在其他情况下，标志物或标志物活性水平降低可与卵巢癌表型相关。
[0024] 如本发明实施例中所证实，发明人鉴定了两种蛋白，Prkdc和Rad5化，其在卵巢癌 亚型的血液样品中表现为水平升高，并因此可用作生物标志物，提供卵巢癌评估，例如，诊 断卵巢癌、预后卵巢癌、确定受到卵巢癌影响的对象的治疗方案、监测患有卵巢癌的对象， 等等。PRKDC基因，又名"DNA激活蛋白激酶催化多肤（protein kinase ,DNA-activated, catalyticpolypeptider、DNA-PKcs、肌亂、9350、0魁？1(、0肥1(1、肌亂巧0邸0：7，编码0臟依 赖的蛋白激酶(DNA-PK)催化亚基。其与Ku70/Ku80异二聚体蛋白在DNA双链断裂修复和重组 中发挥作用。编码的蛋白是PI3/PI4激酶家族成员。PRKDC的CDNA和蛋白序列可见于Genbank 登录号NM_006904.6 dRAD5化基因，又名"RAD54样"、皿54、hHR54、RAD54A和hRAD54，编码属于 DEAD样解螺旋酶超家族，并与酿酒酵母Rad54具有相似性的蛋白，所述蛋白已知参与DNA同 源重组和修复，包括DNA双链断裂修复。该蛋白与双链DNA的结合诱导DNA拓扑变化，其被认 为有助于同源DNA配对，并刺激DNA重组。RAD5化的CDNA和蛋白序列可见于Genbank登录号 NM_003579.3〇
[00巧]由于Prkdc和Rad5化是DNA修复的关键调节子，在例如血液中Prkdc或Rad5化蛋白 或蛋白活性水平升高的卵巢癌患者与具有更接近未患有癌症的个体血液中Prkdc或RadSA 水平的卵巢癌患者相比，将对DNA损伤剂的癌症治疗更具抗性和反应性更低。"DNA损伤剂" 是指损伤DNA的化疗剂或福射，例如通过使DNA烷基化或甲基化引