副溶血性弧菌在对虾去壳环节交叉污染的预测模型和方法
【专利摘要】本发明公开了一种副溶血性弧菌在对虾去壳环节交叉污染的预测模型和方法。所述预测模型通过Weibull方程表示为y(x)＝b*(xn)，尺度因子表示为b＝c×IL+d；副溶血性弧菌接种到对虾上，对不同接种水平下的对虾进行多次去壳实验，获得对虾去壳前后的表面菌落总数和细菌的迁移数量并计算迁移率，将实验数据输入到预测模型中，获得第一、第二线性模型参数及其形状因子，采用构建获得的预测模型对被测对虾去壳过程进行预测，获得去壳环节中的迁移率数据。本发明能准确、客观、定量的反映对虾中副溶血性弧菌在去壳加工环节所发生的交叉污染情况，为对虾虾仁的质量安全和产品卫生标准提供技术支持，在海产品加工管理，安全性评价以及风险预警、风险评估方面有广阔的应用前景。
【专利说明】
副溶血性弧菌在对邮去亮环节交叉污染的预测模型和方法
技术领域
[0001] 本发明设及预测食品微生物学技术领域，具体地说，是一种副溶血性弧菌在对邮 去壳环节交叉污染的预测模型和方法。
【背景技术】
[0002] 副溶血性弧菌(V化rio par址aemolyticus)是海产品中广泛存在的一种食源性致 病菌，我国已有多起由于食用污染了的致病性副溶血性弧菌的海产品而导致食物中毒的报 道。对邮邮仁在加工生产过程中，副溶血性弧菌会通过去壳操作释放出来并通过手套进一 步向下迁移传播。然而目前，国内外交叉污染迁移研究多集中于厨房加工烹煮环节的风险 研究。但在冷冻邮仁的生产加工中，不规范的操作会导致邮仁与操作人员手套发生交叉污 染，所W交叉污染是邮仁去壳加工中普遍存在的可引发细菌数量变化的重要环节。目前并 没有探究工厂南美白对邮去壳加工环节副溶血性弧菌交叉污染细菌迁移情况的报道。因而 建立的交叉污染预测模型可W用来描述对邮去壳时副溶血性弧菌交叉污染迁移的数量规 律，为南美白对邮邮仁的质量安全和产品卫生标准提供技术支持，便于管理部口及时准确 的获知食品的风险程度，制定行业及市场的监管政策，在海产品加工管理，安全性评价W及 风险预警、风险评估方面有广阔的应用前景。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种副溶血性弧菌在对邮去壳环节 交叉污染的预测模型和方法。
[0004] 本发明采用的技术方案是：
[0005] -、一种副溶血性弧菌在对邮去壳环节交叉污染的预测模型：
[0006] 所述预测模型通过Weibull方程采用W下公式表示，采用We化Ull方程模拟不同接 种水平下的对邮中副溶血性弧菌迁移率随对邮已去壳数量的变化：
[0007] y(x)=b*(x")
[000引其中，y(x)-副溶血性弧菌的迁移率（％)，b-尺度因子，n-形状因子，X-对邮已 去壳加工的数量。
[0009] 上述公式作为一级模型。
[0010] 在上述公式拟合过程中，参数间的自相关性过高会降低二级模型的可靠性，为避 免Weibull模型中形状因子与尺度因子的自相关性过高，利用整体数据拟合的方法，固定n 值，在最小二乘法的基础上对所有数据进行We化Ull模型拟合(Global Fit)，得到各迁移曲 线尺度因子与形状因子的参数估计结果。
[0011] 副溶血性弧菌在南美白对邮去壳加工环节交叉污染过程中，Weibull模型的形状 因子与环境因素并没有明显的相关关系，但是尺度因子与对邮表面的初始接种水平有一定 的线性相关关系，因此上述线性拟合Weibull模型中的尺度因子b与对邮表面初始接种水平 IL存在定量关系，所述的尺度因子b采用W下公式表示：
[0012] b = cXIL+d
[OOK]其中，b-尺度因子，IL-对邮表面接种水平。C，d-第一、第二樂性模型参数。
[0014] 上述公式作为二级模型。
[0015] 当形状因子n=l时，曲线呈直线，副溶血性弧菌的迁移率与对邮已去壳加工的数 量之间关系呈线性；
[0016] 当形状因子n〉l时，曲线呈上凸状，表示随对邮已去壳数量的增加，副溶血性弧菌 的迁移率逐渐增加；
[0017] 当形状因子n<l时，曲线呈凹状，表示随对邮已去壳数量的增加，副溶血性弧菌的 迁移率逐渐放缓。
[0018] 二、一种副溶血性弧菌在对邮去壳环节交叉污染的预测模型的构建方法，包括W 下步骤：
[0019] A)利用副溶血性弧菌菌株接种到对邮上，对不同接种水平下的对邮进行多次连续 去壳实验，获得对邮去壳前、后的表面菌落总数，进而获得细菌的迁移数量并采用W下公式 计算迁移率；
[0020]
[0021] B)将所有连续去壳实验中的对邮已去壳加工数量与其对应的迁移率和对邮表面 接种水平输入到所述预测模型中，获得第一线性模型参数C、第二线性模型参数d及其形状 因子n，从而完成预测模型的构建。
[0022] 每次所述去壳实验中，将副溶血性弧菌接种至其中一个对邮上作为污染源，然后 进行去壳。
[0023] 所述的副溶血性弧菌接种采用W下方式:将对邮浸泡于副溶血性弧菌菌液30min 后取出置于无菌称量盘上，再置于生物安全柜中静置30minW确保菌液接种至邮表面。
[0024] =、一种副溶血性弧菌在对邮去壳环节交叉污染的预测方法，包括W下步骤：
[0025] 1)构建预测模型，通过Weibull方程采用W下公式表示：
[0026] y(x)=b*(x")
[0027] 其中，y(x)-副溶血性弧菌的迁移率（％ )，b-尺度因子，n-形状因子，X-对邮已 去壳加工的数量。
[0028] 所述的尺度因子b采用W下公式表示：
[0029] b = cXIL+d
[0030] 其中，b-尺度因子，IL 一对邮表面接种水平。c，d-第一、第二线性模型参数。
[0031] 2)利用副溶血性弧菌菌株接种到对邮上，对不同接种水平下的对邮进行多次连续 去壳实验，获得对邮去壳前、后的表面菌落总数，进而获得细菌的迁移数量并采用W下公式 计算迁移率；
[0032]
[0033] 3)将所有连续去壳实验中的对邮已去壳加工数量与其对应的迁移率和对邮表面 接种水平输入到所述预测模型中，获得第一线性模型参数C、第二线性模型参数d及其形状 因子n;
[0034] 4)利用步骤3获得的模型对被测对邮去壳过程进行预测，获得去壳环节中的迁移 率数据，完成对对邮去壳环节交叉污染的预测。
[0035] 本发明将一级模型与二级模型相结合，来预测步骤b)所述的不同初始接种水平下 对邮去壳环节交叉污染的迁移率。并在实施例通过与实际测量值进行比较，W评价所述预 测模型的准确性。
[0036] 本发明的有益效果是：
[0037] 本发明模型能准确、客观、定量地反映副溶血性弧菌在南美白对邮中的迁移情况， 为对邮邮仁的品质控制和安全食用对邮提供了技术支持。
[0038] 同时本发明交叉污染预测模型可便于管理部口及时准确地获知食品风险程度，审U 定行业及市场的监管政策，利于正确指导生产者进行安全生产，在食品工业的安全性评价、 品质控制与管理W及风险预警、风险评估方面有广阔的应用前景。
【附图说明】
[0039] 图1为实施例副溶血性弧菌在南美白对邮去壳的细菌迁移情况的曲线图。
【具体实施方式】
[0040] 下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0041] 本发明的实施例如下：
[0042] 1.材料与方法
[0043] 1.1试验菌株与原材料
[0044] 副溶血性弧菌，于-80°C ,25%甘油保存。
[0045] 采用南美白对邮，购置于超市，冰鲜运至实验室，分装于自封袋中，-20°C冰箱胆存 备用。
[0046] 1.2试验药品、耗材与设备
[0047] 含有3%氯化钢的膜蛋白腺大豆肉汤(TSB)、硫巧胆薦琼脂培养基(TCBS)、含有3% 氯化钢的缓冲蛋白腺水(BPW)均购于美国BD公司。
[0048] 带滤膜的均质袋购置于杭州大微生物公司。
[0049] 实验中使用的主要仪器设备为：拍打式均质机（型号400，Seward，伦敦，英国）；螺 旋接种仪（型号WASP2, Don Whitley Scientific,希普利，英国）；全自动菌落计数仪 (Synbiosis,剑桥，英国）；高压灭菌锅（日本S洋）；电子天平(梅特勒公司）;MiIli-Q超纯水 纯化系统(美国Mi 11 ipore公司）；定量移液器(德国化pendorf公司）；高精度低溫培养箱（日 本=洋）。
[0化0] 1.3试验方法
[0化1] 1.3.1细菌培养及接种
[0052]实验菌株解冻后分别接种至含有3%化Cl的TSB液体培养基中，于37°C下过夜培养 12h，然后转接至3%化Cl的TSB液体培养基中进行传代培养化，使得菌液浓度达到Slog CFU/ml，利用TSB液体培养基进行梯度稀释至71og CFU/ml和61og CFU/ml的副溶血性弧菌 液，W此作为副溶血性弧菌的初始接种液用于不同南美白对邮初始接种水平的去壳迁移研 究。
[0053] 新鲜活邮购置于超市，去头修剪处理后储存于-20°C冰箱内。冻邮在实验前一天转 移至4°C环境下解冻，解冻后在75%酒精中浸泡2minW杀灭对邮表面微生物，取出后用无菌 水反复冲洗，直至无酒精味后置于无菌称量盘中备用。
[0054] 菌株的接种:将上述菌液倒入烧杯中，将邮浸泡30min后取出置于无菌称量盘上， 于生物安全柜中静置30minW确保菌液接种至邮表面。采用6,7,81og C即/ml的初始菌液接 种到邮表面的浓度分别为5，6，71og CFU/g。
[0055] 1.3.2南美白对邮连续去壳试验及副溶血性弧菌迁移数量的测定
[0056] 每一组接种水平下选择15只邮为一组，选择两只无菌邮进行接种，其中一只用于 测定初始接种在对邮表面的菌量，另一只作为交叉污染发生的污染源，其余13只邮均为待 去壳的无菌邮，开始依次连续对邮进行去壳，整个去壳过程中不更换手套，观察细菌从第1 只接种邮连续迁移到第14只对邮的数量变化情况。
[0057] 去壳后的每一只邮仁分开放置到含有25ml含有3%化Cl的缓冲蛋白腺水的无菌均 质袋中，将均质袋放入均质机中WImin，250巧m的条件进行拍打。
[005引取Iml均质液于离屯、管中，依次梯度稀释后吸取50山通过螺旋接种仪自动铺盘，每 一个样本做两个平行，即取两份分别到螺旋接种仪上进行检测获其平均值。
[0059] 铺盘结束后，放置于37°C培养箱中培养8到IOh后，用全自动菌落计数仪计数。
[0060] 2 结果
[0061] 2.1副溶血性弧菌在南美白对邮去壳环节中细菌的迁移曲线
[0062] 副溶血性弧菌在南美白对邮去壳环节中细菌的迁移曲线如图1所示。从图上可W 看出，细菌迁移程度呈现两个可区分的趋势，刚开始迁移呈现快速下降的递减趋势，随后迁 移速率放缓呈现拖尾的曲线走向。同一接种水平下，随着去壳数量的增加，细菌迁移率随之 降低。不同接种水平下，随着对邮初始污染水平的降低，副溶血性弧菌迁移率随之增大。
[0063] 表 1
[0064]
LUU65」 巧巧甲，INU巧不極测限W h的江巧效但。 1 2.2-级模型
[
[0067]表 2 [006引
[
[0071] 表格中，b VS na表示两个参数间的相关性。
[0072] 其中，通过对迁移率数据进行We化Ull模型拟合，分别对各因素组合下的细菌迁移 曲线进行Weibull模型拟合所得到的模型相关系数R2较高，然而，各组模型参数b及n间的自 相关系数也较高，表示两个模型参数相对独立性较低，可能引起参数估计值的非独立性同 时，无法利用现有的数学模型进行数据拟合。因此，本研究采用W全部数据为整体的参数估 计模型拟合方法，固定We化Ul 1方程中的形状因子，一方面减小n值的置信区间，一方面降低 Weibull模型中的二参数间的自相关性。利用整体数据拟合的方法，固定n值，再对各迁移曲 线尺度因子进行估计，虽然部分We化Ull模型的相关系数有所减小，但二参数间的自相关性 明显减低，估计值更加准确。此外，二参数的置信区间的减小，表明第二种模型拟合方法对 参数值的估计更加精确。因此，在本研究中采取W全部数据为整体的参数估计模型拟合方 法进行细菌迁移曲线拟合，并在此基础上对模型尺度因子b建立二级预测模型。
[007；3]表 4
[0074]
123 其中，参数b与参数n为利用整体数据拟合的方法，固定n值，在最小二乘法的基础 上对所有数据进行Weibull模型拟合的结果，W此结果用于二级模型的线性拟合。 2 2.3 二级模型 3 用We化Ull模型拟合对邮初始污染水平对副溶血性弧菌在南美白对邮去壳加工环 节交叉污染细菌迁移的影响，方程为：
[007引 b = -0.03IL+0.26
[0079] 2.4模型的验证
[0080] 实施例将所建立的一级模型与二级模型相结合，来预测=种初始污染水平下，交 叉污染迁移至南美白对邮中副溶血性弧菌菌数，并与实际测量值进行比较，W评价模型的 准确性。
[0081] 具体是采用预测标准误差作为本模型的验证指标。预测标准误差（Standard error Of prediction)SEP是指预测模型预测值和实验观测值差异的标准偏差，用W衡量 和验证预测模型的准确度。SEP越小，说明预测模型能够更好的描述实验数据。实施例的SEP 的表达式和结果如下：
[0082]
[0083] 其中，X-模型预测的细菌迁移率，y-实际测量的细菌迁移率，否一实际测量所得 的迁移率的平均值，n-对邮去壳的数量。
[0084] 研究证明，SEP值可允许的范围在0.00-35%，当SEP达到最大值35%时，误差可W 达到0.51〇的〇,在可允许的误差范围内，实施例结果是SEP = 25%表示模型预测的效果良好， 由此可见，本实施例通过模型验证证实了本发明模型能准确、客观、定量的反映南美白对邮 中副溶血性弧菌在去壳加工环节所发生的交叉污染情况。
[0085] W上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员，在不脱离本发明方法的前提下，还可W做出若干改进和补充，运些改进和补充也应视为 本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种副溶血性弧菌在对虾去壳环节交叉污染的预测模型，其特征在于:所述预测模 型通过Weibull方程采用以下公式表示： y(x) = b*(xn) 其中，y(x)-副溶血性弧菌的迀移率（％ )，b-尺度因子，η-形状因子，X-对虾已去壳 加工的数量。2. 根据权利要求1所述的一种副溶血性弧菌在对虾去壳环节交叉污染的预测模型，其 特征在于:所述的尺度因子b采用以下公式表示： b = c X IL+d 其中，b-尺度因子，IL 一对虾表面接种水平，c，d-第一、第二线性模型参数。3. 根据权利要求1所述的一种副溶血性弧菌在对虾去壳环节交叉污染的预测模型，其 特征在于： 当形状因子n = 1时，副溶血性弧菌的迀移率与对虾已去壳加工的数量之间关系呈线 性； 当形状因子η>1时，随对虾已去壳数量的增加，副溶血性弧菌的迀移率逐渐增加； 当形状因子n〈l时，随对虾已去壳数量的增加，副溶血性弧菌的迀移率逐渐放缓。4. 一种如权利要求1~3任一所述的副溶血性弧菌在对虾去壳环节交叉污染的预测模 型的构建方法，其特征在于包括以下步骤： A) 利用副溶血性弧菌菌株接种到对虾上，对不同接种水平下的对虾进行多次连续去壳 实验，获得对虾去壳前、后的表面菌落总数，进而获得细菌的迀移数量并采用以下公式计算 迀移率； my 被污染物体表面的菌落总数imw 伽十祝染響_爾总数(哪）XlQQ% B) 将所有连续去壳实验中的对虾已去壳加工数量与其对应的迀移率和对虾表面接种 水平输入到所述预测模型中，获得第一线性模型参数c、第二线性模型参数d及其形状因子 n，从而完成预测模型的构建。5. 根据权利要求4所述的一种副溶血性弧菌在对虾去壳环节交叉污染的预测模型的构 建方法，其特征在于:每次所述去壳实验中，将副溶血性弧菌接种至其中一个对虾上作为污 染源，然后进行去壳。6. 根据权利要求4或5所述的一种副溶血性弧菌在对虾去壳环节交叉污染的预测模型 的构建方法，其特征在于:所述的副溶血性弧菌接种采用以下方式:将对虾浸泡于副溶血性 弧菌菌液30min后取出置于无菌称量盘上，再置于生物安全柜中静置30min以确保菌液接种 至虾表面。7. -种副溶血性弧菌在对虾去壳环节交叉污染的预测方法，其特征在于包括以下步 骤:采用权利要求1~3任一所述预测模型，通过权利要求4所述方法获得预测模型的第一线 性模型参数c、第二线性模型参数d及其形状因子n，对被测对虾去壳过程进行预测，获得去 壳环节中的迀移率数据。
【文档编号】G06Q10/06GK106022516SQ201610326696
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月16日
【发明人】李延斌, 肖兴宁, 汪雯, 方维焕, 傅迎春
【申请人】浙江大学