专利名称：：外植体的表面灭菌方法
技术领域：
：本发明属于植物组织培养
技术领域：
，具体涉及外植体的表面灭菌方法。
背景技术：
：植物组织培养用的外植体无论是取自田间还是室内，其表面通常都带有微生物。这些污染源一旦带入培养基，便会造成培养基污染，是无菌组织培养的一大障碍。因此，外植体必须要经过严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接种到培养基上。依据传统的表面灭菌处理技术，采来的外植体除去不用的部分之后，还需对其进行以下几个步骤的处理(1)自来水下长时间冲洗，必要时用适当的刷子刷洗，硬质材料可用刀刮，然后置于自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时，冲洗时间视材料清洁程度而宜。一些多年生的木本植物材料，冲洗后可先用洗衣粉、肥皂或吐温等进行洗涤。易漂浮或细小的材料，装入纱布袋内冲洗。(2)植物材料浸入70%的酒精中灭菌10-30秒，然后用无菌水冲洗2-3次。(3)用灭菌剂处理，常见的表面灭菌剂有酒精、升汞、双氧水以及次氯化物。用升汞液灭菌后的材料需要用无菌水漂洗8-10次，每次不少于3分钟，以尽量去除残毒，而其他灭菌剂处理过的外植体用无菌水漂洗3-4次即可。然而大量的事实表明，尽管在植物组培过程中尽量使无菌条件更完善，但是污染还是经常发生，有时甚至是整个实验室的组培苗突出污染而全部死亡，造成无法挽回的巨大损失。有关研究人员认为材料内部灭菌处理不好所造成的污染占污染总数的1/31/2，在正常灭菌条件下依然存活的内生菌污染约占1/4。其原因之一就是因为采来的外植体除去不用的部分之后先用大量的自来水冲洗，虽然能够清除肉眼看得见的污垢，但自来水中原有的微生物以及从外植体上冲洗下来的微生物会沿着植物导管进入外植体内部。如此一来，即便后续的浸泡消毒工作做得多么充分也很难将进入内部的微生物杀死，最终导致污染发生，组培操作失败。
发明内容本发明针对作为外植体的离体植物器官(根、茎、叶、花、果实、种子等)提供了一种消毒灭菌方法，从而大幅度降低植物组织培养的污染率。为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为一种外植体的表面灭菌方法，其操作步骤包括外植体表面清洗、放入消毒剂溶液浸泡杀菌、浸泡后用无菌水冲洗，采来的外植体除去不用的部分之后，直接用浓度为70-75%的酒精溶液清洗，然后再放入可用于外植体灭菌的消毒剂溶液中浸泡杀菌。所述外植体经酒精清洗之后、放入消毒剂中浸泡杀菌之前，放入浓度为70-75%的酒精溶液中浸泡l-15min。所述的消毒剂为次氯酸钠、升汞、次氯酸钙、溴水中的任意一种。所述的消毒剂溶液中还含有0.1-0.5%的吐温，以促进消毒剂溶液在外植体表面的铺展、浸润。按照本发明所提供的技术方案，采来的外植体除去不用的部分之后，不似传统方法那样先用大量的自来水冲洗甚至用肥皂或洗衣粉清洗，而是直接用浓度为70-75%的酒精溶液清洗。清洗与灭菌同步开展，这样可以避免自来水中或是外植体上冲洗下来的微生物沿着外植体的毛细管进入植物器官内部。传统观念认为酒精溶液的强渗透作用会伤害植物细胞。但经实验证实，这种伤害十分有限，只要在植入培养基前将伤口部分切除即可，并不影响组培成功率。对于一些老熟的材料，酒精清洗后、浸泡灭菌之前可以先用浓度为70-75%酒精溶液浸泡l-15min，在起到漂洗作用的同时，提高灭菌效果。浸泡灭菌选择除酒精以外的常见植物灭菌剂或抗菌素即可，如次氯酸钙、次氯酸钠、升汞、双氧水、溴水等。具体实施例方式实施例l取枣树茎段，用75%的酒精溶液擦洗去表面污垢之后，将茎段放入70%的酒精溶液中浸泡15min，然后放入含升汞0.1%、吐温0.5。/。的消毒液中浸泡5min。浸泡消毒过程中不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分接触，驱除气泡，使消毒彻底。在快到时间之前l-2分钟将消毒液倾出，倾净后立即倒入无菌水轻摇涮洗。无菌水涮洗每次3min左右，涮洗8-10次。整个灭菌过程在无菌条件下操作。实施例2采蝴蝶兰花梗切去不要的部分，然后用70%的酒精溶液擦洗去表面污垢。清洗干净后将花梗放入75。/。的酒精溶液中浸泡lmin，然后放入次氯酸钠浓度为6%、吐温浓度为0.1%的消毒溶液中浸泡10min。浸泡过程中不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分接触，驱除气泡，使消毒彻底。在快到时间之前l-2分钟，将次氯酸钠溶液倾出后，立即倒入无菌水轻摇涮洗。无菌水涮洗每次3min左右，涮洗3-5次。整个灭菌过程在无菌条件下操作。实施例3取樱花茎尖，用73%的酒精溶液洗去表面污垢之后，放入次氯酸钠浓度为4%、吐温浓度为0.3n/。的消毒溶液中浸泡15min。浸泡过程中不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分接触，驱除气泡，使消毒彻底。在快到时间之前l-2分钟将次氯酸钠消毒液倾出，倾净后立即倒入无菌水轻摇涮洗。无菌水涮洗每次3min左右，涮洗3-5次。整个灭菌过程在无菌条件下操作。灭菌效果分别用传统灭菌方法与本发明灭菌方法对几种典型植物品种进行组培实验，其平均污染率对比情况见表1，从中可以明显看出本发明具有极大的优势。4表1传统灭菌方法与本发明所提供灭菌方法的平均污染率对比<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>权利要求1、一种外植体的表面灭菌方法，包括外植体的清洗、消毒剂溶液浸泡杀菌、无菌水冲洗三个步骤，其特征在于采来的外植体除去不用的部分之后，直接用浓度为70-75％的酒精溶液清洗，然后再放入可用于外植体灭菌的消毒剂溶液中浸泡杀菌。2、如权利要求1所述的外植体的表面灭菌方法，其特征在于所述外植体经酒精清洗之后、放入消毒剂中浸泡之前，先放入浓度为70-75%的酒精溶液中浸泡l-15min。3、如权利要求1或2所述的外植体的表面灭菌方法，其特征在于所述的消毒剂为次氯酸钠、次氯酸钙、升汞、溴水中的任意一种。4、如权利要求3所述的外植体的表面灭菌方法，其特征在于所述的消毒剂溶液中还含有0.1-0.5%的吐温。全文摘要一种外植体的表面灭菌方法，属于植物组织培养
技术领域：
，包括外植体的清洗、消毒剂溶液浸泡杀菌、无菌水冲洗三个步骤，其特征在于采来的外植体除去不用的部分之后，直接用浓度为70-75％的酒精溶液清洗而不用自来水，清洗后再放入可用于外植体灭菌的消毒剂溶液中浸泡杀菌。在本发明所述的技术方案中，清洗与灭菌工作同步开展，这样可以避免自来水中或是外植体上冲洗下来的微生物沿着外植体的毛细管进入植物气管内部，大大降低植物组织培养的污染率。文档编号A01H4/00GK101461329SQ20091006400公开日2009年6月24日申请日期2009年1月5日优先权日2009年1月5日发明者任兵茹,芳王,王肖东,胡士敬,许朝斌,磊谷,莉赵,赵烈平,邢红梅,勇郭申请人:灵宝市华宝产业有限责任公司