测定生物机体组织和脏器中总量砷和价态砷含量的方法

测定生物机体组织和脏器中总量砷和价态砷含量的方法
【专利摘要】本发明公开一种测定生物机体组织和脏器中砷形态及价态含量的方法，其特征在于该方法包括步骤：(1)生物机体样品依次经过预处理、酶解、过滤和消解，从而提取其中的砷；(2)ICP-MS法测定生物机体样品中的总量砷含量。本发明也公开一种测定生物机体中价态砷含量的方法，其特征在于该方法包括步骤：(1)生物机体样品依次经过预处理、酶解和过滤，从而提取其中的价态砷；(2)HPLC-ICP-MS法测定生物机体样品中的价态砷含量。该方法简便可行，不仅能有效完全的提取出生物机体中的砷，还能保证价态砷的稳定。
【专利说明】
测定生物机体组织和脏器中总量砷和价态砷含量的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种测定生物机体组织和脏器中总量砷含量的方法，本发明也涉及一 种测定生物机体组织和脏器中价态砷含量的方法。
【背景技术】
[0002] 雄黄为我国常用的矿物类中药，临床应用的历史已有几千年，最早入药的记载为 《神农本草经》，可内服外用且用途广泛。现有的国家标准中收载了含雄黄朱砂的成方制剂 约460种；目前中国药典2010年版一部中收录的含雄黄品种有10种、含雄黄和朱砂的品种 有23个，未收载到中国药典2010年版一部的品种中，含雄黄的为72种，含雄黄和朱砂的有 94种。其中小儿用药品种就有22种之多。说明雄黄对于中药来说，有着极其重要的作用。
[0003] 雄黄矿的开采历史可追溯至秦汉或更早时期，雄黄入药记载始见于我国第一部药 物学专著《神农本草经》，被列为中品，至今约2000年，说明我国使用雄黄作为药用的历史 悠久。
[0004] 传统医学认为雄黄具有解毒杀虫、燥湿祛痰、截疟等功能。在几千年的临床实践中 已证明其有效性，自20世纪50年代以来，国内医者将含雄黄的复方制剂或单方用于治疗 血液系统疾病、恶性淋巴系统疾病甚至实体瘤，取得了明显的治疗效果。雄黄具有较好的 抗菌、抗病毒作用，其具有广泛的抗菌谱，对金黄色葡萄球菌、链球菌、白色链珠菌、结核杆 菌等均有较强的抗菌作用；雄黄及其复方制剂对带状疱疹等病毒性皮肤感染具有较好的疗 效，与其促进一过性细胞凋亡有较大关系。但雄黄发挥药效的机制至今仍未有确切说法。
[0005] 随着人们对自身身体健康的日益重视，对砷的认识也逐步深入，砷作为一种活泼 的类金属，在自然界中主要硫化物形式存在，游离态很少。有研究结果证明，砷可能是机体 必需的微量元素，在羊、微型猪和鸡的研究中发现，砷缺乏可能会导致生长滞缓，怀孕减少， 死亡率增加。19世纪欧洲人广泛地将砷作为抗菌剂和强身剂使用。虽然砷的作用不容小视， 但砷的毒性也同样引人瞩目，砒霜作为剧毒的砷化合物，是最古老毒物之一。长期接触砷也 会使慢性中毒，产生心血管系统、神经系统、呼吸系统等毒性，尤其是地方性砷中毒（主要 是长期服用含砷的水等）引起了人们对砷的注意。雄黄作为含砷量达70%的中药，加上受 传统用药习惯（认为中药可以长期服用或煎煮汤服等），临床上使用的误区（长期、大量的 服用、与其他药物不合理配伍等）等影响，雄黄及其制剂引起的不良反应或中毒事件时有 报道，加上中西方一些媒体的宣传，使雄黄的安全问题日益重要。但许多试验也证明，雄黄 的许多不良反应并非本身质量引起，与用药不当有密切关系。
[0006] 上述药理和毒性研究基本均采用动物模型或临床症状，采用的结果判别依据基本 均是症状描述、临床指标或病理切片等，少部分采用砷总量作为结果评价的依据，基本未见 用砷价态对结果进行分析。
[0007] 自然界的砷主要以金属砷、无机砷（As3+，As5+)和有机砷（砷胆碱、砷甜菜碱、二甲 基砷、一甲基砷）形式存在，砷是具毒性的一种元素，其对生物体毒性的大小取决于砷的形 态及化合物种类，一般来说，无机砷比有机砷毒性大，三价砷比五价砷的毒性大，其中砷化 氢是砷化合物中毒性最大的一个，但一般自然界中不存在，仅在特殊情况下产生。砷胆碱、 砷甜菜碱在海产品中易见，基本认为无毒；二甲基砷、一甲基砷一般是机体的代谢产物，毒 性较小。
[0008] 雄黄产生毒性的机制现一般认为是雄黄中可溶性砷进入机体后，作用于酶系统， 可抑制酶系统，干扰机体的正常运行。药理作用表明，适宜剂量的雄黄能诱导肿瘤细胞凋 亡；促进肿瘤细胞成熟、分化；抑制肿瘤细胞核酸的合成、抑制血管内皮细胞的生长及直接 杀瘤作用。但长期大量使用雄黄可致突变、致癌、致畸，还可引发贫血及砷角质化病等。
[0009] 尽管对雄黄的研究已经持续多年，但对其药用及毒性机理现在仍不明确。造成现 在这种现状的主要原因，是无有效的手段对生物机体中的砷形态及价态进行准确测定，现 有文献报道的方法均不能在完全提取出生物机体中的砷的前提下，同时保证砷价态不发生 变化，由于不同价态砷的毒性不一样，准确的测定各价态砷的含量，对雄黄药效及毒性的机 制判断至关重要。

【发明内容】

[0010] 鉴于现有技术的状况，本
【申请人】经过深入研究，建立了通过生物降解法提取生物 机体组织和脏器中的总量砷从而测定生物机体组织和脏器中的总量砷含量的方法，该方法 通过有效破坏生物机体组织和脏器的基质，消除生物基质带来的干扰，使与细胞或其他物 质结合的价态砷能全部被释放，同时保证价态的完整。本申请还建立了与总量砷基本统一 的价态砷的测定方法，测定结果准确可靠，整个方法简便可行。
[0011] 因此，本发明的一个目的在于提供一种测定生物机体组织和脏器中总量砷含量的 方法，其特征在于该方法包括步骤：
[0012] (1)生物机体组织和脏器样品依次经过预处理、酶解、过滤和消解，从而提取其中 的砷；
[0013] (2) ICP-MS法测定生物机体组织和脏器样品中的总量砷含量。
[0014] 根据本发明的一个优选的实施方式，所述生物机体组织和脏器选自动物、植物和 微生物，其中动物样品例如为动物血液、乳汁、唾液、精液；或心、肝、脾、肾或脑；所述植物 样品例如为植物的根、茎、叶、花、果实；所述微生物一般指藻类。
[0015] 根据本发明的一个优选的实施方式，所述生物机体组织和脏器样品的预处理步骤 包括能有效破坏生物机体的基质的任何方法。例如，动物血液应加抗凝剂（如枸橼酸盐、肝 素、草酸盐等）混匀，其余脏器或组织均需捣碎或匀浆均匀（不可加入生理盐水或其他含盐 溶液）；植物或微生物中含水量大的应匀浆均匀、含水量小的应粉碎过80目筛。
[0016] 经预处理的生物机体组织和脏器样品进一步进行酶解。根据本发明的一个优选的 实施方式，所述酶解按照如下步骤进行：在经预处理的生物机体样品中加入特制人工胃液 15~50ml，涡旋均勾，置37°C~55°C水浴中酶解4~48小时，以保证生物机体能完全在酶 的作用下分解成肽片段，将砷完全释放出来。
[0017] 本发明所述的特制人工胃液（硝酸配）的配制方法：取20ml~80ml稀硝酸，加水 约800ml与人工胃蛋白酶（酶活力大于等于1 : 27000) 10g，摇匀后，加水稀释成1000ml， 即得，优选加入32. 8ml稀硝酸；对于含角质的生物机体，如毛发、指甲等，需再加入2-5g角 蛋白酶。
[0018] 经酶解的生物机体组织和脏器样品进一步进行过滤。根据本发明的一个优选的实 施方式，所述过滤步骤采用双层滤膜进行或相应的大粒径单层滤膜分次进行。根据本发明 的一个特别优选的实施方式，所述双层滤膜的孔径大小约为10~15 μ m+2~3 μ m，以保证 大分子形态砷完全保留且不带入过多大分子有机基质。
[0019] 经过滤的生物机体组织和脏器样品进一步进行消解。根据本发明的一个优选的实 施方式，所述消解按照如下步骤进行：在经过滤的生物机体样品中加入硫酸1. 〇~4. 0ml， 加热板上加热至硫酸颜色变为无色，继续加热至硫酸至近干，加入硝酸2. 0~6. 0ml，加热 至酸液约lml (也可采用与之相当的常规消解方法），使大分子形态砷消解成离子砷，同时 消除有机基质对ICP-MS仪的基质干扰，保证总量砷含量的准确。此处硝酸和硫酸都是指纯 酸。
[0020] 通过上述步骤，可保证完全提取出生物机体组织和脏器中的总量砷。提取出的生 物机体组织和脏器中的总量砷采用灵敏度较高的电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS)进行 测定，根据本发明的一个优选的实施方式，所述ICP-MS的质谱条件为：采用同轴雾化器或 其他雾化器；以高纯液态氩气为工作气体和载气；以氦气或氢气作为反应气。
[0021] 本发明的另一个目的在于提供一种测定生物机体组织和脏器中价态砷含量的方 法，其特征在于该方法包括步骤：
[0022] (1)生物机体组织和脏器样品依次经过预处理、酶解和过滤，从而提取其中的价态 砷；
[0023] (2) HPLC-ICP-MS法测定生物机体组织和脏器样品中的价态砷含量。
[0024] 根据本发明的一个优选的实施方式，所述生物机体组织和脏器选自动物、植物和 微生物，其中动物样品例如为动物血液、乳汁、唾液、精液；或心、肝、脾、肾或脑；所述植物 样品例如为植物的根、茎、叶、花、果实；所述微生物一般指藻类。
[0025] 根据本发明的一个优选的实施方式，所述生物机体组织和脏器样品的预处理步骤 包括能有效破坏生物机体的基质的任何方法。例如，动物血液应加抗凝剂（如枸橼酸盐、肝 素、草酸盐等）混匀，其余脏器或组织均需捣碎或匀浆均匀（不可加入生理盐水或其他含盐 溶液）；植物或微生物中含水量大的应匀浆均匀、含水量小的应粉碎过80目筛。
[0026] 经预处理的生物机体样品进一步进行酶解。根据本发明的一个优选的实施方式， 所述酶解按照如下步骤进行：在经预处理的生物机体样品中加入特制人工胃液15~50ml， 涡旋均匀，置37°C~55°C水浴中酶解4~48小时，以保证生物机体能完全在酶的作用下分 解成肽片段，将价态砷完整释放出来。
[0027] 经酶解的生物机体组织和脏器样品进一步进行过滤。根据本发明的一个优选的实 施方式，所述过滤步骤采用双层滤膜进行或相应的大粒径单层滤膜分次进行。根据本发明 的一个特别优选的实施方式，所述双层滤膜的孔径大小约为10~15 μ m+2~3 μ m，以保证 大分子形态砷完全保留且不带入过多大分子有机基质。
[0028] 过滤之后，采用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法（HPLC-ICP-MS)测定生 物机体样品中的价态砷含量，此时的溶液中各种形态砷均以最原始状态存在，并且由于酶 与其结合的原因，状态较为稳定，故价态砷可通过色谱柱分离进行直接测定。
[0029] 根据本发明的一个优选的实施方式，所述HPLC-ICP-MS法的色谱条件为：色谱柱 为阴离子交换柱，优选Hamilton PRP-X100柱；以磷酸二氢铵溶液为流动相A，以水为流动 相B，进行梯度洗脱。优选所述流动相的流速为0. 7~1. 5ml/min，优选1.0ml/min ;所述磷 酸二氢铵溶液的pH值为6. 5~9. 0,优选8. 0。
[0030] 根据本发明的一个优选的实施方式，所述磷酸二氢铵溶液的浓度为0.01~ 0· 05mol/L，优选 0· 02mol/L。
[0031] 根据本发明的一个优选的实施方式，所述HPLC-ICP-MS法的质谱条件为：采用同 轴雾化器或其他雾化器；以高纯液氩为工作气体和载气；以氦气或氢气作为反应气。
[0032] 本实验通过采用欧共体标准物质局提供的金枪鱼标准物质BCR_627(含砷甜菜 52 ymol/kg，二甲基砷酸2. 0 ymol/kg，总量砷4. 8mg/kg)、英国食品分析能力评价体系 (FAPAS)提供的T07129海藻（含无机砷86~118mg/kg，总量砷119~162mg/kg)，对结果 进行验证，价态基本没有变化，另外还采用总量与消解所得结果（按国家标准操作）进行 比较，计算提取效率，基本达到90%以上。通过上述手段，可保证完全提取出生物机体中的 砷，并且保证砷价态的完整，真实反映了生物体内砷存在的形式，对研究雄黄的药效和毒理 提供了可靠的数据支撑，为探明雄黄在机体中发挥的作用和产生毒性的机制搭建了桥梁。
【附图说明】
[0033] 图1为价态砷对照品的高效液相色谱图，其中AsC、AsB、As(III)、DMA、MMA、As(V) 分别代表砷胆碱、砷甜菜碱、亚砷酸根、二甲基砷、一甲基砷、砷酸根；
[0034] 图2为欧共体标准物质局提供的金枪鱼标准物质BCR-627 (含砷甜菜52 μ mol/kg， 二甲基砷酸2. 0 μπιο?/kg，总量砷4. 8mg/kg)的高效液相色谱图；
[0035] 图3为英国食品分析能力评价体系（FAPAS)提供的T07129海藻（含无机砷86~ 118mg/kg，总量砷119~162mg/kg)的高效液相色谱图；
[0036] 图4为实施例2大鼠血中价态砷的高效液相色谱图；
[0037] 图5为实施例2大鼠肝中价态砷的高效液相色谱图；
[0038] 图6为实施例2大鼠肾中价态砷的高效液相色谱图；
[0039] 图7为实施例2大鼠心中价态砷的高效液相色谱图；
[0040] 图8为实施例2大鼠肺中价态砷的高效液相色谱图；
[0041] 图9为实施例2大鼠脑中价态砷的高效液相色谱图；
[0042] 图10为实施例2大鼠脾中价态砷的高效液相色谱图；
[0043] 图11为各脏器和组织中价态砷及总量砷与消解值（采用国家标准公认的测定法） 的比较图。
【具体实施方式】
[0044] 以下通过具体实施例来进一步阐述本发明，但以下具体实施例不对本发明构成任 何形式的限制。
[0045] 实施例1
[0046] 大鼠血、肝、肾、脑、心、脾、肺中总量砷的测定：按照电感耦合等离子体质谱法（中 国药典2010年版一部附录XI D)测定。
[0047] 试药和仪器
[0048] 美国Agilent公司7700ce型电感親合等离子体质谱仪；必能信超声（上海）有限 公司B9500S-DTH型超声波清洗机（功率300W，频率45kHz);美国Millipore公司Milli-Q 超纯水机。砷标准溶液（l〇〇〇mg/L，批号HC961324)，购自Merk公司。
[0049] 硝酸、盐酸均为优级纯（Merck公司）；胃蛋白酶为生化试剂，酶活力为1 : 27000， 批号为100710,购自上海惠兴生化试剂有限公司；胰酶为生化试剂，酪蛋白转化力多25. 0， 批号为F20100714,购自国药集团化学试剂有限公司；水为经Milli-Q处理的去离子水。高 纯液态氩气（纯度> 99. 99% )和氦气（纯度为99. 999% )由上海成功气体工业有限公司 提供。
[0050] ICP-MS 工作条件：
[0051] Agilent Micromist Nebulizer同轴雾化器；石英一体化炬管，2. 5mm中心通道； 石英双通道型雾化室；八级杆碰撞反应池；piltier半导体控温于约2°C ;镍采样锥和截取 锥；以高纯液氩为工作气体和载气；以氦气作为反应气。7700ce型电感耦合等离子体质谱 仪具体操作条件和采集参数见表1。
[0052] 表 1 Agilent 7700Ce ICP-MS 仪器工作参数
[0053]
[0054] 其中取浓度为2 μ g/L的对照砷溶液分别测定3~5次，测定值的RSD值应小于 5%〇
[0055] 对照品储备溶液的制备：精密称取于100 °C干燥2小时以上的三氧化二砷 (AS203) 0. 1320g，置1000ml量瓶中，加 10%氢氧化钠溶液10ml溶解后，再加 10%硫酸10ml， 用水稀释至刻度，摇匀，即得（每lml相当于0. lmg的砷）。
[0056] 精密称取于100°C干燥2小时以上的三氧化二砷（AS203)0. 1320g，置1000ml量瓶 中，加10%氢氧化钠溶液l〇ml溶解后，再加10%硫酸10ml，用水稀释至刻度，摇匀，即得 (每lml相当于0· lmg的砷）
[0057] 供试品溶液的制备：全血为抗凝全血；脏器或组织均需捣碎或匀浆均匀（不可加 入生理盐水或其他含盐溶液）。取抗凝全血lml、脏器或组织各0. 2g~0. 3g，精密称定， 按表2所列考察的试验因素和水平进行正交试验，具体操作按表3进行（分别加特制人工 胃液，涡旋均匀，放已到温度的水浴中酶解），取出，放冷，摇匀，放置2小时，取上清液滤过 (10 μ m+3 μ m滤膜），取滤液1~3ml，加入硫酸2. 0ml，加热板上加热至硫酸颜色变为无色， 继续加热至硫酸至近干，加入硝酸4. 0ml，加热至酸液约lml，取出，放冷，置10ml聚四氟乙 烯材料的量瓶中，用水稀释至刻度，离心，取上清液即得。同供试品溶液制备方法制备试剂 空白溶液。另同时取标准物质BCR-627和T07129各0. lg，按A3B3C3进行测定。
[0058] 待正交试验确定具体参数后，再进行重复性和准确度等试验。
[0059] 表2考察的试验因素和水平
[0060]
[0061] W1、人工胃液1 (硝酸配）：取16. 4ml稀硝酸（取105ml硝酸溶于1000ml水），加 水约800ml与人工胃蛋白酶10g，摇匀后，加水稀释成1000ml，即得。
[0062] W2、人工胃液2 (硝酸配）：取32. 8ml稀硝酸（取105ml硝酸溶于1000ml水），加 水约800ml与人工胃蛋白酶10g，摇匀后，加水稀释成1000ml，即得。
[0063] W3、人工胃液3 (硝酸配）：取49. 2ml稀硝酸（取105ml硝酸溶于1000ml水），加 水约800ml与人工胃蛋白酶10g，摇匀后，加水稀释成1000ml，即得。
[0064] 表3 L9 (34)正交设计试验优选总量砷体内提取结果
[0067] 测定：测定时选取的同位素为75As，以72Ge作为内标，选择碰撞池反应模式并根据 不同仪器的要求选用适宜校正方程对测定的元素进行校正。
[0068] 仪器的内标进样管在仪器分析工作过程中始终插入内标溶液中，依次将仪器的样 品管插入各个浓度的对照品溶液中进行测定（浓度依次递增），取每一浓度测得三次读数 的平均值为纵坐标，相应浓度为横坐标，绘制对照曲线。再将仪器的样品管插入供试品溶液 中，测定，取三次读数的平均值。从对照曲线上读出供试品溶液中 75As的浓度，扣除相应的 试剂空白溶液的浓度，计算样品中砷元素的含量。
[0069] 测定结果见表4~表10,分析结果见表11。
[0070] 1)正交试验
[0071] 表4大鼠血L9 (34)正交设计试验优选总量砷体内提取结果
[0072]
[0073] 表5大鼠肝L9 (34)正交设计试验优选总量砷体内提取结果
[0074]
[0076] 表6大鼠肾L9 (34)正交设计试验优选总量砷体内提取结果
[0077]
[0078] 表7大鼠脑L9 (34)正交设计试验优选总量砷体内提取结果
[0079]
[0080] 表8大鼠心L9 (34)正交设计试验优选总量砷体内提取结果
[0081]
[0082] 表9大鼠脾L9 (34)正交设计试验优选总量砷体内提取结果
[0083]
[0084] 表10大鼠肺L9 (34)正交设计试验优选总量砷体内提取结果
[0085]
[0086] 表11总量砷正交试验结果分析
[0087]
[0088] 2)重复性试验
[0089] 分别按正交试验确定的条件对大鼠血、肝、肾、脑、心、脾、肺中总量砷测定，一式六 份，结果见表12。
[0090] 表12大鼠血、肝、肾、脑、心、脾、肺中总量砷重复性试验结果
[0091]
[0093] 3)准确度试验
[0094] 分别取重复性试验项下大鼠血、肝、肾、脑、心、脾、肺，加入低、中、高3个浓度水平 的砷对照品溶液，一式三份，共九份，按正交试验确定的条件分别测定其中总量砷，计算加 样回收率，结果见表13。
[0095] 表13大鼠血、肝、肾、脑、心、脾、肺中总量砷准确度试验结果
[0096]
[0097] 实施例2
[0098] 大鼠血、肝、肾、脑、心、脾、肺中价态砷的测定：按照高效液相色谱法（中国药典 2010年版一部附录VI D)和电感耦合等离子体质谱法（附录XI D)测定。
[0099] 试药和仪器
[0100] 美国Agilent公司7700ce型电感親合等离子体质谱仪；美国Agilent公司1100 型液相色谱仪；必能信超声（上海）有限公司B9500S-DTH型超声波清洗机（功率300W，频 率45kHz);美国Millipore公司Milli-Q超纯水机。
[0101] 亚砷酸根溶液标准物质[As(III)，As033 L011ymol/g，GBW08666,批号 0901]; 砷酸根溶液标准物质[As(V)，As043- = 0. 233 μπιο?/g，GBW08667,批号0901];-甲基砷溶 液标准物质[MMA，CH3As0 32 = 0. 355 μπιο?/g，GBW08668,批号0803];二甲基砷溶液标准物 质[DMA，CH3CH2As0 2 = 0 . 706 ymol/g，GBW08669,批号 0803];砷胆碱溶液标准物质[AsC， C5H14AsBrO = 0· 374 μπιο?/g，GBW08671，批号 0803]、砷甜菜碱溶液标准物质[AsB，C5HnAs02 =0. 518 μ mol/g，GBW08670,批号0803]，均购于国家标准物质中心。三碘化砷标准品[AsI3， 批号J14N53]、五氧化二砷标准品[As 205，批号J16P58]，均购于A Johnson Matthey公司。 7Li、S9Y、14°Ce、 2°5Tl调谐液购于美国Agilent公司。
[0102] 硝酸、盐酸均为优级纯，购自德国Merck公司；磷酸二氢铵、磷酸、氨水均为优级 纯，均购自国药集团化学试剂有限公司；水为经Milli-Q处理的去离子水。高纯液态氩气 (纯度> 99. 99% )和氦气（纯度为99. 999% )由上海成功气体工业有限公司提供。
[0103] HPLC-ICP-MS 工作条件：
[0104] 电感耦合等离子体质谱：
[0105] Agilent Micromist Nebulizer同轴雾化器；石英一体化炬管，2. 5mm中心通道； 石英双通道型雾化室；八级杆碰撞反应池；piltier半导体控温于约2°C ;镍采样锥和截取 锥；以高纯液氩为工作气体和载气；以氦气作为反应气。7700x型电感耦合等离子体质谱仪 具体操作条件和采集参数见表1。
[0106] 高效液相色谱：
[0107] 色谱柱为 Hamilton PRP-X100(250X4. 1mm ;10 μπι);以 0· 025mol/L 磷酸二氢铵溶 液（调节pH值至8. 0)为流动相A，以水为流动相B，按表14进行梯度洗脱；流速为1. 0ml/ min〇
[0108] 表14砷价态的液相梯度洗脱程序
[0109]
[0110] 对照品储备溶液的制备：取亚砷酸根（As(III))、砷酸根（As(V))、一甲基砷 (MMA)、二甲基砷（DMA)、砷胆碱（AsC)、砷甜菜碱（AsB)对照品适量，用流动相制成每1L各 含5mg的混合溶液，即得。
[0111] 对照曲线溶液的制备：精密量取对照品储备溶液适量，分别用流动相制成每L含 0 μ g、4 μ g、20 μ g、40 μ g、100 μ g、200 μ g、400 μ g、800 μ g 的一系列对照溶液，艮P得。
[0112] 供试品溶液的制备：全血为抗凝全血；脏器或组织均需捣碎或匀浆均匀（不可加 入生理盐水或其他含盐溶液）。取抗凝全血lml，脏器或组织各0. 2g~0. 3g，精密称定， 按表2所列考察的试验因素和水平进行正交试验，具体操作按表3进行（分别加特制人工 胃液，涡旋均匀，放已到温度的水浴中酶解），取出，放冷，摇匀，放置2小时，取上清液滤过 (10μπι+3μπι滤膜），取滤液即得。同供试品溶液制备方法制备试剂空白溶液。另同时取标 准物质BCR-627和Τ07129各0. lg，按A3B3C3进行测定。
[0113] 待正交试验确定具体参数后，再进行重复性和准确度等试验。
[0114] 测定：取混合对照溶液，注入液相色谱仪，六种不同形态的砷应能完全分开，对照 图谱见附图1。
[0115] 分别精密吸取一系列对照曲线溶液（浓度依次递增）与供试品溶液各20 μ 1，注 入液相色谱仪，色谱柱流出液体直接进入电感耦合等离子体质谱仪的雾化器，选取同位素 为75As，选择碰撞池反应模式并根据不同仪器的要求选用适宜校正方程对测定的元素进行 校正。以各对照曲线溶液测得不同形态的砷峰面积值为纵坐标，相应浓度为横坐标，绘制对 照曲线。如供试品溶液中出现与对照曲线保留时间相同的色谱峰，则根据相应的对照曲线 读出供试品溶液中的不同形态砷浓度，计算出样品中不同形态砷的含量，并折算成砷元素 的含量。
[0116] 测定结果见表15~表21，分析结果见表22。
[0117] 1)正交试验
[0118] 表15大鼠血L9(34)正交设计试验优选价态砷体内提取结果
[0119]
[0121] 表16大鼠肝L9 (34)正交设计试验优选价态砷体内提取结果
[0122]
[0123] 表17大鼠肾L9 (34)正交设计试验优选价态砷体内提取结果
[0124]
[0125] 表18大鼠脑L9 (34)正交设计试验优选价态砷体内提取结果
[0126]
[0127] 表19大鼠心L9 (34)正交设计试验优选价态砷体内提取结果
[0128]
[0129] 表20大鼠脾L9 (34)正交设计试验优选价态砷体内提取结果
[0130]
[0131] 表21大鼠肺L9 (34)正交设计试验优选价态砷体内提取结果
[0132]
[0136] 2)重复性试验
[0137] 分别按正交试验确定的条件对大鼠血、肝、肾、脑、心、脾、肺中价态砷测定，一式六 份，结果见表23~表29,结果表明，上述七种生物组织中的价态砷以As (III)、二甲基砷 (DMA)和一甲基砷（MMA)为主，仅肝中存在少量的砷甜菜碱（AsB)，上述七种生物组织中均 未检出砷酸根（As (V))和砷胆碱（AsC)。
[0138] 表23大鼠血中价态砷含量测定的重复性试验结果（单位:mg/kg)
[0139]
[0140] 表24大鼠肝中价态砷含量测定的重复性试验结果（单位：mg/kg)
[0141]
[0142] 表25大鼠肾中价态砷含量测定的重复性试验结果（单位:mg/kg)
[0143]
[0145] 表26大鼠脑中价态砷含量测定的重复性试验结果（单位：mg/kg)
[0146]
[0147] 表27大鼠心中价态砷含量测定的重复性试验结果（单位:mg/kg)
[0148]
[0149] 表28大鼠脾中价态砷含量测定的重复性试验结果（单位：mg/kg)
[0150]
[0151] 表29大鼠肺中价态砷含量测定的重复性试验结果（单位：mg/kg)
[0154] 3)准确度试验
[0155] 分别取重复性试验项下大鼠血、肝、肾、脑、心、脾、肺，加入低、中、高3个浓度水平 的砷对照品溶液，一式三份，共九份，按正交试验确定的条件分别测定其中的价态砷，计算 加样回收率，结果见表30~表36。
[0156] 表30大鼠血中价态砷含量测定的准确度试验结果
[0157]
[0158] 表31大鼠肝中价态砷含量测定的准确度试验结果
[0159]
[0160] 表32大鼠肾中价态砷含量测定的准确度试验结果
[0161]
[0162] 表33大鼠脑中价态砷含量测定的准确度试验结果
[0163]
[0164] 表34大鼠心中价态砷含量测定的准确度试验结果
[0165]
[0166] 表35大鼠脾中价态砷含量测定的准确度试验结果
[0167]
[0168] 表36大鼠肺中价态砷含量测定的准确度试验结果
[0169]
[0170] 4)样品测定结果比较分析
[0171] 分别按正交试验确定的条件对大鼠血、肝、肾、脑、心、脾、肺中总量砷和价态砷进 行测定，同时按中国药典2010年版一部附录IX B铅、镉、砷、砷、铜测定法中电感耦合等离 子体质谱法测定，结果见表37。
[0172] 表37结果比较分析
[0173]
(
[0174] 从附图11可见，总量的提取率均在90%以上，说明提取较完全，提取率均未超出 110%，说明已完全消除基质了基质的干扰。价态的提取率除脑外，其余提取率均与总量提 取率相当，说明生物机体在其余脏器中砷的存在基本以这六种价态形式存在，脑的提取率 只有75%，但总量达100%，说明脑中砷可能还以其他形式存在。
[0175] 无机砷的百分率说明砷在不同脏器中的分布不同，无机砷主要分布在肝、砷两个 器官中，并以As (III)的形式为主，As (V)和有机砷较少，其余器官中砷主要以DMA的形式 存在，其他形式较少。
[0176] 肝是人体主要的代谢器官，所含的砷有As (III)、As (V)、DMA、MMA形式，其中 As (III)约占总量砷的90 %，因雄黄进入体内的主要是As (III)，说明砷主要是由肝代谢 的，文献报道，人体代谢As (III)主要是甲基化，生成MMA和DMA，但肝中MMA和DMA含量不 高，DMA主要集中于脾和血，说明经肝代谢后的DMA，可能主要通过脾和血运输到全身各器 官。
[0177] 肾中砷的分布基本与肝相似，以AS(III)为主，说明肾排泄砷以无机砷为主。由于 肝、肾中主要以无机砷为主，故雄黄产生毒性的器官主要是肝肾。
[0178] 脑中砷的含量较少，但是无机砷所占比例较高，约占总量砷的75%，其中As(m) 与As(V)的比例约为1 : 3,因此在雄黄大量服用或长期服用的情况下，会造成神经系统的 损害。
【主权项】
1. 测定生物机体中总量砷含量的方法，其特征在于该方法包括步骤： (1) 生物机体样品依次经过预处理、酶解、过滤和消解，从而提取其中的砷； (2) ICP-MS法测定生物机体样品中的总量砷含量。2. 根据权利要求1所述的测定生物机体中总量砷含量的方法，其特征在于所述生物机 体选自动物、植物和微生物。3. 根据权利要求1所述的测定生物机体中总量砷含量的方法，其特征在于所述预处理 包括能有效破坏生物机体的基质的步骤。4. 根据权利要求1所述的测定生物机体中总量砷含量的方法，其特征在于所述酶解包 括在经预处理的生物机体样品中加入特制人工胃液15~50ml，涡旋均匀，置37°C~55°C水 浴中酶解4~48小时的步骤。5. 根据权利要求1所述的测定生物机体中总量砷含量的方法，其特征在于所述过滤采 用双层滤膜或相应的大粒径单层滤膜分次进行。6. 根据权利要求5所述的测定生物机体中总量砷含量的方法，其特征在于所述双层滤 膜的孔径大小约为10~15 μ m+2~3 μ m或相应孔径的大粒径单层滤膜。7. 根据权利要求1所述的测定生物机体中总量砷含量的方法，其特征在于所述消解包 括在经过滤的生物机体样品中加入硫酸1. 0~4. 0ml，加热板上加热至硫酸颜色变为无色， 继续加热至硫酸至近干，加入硝酸2. 0~6. 0ml，加热至酸液约lml的步骤。8. 根据权利要求1所述的测定生物机体中总量砷含量的方法，其特征在于所述ICP-MS 的质谱条件为：采用同轴雾化器或其他雾化器；以高纯液态氩气为工作气体和载气；以氦 气或氢气作为反应气。9. 测定生物机体中价态砷含量的方法，其特征在于该方法包括步骤： (1) 生物机体样品依次经过预处理、酶解和过滤，从而提取其中的价态砷； (2) HPLC-ICP-MS法测定生物机体样品中的价态砷含量。10. 根据权利要求9所述的测定生物机体中价态砷含量的方法，其特征在于所述生物 机体选自动物、植物和微生物。11. 根据权利要求9所述的测定生物机体中价态砷含量的方法，其特征在于所述预处 理包括能有效破坏生物机体的基质的步骤。12. 根据权利要求9所述的测定生物机体中价态砷含量的方法，其特征在于所述酶解 包括在经预处理的生物机体样品中加入特制人工胃液15~50ml，涡旋均匀，置37°C~55°C 水浴中酶解4~48小时的步骤。13. 根据权利要求9所述的测定生物机体中价态砷含量的方法，其特征在于所述过滤 采用双层滤膜或相应的大粒径单层滤膜分次进行。14. 根据权利要求13所述的测定生物机体中价态砷含量的方法，其特征在于所述双层 滤膜的孔径大小约为10~15 μ m+2~3 μ m或相应孔径的大粒径单层滤膜。15. 根据权利要求9所述的测定生物机体中价态砷含量的方法，其特征在于，所述 HPLC-ICP-MS法的色谱条件为：色谱柱为阴离子交换柱；以磷酸二氢铵溶液为流动相A，以 水为流动相B，进行梯度洗脱。16. 根据权利要求15所述的测定生物机体中价态砷含量的方法，其特征在于，所述色 谱柱为Hamilton PRP-X100柱或其他性能相近的色谱柱。17. 根据权利要求15所述的测定生物机体中价态砷含量的方法，其特征在于，所述流 动相的流速为0. 7~1. 5ml/min，优选1.0ml/min。18. 根据权利要求15所述的测定生物机体中价态砷含量的方法，其特征在于，所述磷 酸二氢铵溶液的pH值为6. 5~9. 0,优选8. 0。19. 根据权利要求15所述的测定生物机体中价态砷含量的方法，其特征在于，所述磷 酸二氢铵溶液的浓度为〇· 01~〇· 〇5mol/L，优选0· 02mol/L〇20. 根据权利要求9所述的测定生物机体中价态砷含量的方法，其特征在于，所述 HPLC-ICP-MS法的质谱条件为：采用同轴雾化器或其他雾化器；以高纯液氩为工作气体和 载气；以氦气或氢气作为反应气。
【文档编号】G01N27/64GK105866231SQ201510026383
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2015年1月19日
【发明人】季申, 夏晶, 李丽敏, 胡青, 曹帅, 陈虹, 苗水, 毛秀红, 毛丹, 孙健, 周恒 , 于泓, 仇佳思, 杨盈盈, 杨文婷
【申请人】上海市食品药品检验所