用于细菌广谱性捕获和活菌释放的功能化磁纳米颗粒的制作方法

本发明涉及细菌富集领域，尤其涉及基于功能化磁纳米颗粒对细菌的广谱性富集及可控性活菌释放。

背景技术：

快速、灵敏的细菌在线检测方法在食品安全、环境监测及临床诊断等领域都发挥着重要作用，而细菌的富集分离能够排除复杂基底的干扰、简化预处理步骤，以及提供合适的检测体积。目前，在磁纳米颗粒上修饰配体的多种方法能够对细菌进行有效分离，包括磁纳米颗粒修饰抗体、抗生素及伴刀豆蛋白a(cona)等。然而对于实际的样品来说，其细菌组成通常是复杂的，以抗体作为识别元件的磁纳米颗粒仅能够特异性地识别单一种类的细菌，使用多种抗体无疑增加了富集的成本。抗生素类配体虽然能够捕获某类细菌，但是抗生素的大量使用容易造成环境污染。而包括cona在内的其他配体同样存在成本高、适用范围窄等劣势。

目前已有修饰聚乙烯亚胺的磁纳米颗粒，可用于多种细菌的捕获，但是由于捕获能力过强，导致细菌捕获后无法释放，对于下游的生物学分析造成困难。另一方面，工业制备的多聚赖氨酸修饰磁纳米颗粒也可用于细菌捕获，然而工业生产的多聚赖氨酸分子量分布较宽，不同分子量、不同批次间制备的磁纳米颗粒捕获效率不一致，也没有进行细菌捕获后的释放实验。

另一方面，保持细菌活性对于细菌分型、病理研究及抗性分析具有重要意义，现有的方法都未考虑到细菌捕获后的释放，乃至细菌活性的保持。

因此开发具有广谱性捕获能力、捕获效率高、分离时间短、环境友好的细菌富集分离方法，及富集后活细菌的释放策略，对于食品、环境卫生等领域的细菌检测具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种功能化磁纳米颗粒，以实现对细菌的广谱性富集及可控性活菌释放。

本发明提供的功能化磁纳米颗粒是ε-聚赖氨酸修饰的磁纳米颗粒(ε-pl-mnp)，包括磁纳米颗粒及其表面修饰的ε-聚赖氨酸(ε-polylysine，简写为ε-pl)。

优选的，所述磁纳米颗粒是羧基化的四氧化三铁纳米颗粒，ε-聚赖氨酸共价偶联在羧基化的四氧化三铁纳米颗粒上。

所述羧基化的四氧化三铁纳米颗粒的粒径为300±50nm。

所述ε-聚赖氨酸是含有25～30个赖氨酸残基的同型单体聚合物，带有大量正电荷。

本发明还提供了一种上述功能化磁纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

1)将羧基化的四氧化三铁纳米颗粒分散于磷酸盐缓冲液(pbs)中，加入偶联剂edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)和nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)或sulfo-nhs(n-羟基硫代琥珀酰亚胺)混匀；

2)磁分离收集沉淀，用pbs洗涤沉淀多次，再用pbs分散沉淀；

3)在步骤2)得到的分散液中加入含有ε-聚赖氨酸的pbs溶液，震荡混匀；

4)磁分离收集沉淀，用去离子水洗涤沉淀多次，再去离子水分散沉淀，得到共价偶联ε-聚赖氨酸于羧基化的四氧化三铁纳米颗粒上的产物ε-pl-mnp。

优选的，上述方法中所用的pbs配比为磷酸盐摩尔浓度10mm，nacl摩尔浓度0.1m，ph＝7.4。

优选的，上述步骤1)形成的混合体系中，所述羧基化的四氧化三铁纳米颗粒的浓度为2±0.2mg/ml，edc和nhs(或sulfo-nhs)的浓度均为10±2mg/ml。室温下1500rpm震荡30～40min混匀。

上述步骤3)所加入的ε-聚赖氨酸的质量可以为羧基化的四氧化三铁纳米颗粒的5±1倍。在步骤3)的混合体系中，优选的，羧基化的四氧化三铁纳米颗粒的浓度为2±0.2mg/ml，ε-聚赖氨酸的浓度为10±2mg/ml。室温下1500rpm震荡12～16h混匀。

由于ε-聚赖氨酸带有大量正电荷，细菌表面在生理条件下带有负电荷，本发明提供的ε-聚赖氨酸修饰的磁纳米颗粒能够通过静电作用对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌进行捕获，具有广谱性捕获的能力，而且，还能够通过调节ph的方法对捕获得到的细菌进行释放，释放后的细菌仍具有生物学活性，可用于下游生物学方法分析。

利用本发明ε-聚赖氨酸修饰的磁纳米颗粒对细菌进行捕获的方法包括：取细菌液体样品(缓冲液、牛奶、饮料、自来水等样品)与所述功能化磁纳米颗粒混合，室温下震荡一定时间，然后进行磁分离，弃去上清，收集沉淀。

上述捕获方法中，细菌与所述功能化磁纳米颗粒的混合液ph＝5～8.5为宜，盐浓度低于400mm较佳。其中细菌的浓度以10²～10⁷cfu/ml为宜，功能化磁纳米颗粒的浓度以0.2～2mg/ml为宜。优选1500rpm震荡5～15min。

所述功能化磁纳米颗粒ε-pl-mnp在捕获细菌后，在解离液的作用下能够释放细菌并保持细菌活性，释放后的细菌可继续进行培养操作和细菌代谢实验。

具体的，细菌解离方法如下：将捕获细菌后的ε-pl-mnp加入解离液中，室温下震荡一定时间，然后进行磁分离，收集解离的细菌分散液。

所述解离液为ph＝9.6～10.6，离子浓度100～150mm的缓冲液，例如：100～125mm碳酸氢钠-碳酸钠缓冲液(ph＝9.6～10.6)，以及100～125mm碳酸钠-氢氧化钠钠缓冲液(ph＝9.6～10.6)，或它们的混合液。在解离液中加入捕获细菌后的ε-pl-mnp后，室温下1500rpm震荡5～10min。

本发明提供的ε-聚赖氨酸修饰的磁纳米颗粒能够通过静电作用对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌进行捕获，具有广谱性捕获的能力，捕获效率高，时间短，修饰成本低，可应用于实际样品中细菌的富集。研究表明，ε-聚赖氨酸具有抗菌活性，目前应用于食品防腐剂中，与工业生产的多聚赖氨酸相比，ε-聚赖氨酸是由生物合成得到，具有分子量分布范围窄，环境友好，生物相容性好等优势，能够大量制备且价格低廉，适合于实际应用。而且，本发明提供的功能化的磁纳米颗粒ε-pl-mnp不仅能够富集细菌，也能够富集其他实际样品中的细菌，例如，用于对饮料，自来水，牛奶，蔬菜及医用注射针头表面细菌的富集。更有利的是，能够通过调节ph的方法对ε-pl-mnp捕获得到的细菌进行释放，释放后的细菌仍具有生物学活性，可用于下游生物学方法分析，对于食品、环境卫生等领域的细菌检测具有重要意义。

附图说明

图1是实施例3中不同浓度大肠杆菌e.colidh5α菌液经ε-pl-mnp捕获后，取上清液培养的结果。

图2是实施例8中ε-pl-mnp解离细菌的活性表征，其中：a.解离后细菌平板培养结果；b.alamarblueassay实验结果；c.暗场显微镜下解离前细菌形态；d.暗场显微镜下解离后细菌形态。

具体实施方式

下面结合实施例，进一步阐述本发明，但不以任何方式限制本发明的范围。

本发明采用的试剂皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下述实施例中对羧基化的四氧化三铁纳米颗粒进行ε-聚赖氨酸修饰的方法为：

步骤1：取100μl20mg/ml羧基化的四氧化三铁，磁分离后收集沉淀，以500μlpbs分散。

步骤2：向羧基化的四氧化三铁中加入500μl20mg/mledc/nhs(edc,nhs均为20mg/ml)的pbs溶液，25℃1500rpm震荡30min。

步骤3：磁分离收集沉淀，用1mlpbs洗涤沉淀，重复洗涤3次，以500μlpbs分散沉淀。

步骤4：加入500μl20mg/mlε-pl/pbs溶液，25℃，1500rpm震荡12h。

步骤5：磁分离收集沉淀，用1ml去离子水洗涤沉淀，重复洗涤3次，以100μl去离子水分散沉淀。4℃保存。

下述实施例中，ε-聚赖氨酸修饰的磁纳米颗粒(ε-pl-mnp)应用于细菌的富集，具体富集步骤如下：

步骤1：取细菌液体样品与功能化磁纳米颗粒混合，室温下1500rpm震荡15min；

步骤2：磁分离后弃去上清，收集沉淀。

测定ε-pl-mnp捕获细菌前后细菌样品的od600，捕获效率(captureefficiency，ce)可由以下公式计算：

捕获效率ce＝(od600捕获前-od600捕获后)/od600捕获前

功能化磁纳米颗粒ε-pl-mnp在捕获细菌后，在解离液的作用下能够释放细菌并保持细菌活性，释放后的细菌可继续进行培养操作和细菌代谢实验。

细菌解离步骤如下：

步骤1：取捕获细菌后的ε-pl-mnp加入解离液，室温下1500rpm震荡5min；

步骤2：磁分离后收集解离的细菌分散液。

测定ε-pl-mnp捕获细菌前及解离液释放的细菌样品的od600，则

od捕获＝od600捕获前-od600捕获后

解离效率(releaseefficiency，re)可由以下公式计算：

解离效率re＝od600解离后/od捕获

实施例1.ε-pl-mnp在不同ph条件下对缓冲液中细菌e.colidh5α的捕获

取100μl20mg/mlε-pl-mnp与1ml细菌样品混合，室温下1500rpm振荡40min。取上清液测定od600，计算捕获效率(captureefficiency，ce)。实验结果如表1所示，实验表明制备得到的ε-pl-mnp在ph＝5～8.5范围内对大肠杆菌的捕获效率在90％以上。

实施例1所述细菌样品为大肠杆菌e.colidh5α分散在不同ph的缓冲液中，分散后e.colidh5α的浓度为2×10⁷cfu/ml。所述ph＝4.2的缓冲液为10mm醋酸-醋酸钠缓冲液，ph＝5缓冲液为10mm醋酸-醋酸钠缓冲液，ph＝6.5缓冲液为10mm磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液，ph＝7.6缓冲液为10mm三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液，ph＝8.5缓冲液为10mm三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液，ph＝9.6缓冲液为10mm碳酸氢钠-碳酸钠缓冲液。

表1.ph条件优化

实施例2.ε-pl-mnp在不同混合时间条件下对缓冲液中大肠杆菌e.colidh5α的捕获

取100μl20mg/mlε-pl-mnp与1ml细菌样品混合，室温下1500rpm振荡5,10,15,20,30,40min。取上清液测定od600，计算捕获效率(captureefficiency，ce)，实验结果如表2所示。实验表明振荡5min后，制备得到的ε-pl-mnp对大肠杆菌e.colidh5α捕获效率为93％。

实施例2所述细菌样品为大肠杆菌e.colidh5α分散于tris缓冲液中(ph＝7.6，10mm)，分散后e.colidh5α的浓度为2×10⁷cfu/ml。

表2.培养时间优化

实施例3.ε-pl-mnp对缓冲液中不同浓度大肠杆菌e.colidh5α的捕获

取100μlε-pl-mnp与1ml细菌样品混合，室温下1500rpm振荡15min。取上清液100μl在lb固体培养基上进行平板涂布，在37℃恒温培养箱中孵育24h，实验结果如图1所示。实验表明不同浓度大肠杆菌e.colidh5α与ε-pl-mnp作用后，上清液经过培养后均不出现菌落，制备得到的ε-pl-mnp对不同浓度细菌样品捕获效率接近100％。

实施例3所述细菌样品为大肠杆菌e.colidh5α分散于tris缓冲液中(ph＝7.6，10mm)，经过上述缓冲液梯度稀释后e.colidh5α的浓度分别为10⁶，10⁵，10⁴，10³，10²cfu/ml。

实施例4.ε-pl-mnp对缓冲液中肠道致病菌鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)、福氏志贺氏菌(shigellaflexneri)、肺炎致病菌金黄葡萄球菌(staphylococcusaureus)和枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)的捕获

取ε-pl-mnp与1ml细菌样品混合15min，取上清液再加入ε-pl-mnp混合15min，重复多次至上清澄清。取最后一次捕获的上清液测定od600，计算捕获效率(captureefficiency，ce)。实验表明制备得到的ε-pl-mnp对鼠伤寒沙门氏菌的捕获效率为98.0±1.2％，对福氏志贺氏菌的捕获效率为88.8±1.0％，对金黄葡萄球菌的捕获效率为89.4±0.7％，对枯草芽孢杆菌的捕获效率为94.1±0.6％。

实施例4所述细菌样品为鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium),福氏志贺氏菌(shigellaflexneri),金黄葡萄球菌(staphylococcusaureus)和枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)分散于tris缓冲液中(ph＝7.6，10mm)，分散后细菌浓度均为10⁷cfu/ml。对于salmonellatyphimurium重复加入ε-pl-mnp两次，每次50μl；对于shigellaflexneri重复加入ε-pl-mnp八次，每次50μl。对于staphylococcusaureus和bacillussubtilis，分别加入一次100μlε-pl-mnp。

表3.缓冲液中的捕获效率

实施例5.ε-pl-mnp对饮料、牛奶和自来水中鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)及肺炎致病菌金黄葡萄球菌(staphylococcusaureus)的捕获

取ε-pl-mnp与1ml细菌样品混合15min，取上清液再加入ε-pl-mnp混合15min，重复多次至上清澄清。取最后一次捕获后的上清液测定od600，计算捕获效率(captureefficiency,ce)。实验表明制备得到的ε-pl-mnp对饮料中鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)和金黄葡萄球菌(staphylococcusaureus)的捕获效率为65.4±0.9％和99.7±0.4％，对自来水中salmonellatyphimurium和staphylococcusaureus的捕获效率为98.0±0.9％和99.9±0.4％，对牛奶中salmonellatyphimurium和staphylococcusaureus的捕获效率为83.9±0.6％和98.4±0.7％。

实施例5所述细菌样品为salmonellatyphimurium，staphylococcusaureus分散在自来水，100倍稀释的饮料和1000倍稀释的牛奶中，分散后salmonellatyphimurium及staphylococcusaureus的浓度均为10⁷cfu/ml。对于自来水、饮料及牛奶中salmonellatyphimurium分别重复加入ε-pl-mnp二、四和九次，每次50μl；对于饮料及自来水中staphylococcusaureus，加入一次100μlε-pl-mnp；对于牛奶中staphylococcusaureus，重复加入ε-pl-mnp两次，每次100μl。

表4.实际样品中的捕获效率

实施例6.ε-pl-mnp对蔬菜表面鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)的捕获

取人为污染的蔬菜样品1g，用20ml去离子水冲洗蔬菜表面，冲洗液用8000rpm离心10min浓缩为2.1ml。取细菌浓缩液在lb固体培养基上进行平板涂布，在37℃恒温培养箱中孵育24h，计数得到浓缩液细菌浓度。取800μl细菌浓缩液分别与100μl20mg/mlε-pl-mnp或pei-mnp混合，室温下1500rpm振荡15min。磁分离后取上清液100μl在lb固体培养基上进行平板涂布，在37℃恒温培养箱中孵育24h。实验表明制备得到的ε-pl-mnp对蔬菜表面细菌样品捕获效率为90％。

实施例6人为污染蔬菜样品为salmonellatyphimurium污染的娃娃菜样品(600cfu/g)，冲洗得到的细菌为420cfu，通过冲洗的方法得到的蔬菜表面细菌回收率为70％。800μl细菌浓缩液中salmonellatyphimurium含量为210cfu。

实施例7.ε-pl-mnp对医用注射器针头肺炎致病菌金黄葡萄球菌(staphylococcusaureus)的捕获

取人为污染的医用注射器针头一枚，用20ml去离子水冲洗镇针头，冲洗液用8000rpm离心10min浓缩为2.1ml。取细菌浓缩液在lb固体培养基上进行平板涂布，在37℃恒温培养箱中孵育24h，计数得到浓缩液细菌浓度。取800μl细菌浓缩液分别与100μl20mg/mlε-pl-mnp混合，室温下1500rpm振荡15min。磁分离后取上清液100μl在lb固体培养基上进行平板涂布，在37℃恒温培养箱中孵育24h。实验表明制备得到的ε-pl-mnp和pei-mnp对针头表面细菌样品捕获效率菌为100％。

实施例7人为污染医用注射器针头样品为staphylococcusaureus污染的0.5ml医用注射器针头，冲洗得到的细菌为1.9×10⁵cfu。800μl细菌浓缩液中staphylococcusaureus含量为7.2×10⁴cfu。

实施例8.ε-pl-mnp解离细菌条件优化

取100μlε-pl-mnp与1ml细菌样品混合，室温下1500rpm振荡15min，磁分离后弃去上清液。加入200μl不同组成的解离液，室温下1500rpm振荡5min，解离效率如表5所示。

实施例8中解离液的组成分别为12.5,125,250mm碳酸氢钠-碳酸钠缓冲液(ph＝9.6)，1mnacl溶液，以及0.5mnacl和125mm碳酸氢钠-碳酸钠缓冲液(ph＝9.6)的混合液。

表5.解离条件优化

实施例9.ε-pl-mnp解离的细菌活性

取100μlε-pl-mnp与1ml细菌样品混合，室温下1500rpm振荡15min，磁分离后弃去上清液。加入200μl解离液，室温下1500rpm振荡5min。磁分离后收集细菌分散液，加入20μl1m盐酸中和细菌分散液。在暗场显微镜下对解离前后的细菌形态进行观察，发现解离后的细菌仍能保持完整的细菌形态(见图2中c和d)。取100μl中和后的细菌分散液在lb固体培养基上进行平板涂布，在37℃恒温培养箱中孵育24h，平板上出现大量菌落(图2中a)，实验表明解离后的细菌具有活性，仍能进行增殖。另取中和后100μl细菌分散液加入10μlalamarblue，在37℃恒温培养箱中孵育3.5h，细菌代谢产生还原性物质nadh等，使无荧光的alamarblue转化为荧光底物(见图2中b)，实验表明解离后的细菌具有活性，仍能进行正常的代谢反应。

实施例9所述细菌样品为e.colidh5α分散于tris缓冲液中(ph＝7.6，10mm)，分散后e.colidh5α的浓度为10⁷cfu/ml。解离液为ph＝9.6缓冲液为125mm碳酸氢钠-碳酸钠缓冲液。

实施例10.ε-pl-mnp对饮料样品中e.colidh5α的解离效率

取100μlε-pl-mnp与1ml细菌样品混合，室温下1500rpm振荡15min，磁分离后弃去上清液。加入2次200μl解离液，每次室温下1500rpm振荡5min，解离效率为83.5％。

实施例10所述细菌样品为e.colidh5α分散于1％饮料中，分散后e.colidh5α的浓度为10⁷cfu/ml。解离液为ph＝9.6缓冲液为125mm碳酸氢钠-碳酸钠缓冲液。

实施例11.ε-pl-mnp对牛奶样品中e.colidh5α的解离效率

取100μlε-pl-mnp与1ml细菌样品混合，室温下1500rpm振荡15min，磁分离后弃去上清液。加入1次200μl解离液，每次室温下1500rpm振荡5min，解离效率为80.8％。

实施例11所述细菌样品为e.colidh5α分散于0.1％牛奶中，分散后e.colidh5α的浓度为10⁷cfu/ml。解离液为ph＝9.6缓冲液为125mm碳酸氢钠-碳酸钠缓冲液。

实施例12.ε-pl-mnp对饮料样品中金黄葡萄球菌(staphylococcusaureus)的解离效率

取100μlε-pl-mnp与1ml细菌样品混合，室温下1500rpm振荡15min，磁分离后弃去上清液。加入3次200μl解离液，每次室温下1500rpm振荡5min，解离效率为49.2％。

实施例12所述细菌样品为staphylococcusaureus分散于0.1％饮料样品中，分散后staphylococcusaureus的浓度为10⁷cfu/ml。解离液为ph＝9.6缓冲液为125mm碳酸氢钠-碳酸钠缓冲液。

实施例13.ε-pl-mnp对牛奶样品中金黄葡萄球菌(staphylococcusaureus)的解离效率

取100μlε-pl-mnp与1ml细菌样品混合，室温下1500rpm振荡15min，磁分离后弃去上清液。加入2次200μl解离液，每次室温下1500rpm振荡5min，解离效率为61.7％。

实施例13所述细菌样品为staphylococcusaureus分散于0.1％牛奶样品中，分散后staphylococcusaureus的浓度为10⁷cfu/ml。解离液为ph＝9.6缓冲液为125mm碳酸氢钠-碳酸钠缓冲液。