液相色谱用填充剂及液相色谱用柱的制作方法
【专利摘要】本发明的课题在于提供耐久性优异的液相色谱用填充剂及填充了该填充剂的液相色谱用柱。作为解决方法，提供一种液相色谱用填充剂，其特征在于，在含有聚乙烯醇树脂的亲水性的树脂上经由间隔基键合有式(1)(R1表示氢原子、或碳原子数1～4的烷基，R2表示具有1个以上羟基的碳原子数1～6的烷基。※表示与间隔基的键合位置。)表示的氨基。
【专利说明】
液相色谱用填充剂及液相色谱用柱
技术领域
[0001] 本发明涉及耐久性优异的液相色谱用填充剂及填充有该填充剂的液相色谱用柱。
【背景技术】
[0002] 糖类在食品中等含有较多，其分析在食品产业等中极为重要。而且，其分析中广泛 使用液相色谱。利用液相色谱进行的糖类的分析中，主要使用配体交换柱、亲水性相互作用 柱。
[0003] 在使用了配体交换柱的分析中，为了抑制端基差向异构体分离，需要在高温条件 下进行分析。例如，在日本特开昭61 - 71354号公报(专利文献1)中，公开了以使用了银及碱 (土)金属离子作为磺酸基的抗衡离子的离子交换树脂粒子作为填充剂的柱。在该专利文献 1中，在柱温60°C的条件下进行分离。但是，在该高温下，在填充剂上离子键合的金属离子易 于脱离，存在填充剂经时变化的问题。
[0004] 在使用了亲水性相互作用柱的情况下，存在使用了由聚丙烯酰胺树脂形成的填充 剂的柱(例如日本特开2006 -137944号公报:专利文献2)。但是，与配体交换柱同样地，为了 抑制端基差向异构体分离，需要为高温条件。
[0005] 另一方面，如果使用利用了键合有氨基的填充剂的柱（以下称为氨基柱），则利用 氨基的碱性能够抑制端基差向异构体分离，不需要为高温条件，因此氨基柱在糖分析中被 广泛应用。（J.C.Linden et al.J.Chromatogr.A 105(1975)125 -133)但是，大部分氨基柱 在基材中使用硅胶，键合有氨基的硅胶的稳定性差，柱的耐久性方面存在问题。
[0006] 作为使其键合有氨基、且具有化学稳定性的材料，有使用有机高分子载体的材料。 作为在有机高分子载体上键合有氨基的材料，在聚丙烯酸酯系树脂、苯乙烯-二乙烯基苯共 聚物树脂上键合有N-甲基-D -葡糖胺的化合物被用作金属、硼的吸附材料。（J. Sanchez et al.J.APPL POLY.SCI.129(2013)1541-1545^J.Sanchez et al.J.APPL POLY.SCI.126 (2012)1475-1483)
[0007] 但是，如果将使用了聚丙烯酸酯系树脂、苯乙烯-二乙烯基苯共聚物树脂的材料应 用于氨基柱，则存在亲水性低、糖类的分离不充分这样的问题。
[0008] 现有技术文献
[0009] 专利文献
[0010] 专利文献1:日本特开昭61 -71354号公报
[0011] 专利文献2:日本特开2006 -137944号公报
[0012]非专利文献
[0013] 非专利文献l:J.Sanchez et al.J.APPL P0LY.SCI.129(2013)1541 -1545
[0014] 非专利文献2:J.Sanchez et al.J.APPL P0LY.SCI.126(2012)1475 -1483
【发明内容】
[0015] 发明所要解决的课题
[0016] 本发明的目的在于提供耐久性优异、即使反复进行分析也不发生经时变化的适于 氨基柱的填充剂。
[0017] 用于解决课题的方法
[0018] 本申请的发明人们为了实现上述课题反复进行了研究，由此发现，通过使用将含 有聚乙烯醇树脂的亲水性的树脂作为基材、并导入有特定的氨基的填充剂，能够改善氨基 柱的耐久性，从而完成了本发明。
[0019] 即本发明涉及以下事项。
[0020] [1] -种液相色谱用填充剂，其特征在于，在含有聚乙烯醇树脂的亲水性的树脂上 经由间隔基(spacer)键合有式（1)所示的氨基。
[0021] 式（1);
[0022]
[0023] (R1表示氢原子、或碳原子数1~4的烷基，R2表示具有1个以上羟基的碳原子数1~6 的烷基。※表示与间隔基的键合位置。）
[0024] [2]根据[1]的液相色谱用填充剂，其中，R1为氢原子或甲基。
[0025] [3]根据[1]或[2]的液相色谱用填充剂，其中，R2为式(2)所示的结构。
[0026] ι?、
[0027]
[0028](式中，η表示0~4的整数）
[0029] [4]根据[1]的液相色谱用填充剂，其中，式（1)所示的氨基来源于由D-葡糖胺、N-甲基-D-葡糖胺、1-氨基-1-脱氧-D-甘露糖醇、1-氨基-1-脱氧-D-半乳糖醇、1-氨基-1-脱 氧-D-艾杜糖醇、1-氨基-1-脱氧-D-阿糖醇、1-氨基-1-脱氧-D-木糖醇、4-氨基-1，2,3-丁三 醇、3-氨基-1，2-丙二醇、3-甲基氨基-1，2-丙二醇组成的组中的任一种胺。
[0030] [5]根据[1]的液相色谱用填充剂，其中，间隔基来源于末端具有缩水甘油基的化 合物。
[0031] [6]-种液相色谱用柱，其使用了上述[1]~[5]的液相色谱用填充剂。
[0032] [7]-种糖分析用液相色谱用柱，其使用了上述[1]~[5]的液相色谱用填充剂。
[0033] [8]-种亲水性相互作用色谱用柱，其使用了上述[1]~[5]的液相色谱用填充剂。
[0034]发明的效果
[0035]本发明的液相色谱用填充剂在糖类的分析中不需要高温条件，在30~50°C这样的 低温下也显示优异的分离。另外，也能够对糖类以外的各种亲水性化合物进行分离。进而， 具有碱耐性，与现有的氨基柱相比，在重现性、耐久性方面优异。
【附图说明】
[0036]图1表示针对实施例1的填充剂进行果糖、甘露糖、葡萄糖及蔗糖这4种糖类的分析 而得的色谱图。
[0037] 图2表示针对实施例1的填充剂的稳定性试验结果。
[0038] 图3表示针对实施例2的填充剂进行4种糖类的分析而得的色谱图。
[0039] 图4表示针对实施例3的填充剂进行4种糖类的分析而得的色谱图。
[0040] 图5表示针对比较例2的填充剂进行4种糖类的分析而得的色谱图。
[0041] 图6表示针对实施例1的填充剂进行果糖、半乳糖、乳果糖、依匹乳糖 (epilactose)、乳糖这5种糖类的分析而得的色谱图。
[0042] 图7表示对分析例6变更洗脱液而进行5种糖类的分析而得的色谱图。
【具体实施方式】
[0043] 本发明的液相色谱用填充剂为在亲水性的树脂上经由间隔基键合有式（1)所示的 氨基的粒子。
[0044] 式⑴
[0045]
[0046] (式中，R1表示氢原子、或碳原子数1~4的烷基，R2表示具有一个以上羟基的碳原子 数1~6的烷基。※表示与间隔基的键合位置）。此时，R 1优选为氢原子或甲基。
[0047]另外，R2优选为式(2)表示的羟基烷基，更优选η为4。
[0048]
[0049] (式中，η表示0~4的整数）
[0050] 另外，作为式（1)所示的氨基，优选来源于下述胺类中的任一种:D_葡糖胺、N-甲 基-D-葡糖胺、1-氨基-1-脱氧-D-甘露糖醇、1-氨基-1-脱氧-D-半乳糖醇、1-氨基-1-脱氧_ D-艾杜糖醇、1-氨基-1-脱氧-D-阿糖醇、1-氨基-1-脱氧-D-木糖醇、4-氨基-1，2,3-丁三醇、 3_氨基-1，2-丙二醇、3-甲基氨基-1，2-丙二醇。这些胺类的键合于氮上的1个氢脱离，与间 隔基键合。本发明中，是使这些胺类键合于间隔基上，但另外还可以经由间隔基将氨键合于 亲水性树脂上后，使用氰基硼氢化钠将葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖等醛糖键合于构成氨 基的氮原子上。其中，从分离性能、反应的简便性、试剂的获得容易性的方面考虑，特别优选 为使N-甲基-D-葡糖胺反应而得到的氨基。
[0051] 经由间隔基键合有这样的氨基的填充剂在糖类的分析中不需要高温条件，即使在 30~50°C这样的低温下也显示优异的分离，具有碱耐性，在重现性、耐久性方面优异。
[0052]构成本发明中的填充剂的亲水性树脂的大小、形状没有特别限定。但是，如果考虑 到本发明填充剂向柱内的填充，优选其形状为直径1~30μπι的球状。材质优选为交联或非交 联的树脂。特别优选使用具有醇羟基的树脂。
[0053]作为本发明中使用的树脂，可优选举出通过皂化或酯交换反应将由羧酸乙烯酯和 交联性单体形成的交联共聚物的酯基转化为醇羟基而得的聚乙烯醇系树脂。作为羧酸乙烯 酯，例如可以举出乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、戊酸乙烯酯及新戊酸乙烯酯等，它 们可以单独使用，也可以组合2种以上使用。其中，由于乙酸乙烯酯及丙酸乙烯酯聚合及皂 化容易，故优选。作为交联性单体，优选具有三嗪环的交联性单体，其中特别优选异氰脲酸 三烯丙酯。
[0054]上述树脂不具有酯结构、酰胺结构那样的不耐碱性的结构。因而，本发明的填充剂 对碱性也是稳定的。因此具有即使在碱性的分析条件也能够适宜地使用这样的优点。
[0055]另外，除上述树脂以外，也可以在不破坏本发明的目的的范围内含有其他树脂。例 如，也可以使用苯乙烯-二乙烯基苯系交联聚合物、甲基丙烯酸酯系交联聚合物、含有羟基 的甲基丙烯酸酯系交联聚合物粒子上化学键合有长链酰基的树脂等。这些其他树脂的含 量，相对于树脂量而言可以为10质量％以下的量，优选为5质量％以下的量。更优选的是，如 果上述亲水性树脂由聚乙烯醇树脂构成，则在耐久性、耐碱性等方面考虑为优选。
[0056] 氨基的量相对于树脂重量而言优选为0 · 1~0 · 7meq/g，更优选在0 · 15~0 · 5meq/g 的范围。如果为该范围，则在低温条件下也可以对糖类进行分析。
[0057]本发明中的间隔基是指为了调整基材(亲水性树脂）和氨基的距离而使用的化学 键合部位。该间隔基是为了赋予抑制式（1)的氨基和基材的干扰、抑制峰扩散的功能而使用 的。作为用于在基材上导入间隔基的化合物、即所谓的间隔基化合物，可以举出具有缩水甘 油基的化合物，例如可以举出表氯醇、1，4_丁二醇二缩水甘油基醚、乙二醇二缩水甘油基 醚、甘油二缩水甘油基醚等。这些间隔基化合物的末端卤代基、一侧的末端缩水甘油基与亲 水性树脂的羟基反应。
[0058] 缩水甘油基的导入量优选为0.2~0.8mol/g，更优选为0.4~0.6mol/g的范围。如 果为该范围，则能够导入优选量的氨基。
[0059] 缩水甘油基的导入通过在无溶剂或溶剂下对凝胶添加0.1~10倍量的上述试剂并 搅拌均匀而进行。
[0060] 导入有缩水甘油基的聚合物与用于导入式（1)所示的氨基的上述胺类的反应可以 如下进行。首先，将导入有缩水甘油基的聚合物分散于水、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺 等溶剂中。此时的溶剂从易于操作、使用的胺的溶解性等方面考虑最优选水。相对于Ig导入 有缩水甘油基的聚合物，优选加入2mmol以上的胺，以IOmmol~20mmol的范围加入时，在反 应效率和重现性方面考虑更优选。反应温度从重现性和反应效率的观点考虑优选为30~40 °C。反应时间从反应量和效率的方面考虑优选12小时~24小时。
[0061] 作为本发明的液相色谱用填充剂的粒径，可以使用体积平均粒径为1~30μπι的填 充剂，优选为2~20μπι，更优选为2~ΙΟμπι。体积平均粒径小于Ιμπι时，柱的压力上升大，有时 填充变得极为困难。另一方面，如果超过30μι，则柱的理论塔板数变低，故不理想。本申请中 的上述的体积平均粒径使用库尔特计数法如下进行测定。即，使用Multi sizer 4(Beckman Coulter公司制）作为测定装置，在0.2g填充剂样品中加入25mL IS0T0N(稀释液），进行3分 钟的超声波处理使其分散后，针对约1000个的测定个数对体积平均粒径进行测定。为了使 体积平均粒径为优选范围，可以利用风力分级、利用筛分进行的分级、利用沉淀的分级等进 行控制。
[0062] 本发明的液相色谱用填充剂向柱内的填充可以基于料浆法等已知的填充方法进 行。所得的液相色谱用柱，通过使用乙腈和水或由甲酸铵、乙酸铵等形成的缓冲液的混合溶 剂作为洗脱液，能够良好地分离糖类或其他亲水性化合物。
[0063] 作为本发明中的分离对象物质，可以举出环境污染物质、二恶英类、环境激素、农 药、表面活性剂、生物毒素、天然药物、天然色素、天然香料、及天然调味料等。
[0064] 本发明能够提供耐久性优异、即使反复进行分析也不发生经时变化的适于氨基柱 的填充剂。特别是即使在低温下也可以分离，所以也能够适用于具有在高温下不稳定的性 质的糖类的分析等用途。
[0065] 实施例
[0066] 以下通过实施例更详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例的任何限定。
[0067] 〔实施例1〕
[0068] 聚乙烯醇凝胶(基材)
[0069]将由乙酸乙烯酯10(^、异氰脲酸三烯丙酯15(^、乙酸丁酯10(^、正癸烷258及2,2 - 偶氮二异丁腈5g组成的均匀混合液、和溶解有聚乙烯醇12g及磷酸氢二钠18g的水1200mL装 入具有回流冷却器的5L三口烧瓶中并搅拌10分钟。接着，一边在氮气流下进行搅拌一边于 60°C进行16小时聚合，由此得到粒状聚合物。对该聚合物进行过滤、清洗，丙酮萃取后进行 干燥。然后将该聚合物与10 %氢氧化钠水溶液3L-起加入到具有回流冷却器、氮导入管及 搅拌器的5L三口烧瓶中，于氮气流下、15°C搅拌20小时进行该聚合物的皂化，然后过滤、水 洗、进一步干燥。通过阜化得到的聚乙稀醇聚合物的羟基的密度为2. lmeq/g。
[0070] 糖分析用及亲水性相互作用色谱用填充剂
[0071] 在可分离型烧瓶(s印arable flask)中加入上述干燥聚乙烯醇聚合物10g、表氯醇 45g、二甲基亚砜IOOmL及30%氢氧化钠水溶液5mL，于30°C搅拌20小时，向该聚合物导入了 缩水甘油基。将导入后的聚合物用二甲基亚砜、水、甲醇清洗后，进行干燥。
[0072] 在可分离型烧瓶中装入上述导入有缩水甘油基的聚合物4g、N_甲基-D-葡糖胺IOg 及水40mL，于30°C搅拌20小时，制作导入有氨基的糖分析用及亲水性相互作用色谱用填充 剂。用0.5N盐酸及0.5N氢氧化钠水溶液对该填充剂进行清洗，在两个清洗之间进行利用水 的清洗，进而用甲醇清洗后，进行干燥。将如上操作得到的填充剂分散于0.5N氯化钾水溶液 中，使用0.1 M盐酸对氨基进行滴定，由此测得的该填充剂的氨基密度的结果为0.44meq/g。 另外，该填充剂的体积平均粒径为5μπι。
[0073] 〔实施例2〕
[0074] 在可分离型烧瓶中装入与实施例1同样地操作制作的导入有缩水甘油基的聚合物 2.Og、25%氨水I .OmL及水19mL，于30°C搅拌20小时，导入了氨基。对该聚合物进行过滤后， 用0.5N盐酸及0.5N氢氧化钠水溶液进行清洗，在两个清洗之间进行水清洗，进一步用甲醇 清洗后进行干燥。
[0075]在可分离型烧瓶中加入上述具有氨基的聚合物1.8g、D_甘露糖1.9g、氰基硼氢化 钠0.2g及0.2M磷酸氢二钾水溶液12mL，于60°C搅拌20小时，制成在氮原子上键合有醛糖的 氨基，制作了糖分析用及亲水性相互作用液相色谱用填充剂。用I.ON硫酸及I.ON氢氧化钠 水溶液对该填充剂进行清洗，在两个清洗之间进行水清洗，然后，进行干燥。
[0076] 与实施例1同样地操作对得到的具有氨基的聚合物的氨基密度进行测定，结果为 0.26meq/g。
[0077] 〔实施例3〕
[0078] 在实施例1中使用I，4一丁二醇二缩水甘油基醚100g代替表氯醇45g，除此之外，在 同样的条件下制作液相色谱用填充剂。与实施例1同样地对该填充剂的氨基密度进行测定， 结果为 〇· 17meq/g。
[0079] 〔分析例1〕
[0080] 将实施例1中得到的填充剂填充至内径为4.6mm、长度为150mm的SUS制的柱中，制 备糖分析及亲水性相互作用色谱用柱。使用该柱，使洗脱液为乙腈/水= 85/15、流速为 0.6mL/min、柱温为40°C，进行分析。分析样品使用将果糖、甘露糖、葡萄糖及蔗糖这4种糖以 均为5mg/mL的方式溶解在乙腈/水= 5/3的混合液中所得的溶液。将使用示差折射率检测器 得到的色谱图示于图1。4种糖被良好地分离。
[0081 ]〔分析例2〕
[0082]另外，进行上述柱的稳定性试验。在0.05N氢氧化钠水溶液、流速0.6mL/min、柱温 30°C的条件下连续通入洗脱液80小时，确认通液前后糖类的保留时间及理论塔板数。将由 此得到的结果示于图2。对于使用了本发明的填充剂的柱而言，即使持续通入洗脱液，也不 发生保留时间等的变化。
[0083]〔分析例3〕
[0084] 使用实施例2中得到的填充剂与分析例1进行同样的分析，将得到的结果示于图3。 4种糖被良好地分离。
[0085] 〔分析例4〕
[0086] 使用实施例3中得到的填充剂与分析例1进行同样的分析，将所得的结果示于图4。 4种糖被良好地分离。
[0087]〔比较例1〕
[0088] 使用利用了以硅胶作为基材的导入有氨基的填充剂的柱，进行上述的稳定性试 验。结果，在通液开始的17小时后，柱中发生堵塞，不能通液。
[0089] 〔比较例2〕
[0090] 在可分离型烧瓶中装入将甲基丙烯酸缩水甘油酯聚合而得的丙烯酸酯树脂2.8g、 N-甲基-D-葡糖胺6.5g及水28mL，于30°C搅拌20小时，制作了以丙烯酸酯树脂为基材的填充 剂。对该聚合物进行过滤后，用〇. 5N盐酸及0.5N氢氧化钠水溶液进行清洗，在两个清洗之间 进行水清洗。
[0091] 〔分析例5〕
[0092]将比较例2中得到的填充剂与分析例1同样地填充至柱中并进行糖类的分析，将其 结果示于图5。可知保留时间短，糖类未被分离。
[0093]〔分析例6〕
[0094]将实施例1中得到的填充剂填充在内径为4.6mm、长度为250mm的SUS制柱中，制备 糖分析及亲水性相互作用色谱用柱。使用该柱进行果糖、半乳糖、乳果糖、依匹乳糖、乳糖这 5种糖类的分析。分析条件为流速1.0mL/min、柱温40°C。检测器使用示差折射率检测器。将 使用乙腈/水= 80/20作为洗脱液时的色谱图示于图6。
[0095] 〔分析例7〕
[0096] 分析例6的图6中，乳果糖和依匹乳糖的峰部分重叠。因此，使用相同的柱但将洗脱 液变更为乙腈/甲醇/水= 75/20/5对同样的样品进行分析，将此时的色谱图示于图7。图6中 峰重叠的乳果糖和依匹乳糖的峰完全分离。因此，5种糖被良好地分离。
【主权项】
1. 一种液相色谱用填充剂，其特征在于，在含有聚乙締醇树脂的亲水性的树脂上经由 间隔基键合有式(1)所示的氨基， 式(1);Ri表示氨原子、或碳原子数1~4的烷基，R2表示具有1个W上径基的碳原子数1~6的烧 基，※表示与间隔基的键合位置。2. 根据权利要求1所述的液相色谱用填充剂，其中，Ri为氨原子或甲基。3. 根据权利要求1或2所述的液相色谱用填充剂，其中，R2为式(2)所示的结构， 式(2);式中，η表示0~4的整数。4. 根据权利要求1所述的液相色谱用填充剂，其中，式（1)所示的氨基来源于由D-葡糖 胺、Ν-甲基-D-葡糖胺、1-氨基-1-脱氧-D-甘露糖醇、1-氨基-1-脱氧-D-半乳糖醇、1-氨基- 1-脱氧-D-艾杜糖醇、1-氨基-1-脱氧-D-阿糖醇、1-氨基-1-脱氧-D-木糖醇、4-氨基-1，2,3- 下Ξ醇、3-氨基-1，2-丙二醇、3-甲基氨基-1，2-丙二醇组成的组中的任一种胺。5. 根据权利要求1所述的液相色谱用填充剂，其特征在于，间隔基来源于末端具有缩水 甘油基的化合物。6. -种液相色谱用柱，其使用了权利要求1~5中任一项所述的液相色谱用填充剂。7. -种糖分析用液相色谱用柱，其使用了权利要求1~5中任一项所述的液相色谱用填 充剂。8. -种亲水性相互作用色谱用柱，其使用了权利要求1~5中任一项所述的液相色谱用 填充剂。
【文档编号】B01J20/34GK105940298SQ201580006799
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2015年2月23日
【发明人】中岛修弥, 冈田由治, 近藤英幸
【申请人】昭和电工株式会社