亚硫酸盐的作用
【专利摘要】本发明公开了亚硫酸盐的作用，其能够促进肝细胞分泌极低密度脂蛋白。本发明的有益之处在于：本发明证实了亚硫酸盐能够促进肝细胞VLDL的分泌，这就提示亚硫酸盐很可能与动脉粥样硬化等心血管疾病相关，提示人们在食用含有亚硫酸盐添加剂的食品时要注意安全使用量，这对于保障人群健康有很大的借鉴意义。
【专利说明】
亚硫酸盐的作用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种化学物质的作用，具体涉及亚硫酸盐的作用，属于化学技术领域。
【背景技术】
[0002] 亚硫酸盐是一种在食品、药品中极为常见的添加剂，其广泛使用在干果和葡萄酒、 啤酒等饮料中，也被添加于氨基酸输注液中，此外还是中药硫磺熏蒸后的常见残留物。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于研究亚硫酸盐是否能够促进肝细胞极低密度脂蛋白（VLDL)的 分泌。
[0004] 为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
[0005] 亚硫酸盐的作用，其特征在于，能够促进肝细胞分泌极低密度脂蛋白。
[0006] 前述的亚硫酸盐的作用，其特征在于，采用酶联免疫吸附法检测亚硫酸盐处理肝 细胞后细胞外培养上清中VLDL的含量。
[0007] 前述的亚硫酸盐的作用，其特征在于，采用磷钨酸盐沉淀、蛋白杂交法检测亚硫酸 盐处理肝细胞后细胞外培养上清中VLDL的含量。
[0008] 本发明的有益之处在于:本发明证实了亚硫酸盐能够促进肝细胞VLDL的分泌，这 就提示亚硫酸盐很可能与动脉粥样硬化等心血管疾病相关，提示人们在食用含有亚硫酸盐 添加剂的食品时要注意安全使用量，这对于保障人群健康有很大的借鉴意义。
【附图说明】
[0009] 图1是不同浓度亚硫酸盐对HL-7702肝细胞VLDL分泌的影响。
【具体实施方式】
[0010] 以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
[00?1 ]目如，只有文献提不亚硫酸盐能够引起尚脂血症，但对引起尚脂血症可能的原因 缺乏深入研究。临床上常见病人因VLDL分泌增加而导致高脂血症，为研究亚硫酸盐是否也 通过此途径实现这种作用，本发明检测了亚硫酸盐处理肝细胞后肝细胞外的VLDL含量。
[0012] 一、酶联免疫吸附法
[0013] ( - )实验分组
[0014] 依据细胞毒性实验观察结果，将Na2S03处理组浓度调整为10mM、2.5mM、0.5mM、 O.lmM，同时设阴性对照组（完全培养基）及阳性对照组（ImM油酸（0A)，10mM四氯化碳 (CCl4))〇
[0015] (二)培养细胞
[0016] 选对数生长期的细胞用于实验，细胞常规消化，单细胞悬液以5 X104/ml分7组接 种于24孔培养板中，每孔加lml细胞悬液，每组设两个复孔。实验重复三次。置37 °C、5 %⑶2 培养箱培养24h。
[0017](三)细胞染毒
[0018] 24h待细胞贴壁后进行染毒，弃去旧液，实验组加lml Na2S03工作液（终浓度为 10mM、2.5mM、0.5mM、0.1 mM)，阴性对照组和阳性对照组分别加lml完全培养基和终浓度为 ImM 0A和10mM CC14,将24孔板置C02培养箱中培养至既定染毒时间。染毒结束后，收集细胞 培养上清液，离心后-80°C冰箱保存备用。
[0019](四）试验检测
[0020] 按照VLDL检测试剂盒说明进行酶联免疫吸附试验检测，具体的操作过程如下：
[0021] 1、稀释：将标准品原液用标准品的稀释液梯度稀释至所用浓度，分别为1600ng/ ml、800ng/ml、400ng/ml、200ng/ml、100ng/ml。
[0022] 2、加样:每个孔均需作复孔，包括标准品孔以及空白孔。①空白孔:不加任何样品， 也不加任何试剂。②标准品孔:加入标准品50μ1，链霉亲和素-HRP 50μ1。③待测样品孔:加 入样品40μ1，抗VLDL抗体10μ1，链霉亲和素-HRP 50μ1。盖好封板膜，轻轻震荡混匀，37°C温 水孵育60分钟。
[0023] 3、配液:将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。
[0024] 4、洗涤:轻轻的揭掉封板膜，吸弃液体，甩干，之后，每孔加满洗涤液，室温静至30s 后，弃去洗涤液，重复此操作5次，拍干。
[0025] 5、显色:每孔先加入显色剂Α 50μ1，再加入显色剂Β 50μ1，轻轻震荡混匀，37°C避 光显色10min。之后每孔加50μ1终止液，终止反应，此时的蓝色立即转变为黄色。
[0026] 6、测定：以空白管调零，450nm波长依次测量各孔的吸光度值(0D值）。测定应该在 加入终止液lOmin内进行。
[0027] 7、计算：根据标准品的浓度，以及相对应的0D值，计算出标准曲线的直线回归方 程，再根据样品的0D值，在回归方程上计算出对应的样品浓度。
[0028](五)检测结果
[0029] 我们采用酶联免疫吸附法对亚硫酸盐处理肝细胞后细胞外培养上清中VLDL的含 量的检测结果见表1。
[0030] 表1不同浓度亚硫酸钠盐HL-7702肝细胞VLDL(ymol/L)分泌水平的影响（n = 3，
[0032] 注：*与阴性对照组比较，Ρ〈0·05
[0033] 由表1中的检测结果我们发现:亚硫酸盐能够引起正常培养的肝细胞VLDL分泌水 平增加。
[0034]二、磷钨酸盐沉淀、蛋白杂交法
[0035](一)磷钨酸盐沉淀法沉淀细胞培养上清中VLDL
[0036] 1、将细胞常规接种于6孔细胞培养板，染毒浓度同酶联免疫吸附试验，每组两个复 孔，实验重复三次。染毒24h、48h后，收集培养上清。参照文献方法，进行细胞培养上清中 VLDL的沉淀：即每2ml上清中加入2ml磷钨酸钠-氯化镁(4:1，V/V)工作液。室温孵育5min后， 4000r/min离心 15min〇
[0037] 2、小心吸弃上清，视沉淀量，加入50-100μ1上样缓冲液（1 X loading buffer)，充 分混勾，l〇〇°C煮蛋白lOmin后，混旋，4°C，9500r/min离心15min，取5μ1上清进行TCA蛋白定 量。
[0038](二)蛋白杂交试验检测VLDL含量
[0039] 1、SDS-PAGE凝胶配制：使用梯度混合器配制5%-18%梯度胶。原理是根据不同的 推进速度而将两种不同浓度的胶加以混合而成。
[0040] 具体的过程如下：
[0041] (1)在制板支架上装配好玻璃凝胶板。
[0042] (2)用直径约2mm的聚乙烯管连接好梯度混合器、恒流栗、凝胶模。
[0043] (3)取两个50ml离心管分别配制5%和18%分离胶。
[0044] (4)灌制梯度月父：
[0045] 将两胶液中摇匀，分别吸取18ml胶液于梯度混合器相应的混合杯中。关闭混合阀 门和输出阀门，将18 %分离胶倒入左杯，打开混合阀门让溶液经过通道渗入右杯，立即关闭 混合阀门。将5%分离胶倒入右杯，使两杯液位相同，然后打开混合阀门，使两液面保持平 衡。打开磁力搅拌器和梯度混合器开关，接通恒流栗，将梯度混合器中的胶液缓缓输入胶腔 中。使凝胶从顶部到底部丙烯酰胺的浓度由上至下逐渐升高，通常顶部凝胶浓度为5%，底 部凝胶浓度为18 %。事先应将输液管出口由胶腔上口中央伸向底部，随着胶腔内液面的升 高逐渐提高输液管，使管口始终接近液面而不伸入液体内部。灌胶的流速要适当，以管口流 出液对液面不形成冲击为好。
[0046] (5)灌胶完毕后，在液面上小心地加入异丙醇约lml封闭胶面。静置40min左右即可 聚合。
[0047] (6)待凝胶聚合后，倒掉异丙醇溶液，用滤纸条吸干上层残留液，配制5%浓缩胶， 轻轻摇匀后吸取5ml加到梯度胶上，迅速插入样品梳，样品梳下沿刚好触及梯度胶面为宜， 静置聚合约30min。
[0048] (7)凝胶聚合后，拔掉样品梳，装好电泳槽，在槽中注入电泳缓冲液待上样。
[0049] 2、样品处理：将收集的蛋白样品100°C或沸水浴加热lOmin，以充分变性蛋白。混 旋，4°C，9500r/min离心15min后待上样。
[0050] 3、上样与电泳:取蛋白样品10yg上样，5% -18 %梯度胶进行SDS-PAGE蛋白电泳。上 层胶时使用80V电压恒压电泳，在溴酚蓝进入下层胶时使用90V电压恒压电泳。根据预染蛋 白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后停止电泳。
[0051 ] 4、转膜:使用标准湿式转膜装置。设定转膜电流为400mA恒流转膜lh 30min，表达 产物电转移至硝酸纤维素膜。转膜会有发热现象，将转膜槽放置在冰浴中进行转膜。
[0052] 5、封闭：转膜完毕后，立即把载有蛋白的硝酸纤维素膜放置于5%脱脂奶粉封闭液 中，室温摇床封闭2h。
[0053] 6、一抗孵育:吸尽封闭液，加入稀释好的一抗，室温摇床缓慢摇动孵育20min后4 °C 两次过夜。PBST洗膜lOmin X 3次。
[0054] 7、二抗孵育：吸尽洗涤液，加入稀释好的二抗，室温摇床上缓慢摇动孵育2小时。 PBST 洗膜 10minX3次。
[0055] 8、蛋白表达水平检测:参考相关说明书，使用化学发光法(ECL发光法)来检测各处 理组VLDL的表达水平。采用专用的压片暗盒进行压片，根据蛋白信号强弱，采用不同曝光时 间。用显影定影试剂盒自行配制显影液和定影液进行手工洗片。胶片显影后通过Image-Pro Plus 6.0软件对杂交图进行光密度值半定量分析，以判断不同处理组VLDL分泌情况。
[0056] 9、检测结果：
[0057]我们采用磷钨酸盐沉淀、蛋白杂交法对亚硫酸盐处理肝细胞后细胞外培养上清中 VLDL的含量的检测结果见图1。
[0058]由图1所显示的检测结果我们发现:亚硫酸盐能够引起正常培养的肝细胞VLDL分 泌水平增加。
[0059] 三、结论：
[0060]我们采用酶联免疫吸附法(elisa)和磷钨酸盐沉淀、蛋白杂交法这两种被广泛认 可的方法检测亚硫酸盐处理肝细胞后细胞外培养上清中VLDL的含量，证实了亚硫酸盐能够 促进肝细胞VLDL的分泌，这就提示亚硫酸盐很可能与动脉粥样硬化等心血管疾病相关，提 示人们在食用含有亚硫酸盐添加剂的食品时要注意安全使用量，这对于保障人群健康有很 大的借鉴意义。
[0061]需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变 换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 亚硫酸盐的作用，其特征在于，能够促进肝细胞分泌极低密度脂蛋白。2. 根据权利要求1所述的亚硫酸盐的作用，其特征在于，采用酶联免疫吸附法检测亚硫 酸盐处理肝细胞后细胞外培养上清中VLDL的含量。3. 根据权利要求1所述的亚硫酸盐的作用，其特征在于，采用磷钨酸盐沉淀、蛋白杂交 法检测亚硫酸盐处理肝细胞后细胞外培养上清中VLDL的含量。
【文档编号】G01N33/92GK105866446SQ201610227426
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月13日
【发明人】白剑英, 雷佩玉
【申请人】山西医科大学