专利名称：具有增强的产量相关性状的植物及其制备方法
技术领域：
本发明总体上涉及分子生物学领域，并涉及通过调节编码至少2个iSYT(SYT—— 滑膜肉瘤转运——的相互作用分子)多肽的一个或多个核酸在植物中的表达来增强植物的产量相关性状的方法。本发明还涉及具有编码至少2个iSYT多肽的核酸的经调节表达的植物，所述植物相对于相应的野生型植物或其他对照植物具有增强的产量相关性状。本发明还提供了迄今未知的编码至少2个iSYT多肽的核酸、和可以用于实施本发明方法的包含所述核酸的构建体。本发明还提供了可以用于本发明方法的构建体。此外，本发明还涉及基于iSYT的蛋白质复合物。本发明还涉及复合物用于促进植物生长的用途和涉及通过过表达复合物的至少2个成员来刺激复合物形成的方法。
背景技术：
不断增长的世界人口和逐渐减少的农业可用耕地推动了提高农业效率研究之势。 传统的作物和园艺学改良方法利用选育技术来鉴定具有期望特征的植物。然而，此类选育技术有若干缺陷，即这些技术一般为劳动密集型的，而且产生的植物通常含有异质的遗传组分，这些异质的遗传组分可能不总是导致期望的性状自亲本植物传递。分子生物学的进展已经使人类能够修饰动物和植物的种质。植物遗传工程需要分离和操作遗传物质(一般为DNA或RNA的形式)以及随后将遗传物质引入植物。此类技术有能力输送具有多种改良的经济、农业或园艺性状的作物或植物。对更多的植物衍生产品的需求一直在惊人地增加。在不久的将来，对农业的挑战将是以可持续的方式满足对饲料和食物的日益增长的需要。此外，植物也开始作为能源而发挥着重要作用。为了应付这些重大挑战，将必须实现植物产量的巨大增加。生物量的生产是一个多因素系统，其中过多的程序被投入到引起新细胞、组织和器官产生的分生组织活性上。虽然正在进行大量关于产量性能的研究，但关于支撑产量的分子网络知之甚少(Van Camp, 2005)。在拟南芥中已描述了许多基因当突变或异位表达时，导致更大的结构例如叶或根的形成。此类所谓的〃内在产量基因(intrinsic yield gene)“参与许多不同过程， 这些过程之间的相互关系基本上是未知的。具有特别经济利益的性状是增加的产量。产量通常定义为作物的可测量的具有经济价值的产出。这可以以数量和/或质量的方式进行定义。产量直接取决于若干因素，例如器官的数量和大小、植物构造(例如，分枝的数量)、种子产量、叶子衰老等等。根的发育、 营养吸收、胁迫耐受性和早期活力也可以是决定产量的重要因素。因此优化上述因素可以促进作物产量的增加。种子产量是特别重要的性状，这是因为许多植物的种子对于人类和动物营养而言至关重要。诸如玉米、稻、小麦、芸苔(canola)和大豆等作物占人类总卡路里摄取量的一半以上，或是通过对种子本身的直接消耗，或是通过对饲养自加工的种子的肉类产品的消耗。 它们也可以是工业加工中所用的糖类、油类和多类代谢物的来源。种子含有胚(新的枝条和根的来源)和胚乳(萌发期和幼苗早期生长过程中胚生长的营养源)。种子的发育涉及许多基因，并且需要代谢物自根、叶和茎转移至正在生长的种子。特别是胚乳可以同化糖类、油类和蛋白质的代谢前体，将其合成为贮存高分子，以充盈籽粒。对于许多作物而言，另一重要的性状是早期活力。提高早期活力是温带和热带稻类栽培种的现代稻类育种项目的重要目标。长根对于水栽稻的土壤锚固至关重要。在直接向涝地里播种稻米的情况下，以及在植物必须迅速透水出苗的情况下，较长的枝条均与活力有关。在进行条播的情况下，较长的中胚轴和胚芽鞘对于优良的出苗至关重要。改造植物早期活力的能力在农业上将具有极其重要的意义。例如，一直以来早期活力弱限制了在欧洲大西洋地区引入基于玉米带种质的玉米(玉蜀黍，ka mays L.)杂交种。另一重要的性状在于提高的非生物胁迫耐受性的性状。非生物胁迫是全世界作物损失的主要原因，使大多数主要作物植物平均产量降低50%以上(Wang等，Planta 218 1-14，200；3)。非生物胁迫可以因为干旱、盐度、极端温度、化学毒性及氧化胁迫引起。提高非生物胁迫植物耐受性的能力将对全世界农场主带来重大的经济利益，并将使人们能够在不利条件下、在否则将不可能进行作物栽培的地区进行作物栽培。因此通过优化上述因素之一可以增加作物产量。视最终用途而定，可能更优先修饰某些产量性状。例如，对于诸如饲料或木材生产或者生物燃料资源等应用，可能期望植物营养部分的增加，而对于诸如面粉、淀粉或油料生产等应用，可能特别期望种子参数的增强。即便是在种子参数之中，也可能更优先其中的一些，这取决于应用。多种机制可以促成增加的种子产量，无论形式是增加的种子大小、还是增加的种子数量。增加植物产量(种子产量和/或生物量)的一种方法可以是修饰植物的内在生长机制，如细胞周期或者参与植物生长或防御机制的多种信号传递路径。现已发现，通过调节编码至少2个iSYT多肽的一个或多个核酸在植物中的表达， 可增强植物的多种产量相关性状，其中所述多肽可以选自表A的任何多肽、其同源物和它们的融合物。背景在搜寻GRF (生长调节因子)的相互作用分子(Kim和Kende，2004)中以及在分析窄叶拟南芥突变体(Horiguchi等，2005)时，鉴定了上述“内在产量基因”之一，AN3 (也称为GIF1，以及在本文中也称为SYT——滑膜肉瘤转运多肽)。SYT是人SYT (滑膜肉瘤转运) 蛋白的同源物并且在拟南芥基因组中由一个小的基因家族编码。SYT是转录共激活物，尽管其染色体易位牵涉肿瘤发生，但其生物学功能仍然不清楚(Clark等，1994 ;de Brui jn等， 1996).通过使用酵母GAL4系统，SYT被证实具有转录激活活性(Kim和Kende，2004)。这， 与酵母双杂交和体外结合测定试验(Kim和Kende，2004 ；Horiguchi等，2005)(显示SYT可以与几种GRF相互作用)一起，提示SYT的一个作用是作为GRF的转录共激活物。GRF(生长调节因子)基因存在于迄今检查的所有种子植物的基因组中并且编码在叶的生长和发育中起调控作用的推定的转录因子(Kim等，200；3)。作为GRF和SYT转录激活因子和共激活因子复合物的支持，grf和SYT突变体展示相似的表型，并且grf和SYT突变的组合显示了协同效应(Kim和Kende，2004)。已证实SYT突变体窄叶表型是细胞数量减少的结果。此外，SYT的异位表达导致转基因植物具有由更多细胞组成的更大叶，这表明SYT控制细胞数量和器官大小(Horiguchi等，2005)。虽然SYT在植物生长调节中的功能未知，但这些结果显示SYT满足“内在产量基因”的要求。在我们破译支撑产量增加机制的分子网络的努力中，采用了全基因组上以蛋白质为中心的方法，在拟南芥细胞悬浮培养物中研究SYT相互作用蛋白。串联亲和纯化(TAP) 技术与基于质谱(MQ的蛋白质鉴定相组合，导致了可在调节植物生长方面起作用的SYT相互作用蛋白(iSYT)的分离和鉴定。令人惊讶地，我们分离了属于多蛋白复合物的几种蛋白质。而且，许多相互作用分子之前完全未被表征过。关于极少数SYT相互作用分子的报导显示它们参与若干发育过程(Wagner & Meyerowitz，2002 ；Meagher 等，2005 ；Sarnowski 等， 2005 ；Hurtado等，2006 ；Kwon等，2006)，但到目前为止没有一个已经鉴定的iSYT基因与刺激植物生长关联起来。更令人惊讶地，以前从未描述过可以用于增强产量相关性状的特定 iSYT多肽组合。发明概述现已令人惊讶地发现，调节编码至少两个iSYT多肽的一个或多个核酸在植物中的表达可以促进植物生长并且造成相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物，其中所述iSYT多肽选自表A的任何多肽、其同源物和其融合物。根据一个实施方案，提供了相对于对照植物增强植物的产量相关性状的方法，其包括调节编码至少两个iSYT多肽的一个或多个核酸在植物中的表达，其中所述iSYT多肽选自表A的任何多肽、其同源物和其融合物。定义多肽/蛋白质术语“多肽”和“蛋白质”在文中可互换使用，是指通过肽键连接起来的、任意长度的氨基酸聚合物形式。多丰亥苷it/ ^ii / mmmn / m^mmn术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在文中可互换使用，是指任何长度的无支链形式的核苷酸聚合物，所述核苷酸可以为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或者两者的组合。重组DNA“重组DNA"意指通过组合两个原本分开的DNA区段(例如通过化学合成或通过利用基因工程技术操作分离的核酸区段)而产生的DNA分子。重组DNA可包括外源DNA或仅仅操作的天然DNA。用于在植物中表达蛋白质的重组DNA通常以表达盒的方式提供，所述表达盒具有与编码目的蛋白质的DNA有效连接、在植物细胞中具有活性的启动子。同源物蛋白质的“同源物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，其相对于所讨论的未修饰蛋白质具有氨基酸取代、缺失和/或插入，并且与其源自的未修饰蛋白质形式具有相似的生物活性和功能活性。缺失是指从蛋白质中除去一个或多个氨基酸。插入是指在蛋白质的预定位置引入一个或多个氨基酸残基。插入可以包括N-末端和/或C-末端融合，以及单个或多个氨基酸的内部序列插入。一般，氨基酸序列内部的插入将小于N-或C-末端的融合，数量级约1到10个残基。N-或C-末端融合蛋白或肽的实例包括在酵母双杂交系统中应用的转录激活因子的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶标签、蛋白质A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag · 100表位、c-myc表位、FLAG 表位、IacZ, CMP (钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白质C表位和VSV表位。取代是指蛋白质中的氨基酸用具有相似特性(如相似的疏水性、亲水性、抗原性、 形成或打破α螺旋结构或β片层结构的倾向)的其他氨基酸替换。氨基酸取代一般是单残基的取代，但是视施加于多肽上的功能性限制而定也可以是成簇取代；插入通常在大约 1到10个氨基酸残基的数量级。氨基酸取代优选为保守氨基酸取代。保守取代表在本领域公知(参见例如 Creighton (1984) Proteins. W. H. Freeman and Company (编辑)禾口下表 1)。表1 保守氨基酸取代的实例
残基保守取代残基保守取代AlaSerLeuIle ；ValArgLysLysArg ；GlnAsnGln ；HisMetLeu ；IleAspGluPheMet ；Leu ；TyrGlnAsnSerThr ；GlyCysSerThrSer ； ValGluAspTrpTyrGlyProTyrTrp ； PheHisAsn ；GlnValIle ；LeuIleLeu ；Val可通过本领域公知的肽合成技术，如固相肽合成法等，或通过重组DNA操作，容易地进行氨基酸取代、缺失和/或插入。用于产生蛋白质的取代、插入或缺失变体的DNA 序列操作方法在本领域公知。例如，本领域的技术人员公知在DNA预定位置进行取代突变的技术，包括M13诱变、T7-Gen体外诱变(USB，Cleveland, OH)、QuickChange定点诱变 (Stratagene, San Diego, CA)、PCR介导的定点诱变或其他定点诱变方案。衍牛物“衍生物”包括肽、寡肽、多肽，与蛋白质如目的蛋白质的天然形式的氨基酸序列相比，其可以包括用非天然氨基酸残基进行的氨基酸取代、或者添加非天然氨基酸残基。蛋白质的“衍生物”还包括肽、寡肽、多肽，与多肽的天然形式的氨基酸序列相比，其可以包括天然改变的(糖基化、酰基化、异戊烯化、磷酸化、肉豆蔻酰化、硫酸化等)或非天然改变的氨基酸残基。衍生物与其源自的氨基酸序列相比，还可以包括一个或多个非氨基酸取代或添加，例如共价或非共价地结合于氨基酸序列的报告分子或其他配体，例如与氨基酸序列结合以有利于其检测的报告分子，以及相对于天然蛋白质的氨基酸序列而言非天然的氨基酸残基。此外，“衍生物”还可以包括天然形式的蛋白质与标签肽(tagging ρ印tide)例如FLAG、HIS6或硫氧还蛋白的融合物(关于标签肽的综述，参见I^erpe，Appl. Microbiol. Biotechnol. 60,523-533,2003)。盲向同源物/旁系同源物直向同源物和旁系同源物涵盖用于描述基因的祖先关系的进化概念。旁系同源物为相同物种内的基因，其起源自祖先基因的复制；而直向同源物为来自不同生物体的基因， 其通过物种形成起源，并且也源自于共同的祖先基因。结构域、基序/共有序列/标签序列术语“结构域”是指在进化相关蛋白质的序列比对中，在特定位置上保守的一组氨基酸。尽管其他位置上的氨基酸可能因同源物不同而改变，但是在特定位置上高度保守的氨基酸则意味着对于蛋白质结构、稳定性或功能而言很可能是必不可少的氨基酸。“结构域”通过在蛋白质同源物家族的比对序列中其高度的保守性而鉴定，其能够用作为标识符以确定任何所讨论的多肽是否属于先前鉴定到的多肽家族。术语“基序”或“共有序列”或“标签序列”是指进化相关蛋白质序列中短的保守区域。基序常常是结构域的高度保守的部分，但也可以包括仅仅部分的结构域，或者可以是位于保守结构域之外(若基序的所有氨基酸都落在所定义的结构域之外的话)。存在用于鉴定结构域的专家数据库，例如SMART(Schultz等(1998)Proc. Natl. Acad.Sci. USA 95,5857-5864 ；Letunic 等(2002)Nucleic Acids Res 30，242-244)、 InterPro (Mulder 等，(2003) Nucl. Acids. Res. 31，315—318)、Prosite (Bucher 禾口 Bairoch(1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation. (In) ISMB—94 ；第二届分子生物学智能系统国际会议记录(Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology)Altman R. , Brutlag D. , Karp P., Lathrop R.，Searls D.编辑，53-61 页，AAAIPress, Menlo Park ；Hulo 等，Nucl. Acids. Res. 32 :D134-D137, (2004))、或者 Pfam(Bateman 等，Nucleic Acids Research 30(1) 276-280(2002).进行蛋白质序列芯片(in silico)分析的一组工具可以从ExPASy蛋白质组学服务器获得(瑞士生物信息学研究所(Swiss Institute of Bioinformatics) (Gasteiger 等 ExPASy :the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Res 31 :3784-3788 Q003))。结构域或基序也可以利用常规技术例如通过序列比对来鉴定。为比较而进行序列比对的方法是本领域公知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、 BLAST、FASTA 和 TFASTA。GAP 使用 Needleman 和 Wunsch 的算法((1970) J. Mol. Biol. 48 443-453)来寻找使两序列之间匹配数最大化且空位数最小化的全局(即跨越完整序列)比对。BLAST算法(Altschul等(1990) J Mol Biol 215 :403-10)计算序列同一性百分比，并对两序列之间的相似性进行统计学分析。执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)公开地获得。例如，同源物可以使用ClustalW多重序列比对算法(1.83版)，采用默认的双比对参数以及百分比的记分方法而容易地鉴定。利用可获自MatGAT软 (Campanella (2003)BMCBioinformatics, 10 29. MatGAT :an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences)白勺方法之一，也可以确定全局相似性和同一性百分比。可以进行微小的人工编辑以优化保守基序之间的比对，这对于所属领域的技术人员而言将是显而易见的。此外，除了利用全长序列进行同源物鉴定以外，还可以利用特定的结构域。可以利用上述程序采用默认参数针对完整核酸或氨基酸序列或者针对选择的结构域或保守基序来确定序列同一性值。对于局部比对， Smith-Waterman 算法是特别有用的(Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol.Biol 147(1)； 195-7)。交互BLAST通常，这包括一次BLAST，包括以查询序列(例如，利用实施例部分表A中所列的任何序列)针对任何序列数据库如可公共获得的NCBI数据库进行BLAST。当从核苷酸序列开始时，通常使用BLASTN或TBLASTX (利用标准默认值)，而当从蛋白质序列开始时，则使用BLASTP或TBLASTN(利用标准默认值)。BLAST结果可以任选地过滤。接着使用过滤的结果或者未过滤的结果中的全长序列针对查询序列来源生物的序列进行反向BLAST(二次 BLAST)。然后比较一次和二次BLAST的结果。如果一次BLAST中分值靠前的命中事件来自查询序列源自的相同物种，而理想地反向BLAST导致查询序列在最高命中事件中，则鉴定到了旁系同源物；如果一次BLAST中分值靠前的命中事件不是来自查询序列源自的相同物种，且优选地反向BLAST导致查询序列处于最高命中事件之列，则找到了直向同源物。分值靠前的命中事件是E值低的命中事件。E值越低，分值越具有显著性(或者换句话说，偶然发现此命中事件的几率越低)。E值的计算是本领域众所周知的。除了 E值之外，还对比较进行同一性百分比记分。同一性百分比是指两比较核酸(或多肽)序列之间在特定长度上的相同核苷酸(或氨基酸)数。在大家族的情况下，可以使用ClustalWjSi 以邻接树来辅助相关基因的聚类可视化和鉴定直向同源物和旁系同源物。^^本文定义的术语“杂交”指其中基本同源互补的核苷酸序列彼此退火的过程。杂交过程能够完全在溶液中发生，即互补的核酸都处在溶液中。杂交过程也能够这样进行，即互补核酸之一固定于基质，如磁珠、琼脂糖珠或任何其它树脂上。此外，杂交过程也能够这样进行，即其中互补核酸之一固定在固相支持物如硝酸纤维素或尼龙膜上，或者通过例如照相平板印刷术固定在例如硅质玻璃支持物上(后者称为核酸阵列或微阵列，或称为核酸芯片)。为了使杂交发生，通常使核酸分子热变性或化学变性，以使双链解链成两条单链，和 /或除去单链核酸中的发夹结构或其它二级结构。术语“严格性”是指进行杂交的条件。杂交的严格性受诸如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成等条件的影响。通常，在确定的离子强度和PH值，对于特定序列而言， 低严格条件选择为比热解链温度(Tm)低大约30°C。中等严格条件为温度比Tm低20°C，而高严格条件为温度比Tm低10°C。高严格杂交条件通常用于分离与靶核酸序列具有高序列相似性的杂交序列。不过，由于遗传密码的简并性，核酸可以在序列上有偏差而依然编码基本上相同的多肽。因此有时可能需要中等严格杂交条件来鉴定这样的核酸分子。Tm是在确定的离子强度和pH值时，50%的靶序列与完美匹配的探针杂交的温度。Tm取决于溶液条件和探针的碱基组成及长度。例如，较长的序列在较高温度特异性杂交。在低于Tm值大约16°C到32°C获得最大杂交速率。在杂交溶液中存在一价阳离子会减少两核酸链之间的静电排斥作用，从而促进杂交体形成；当钠浓度不超过0. 4M时，这一作用明显 (对于更高的浓度，此效应可以忽略不计)。每个百分点的甲酰胺可使DNA-DNA和DNA-RNA 双链体的解链温度降低0. 6到0. 7°C，加入50%甲酰胺能够使杂交在30到45°C进行，尽管这将降低杂交速率。碱基对错配降低杂交速率和双链体的热稳定性。平均而言，对于大的探针，每个百分点碱基错配使Tm值下降约1°C。取决于杂交体的类型，Tm值可以利用下列公式计算1)DNA-DNA 杂交体(Meinkoth 和 Wahl，Anal. Biochem.，138 :267-284,1984)Tm = 81. 5°C +16. 6 X Iog10 [Na+] a+0. 41X % [G/Cb] -500 X [LT1-O. 61 X % 甲酰胺
2) DNA-RNA 或 RNA-RNA 杂交体Tm = 79. 8+18. 5 (Iog10 [Na+]a) +0. 58(% G/Cb)+ll. 8(% G/Cb) 2_820/Lc3)寡DNA或寡RNAd杂交体< 20 个核苷酸Tm = 2 (In)20-35 个核苷酸Tm = 22+1. 46 (In)a或用于其它一价阳离子，但是仅在0. 01-0. 4M范围内准确。b仅对于在30 %到75 %范围内的％ GC是准确的。cL =双链体的碱基对长度。d寡，寡核苷酸;In，=引物的有效长度=2 X (G/C数)+ (A/T数)。非特异性结合可以通过许多已知技术中的任一种来控制，例如用含蛋白质的溶液封闭膜，在杂交缓冲液中添加异源RNA、DNA和SDS,以及用RNA酶处理。对于非同源探针， 可以通过改变如下条件之一来进行系列杂交(i)逐渐降低退火温度(例如从68°C降至 42°C)，或(ii)逐渐降低甲酰胺浓度(例如从50%降至0%)。熟练技术人员知晓可以在杂交过程中改变而保持或者改变严格条件的各种参数。除杂交条件外，杂交特异性通常还是杂交后洗涤的函数。为了除去非特异杂交产生的背景，用稀释的盐溶液洗涤样品。这类洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度和温度盐浓度越低、洗涤温度越高，洗涤的严格性就越高。洗涤条件通常在等于或低于杂交严格性的条件下进行。阳性杂交给出至少为背景两倍的信号。一般，适用于核酸杂交测定或基因扩增检测操作的适宜严格条件如上文所示设置。也可以选择更高或更低的严格条件。熟练技术人员知晓可以在洗涤过程中改变从而保持或者改变严格条件的各种参数。例如，长于50个核苷酸的DNA杂交体的典型的高严格杂交条件包括在IXSSC中于65°C杂交或者在1 X SSC和50 %甲酰胺中于42°C杂交，接着在0. 3 X SSC中于65°C洗涤。 长于50个核苷酸的DNA杂交体的中等严格杂交条件的实例包括在4X SSC中于50°C杂交或者在6 X SSC和50%甲酰胺中于40°C杂交，接着在2 X SSC中于50 V洗涤。杂交体的长度是杂交核酸的预期长度。当已知序列的核酸进行杂交时，杂交体的长度可以通过比对序列并鉴定本文所述的保守区域来确定。IXSSC是0. 15M NaCl和15mM柠檬酸钠；杂交溶液和洗涤溶液可以另外地包括5XDenhardt试剂、0. 5-1. 0% SDSUOO μ g/ml片段化的变性鲑精 DNA,0. 5%焦磷酸钠。为了定义严格性水平，可以参考Sambrook等Q001)的《分子克隆实验室手册》，第三版，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约，或者Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989 及年度更新资料)。翦接变体本文所用的术语“剪接变体”包括这样的核酸序列变体，其中选择的内含子和/或外显子已被切除、替换、置换或添加，或者其中内含子已被缩短或增长。这样的变体基本上保持了蛋白质的生物活性；这可以通过选择性地保留蛋白质的功能性区段来实现。这样的剪接变体可以是天然的或人工的。预测和分离这类剪接变体的方法是本领域众所周知的 (参见例如 Foissac 和 Schiex (2005)BMC Bioinformatics 6 25)。等位基因变体等位基因或等位基因变体为位于相同的染色体位置的给定基因的可选形式。等位基因变体包括单核苷酸多态性(SNP)，以及小型插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的大小通常小于lOObp。在大多数生物体的天然多态性品系中SNP和INDEL形成最大的一组序列变体。内源基因本文述及的“内源”基因不仅指见于植物之中的以其天然形式存在的所讨论基因 (即未经人为干预)，而且指随后(重新)引入到植物中的分离的所述基因(或基本上同源的核酸/基因)(转基因)。例如，含有这样的转基因的转基因植物可能遭遇转基因表达的实质性下降和/或内源基因表达的实质性下降。所述分离的基因可分离自生物体或可以例如通过化学合成来人工制造。基因改组/定向进化基因改组或定向进化是重复进行DNA改组以及继之的适当筛选和/或选择，以产生编码具有修饰生物活性的蛋白质的核酸的变体或其部分(Castle等(2004) Science 304(5674) :1151-4 ；美国专利 5，811，238 和 6，395，547)。构建体另外的调控元件可以包括转录和翻译的增强子。本领域技术人员会知道适合用于实施本发明的终止子和增强子的序列。如“定义”部分所说明的那样，也可以向5’非翻译区(UTR)或在编码序列中加入内含子序列，来增加在胞质中累积的成熟信使的量。其他控制序列(除启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区域之外)可以是蛋白质和/或RNA稳定元件。这类序列为本领域技术人员公知或者可以容易地获得。本发明的遗传构建体可以还包括为在特定细胞类型中维持和/或复制所需的复制起点序列。一个实例是需要将遗传构建体作为染色体外遗传元件(如质粒或粘粒分子) 在细菌细胞中维持的情况。优选的复制起点包括但不限于Π-ori和colEl。为检测本发明方法中所用核酸序列的成功转移和/或选择含有这些核酸序列的转基因植物，可以有利地使用标记基因(或报告基因)。因此，遗传构建体可以任选地含有可选择标记基因。可选择标记在本文“定义”部分有更详细的说明。标记基因一旦不再需要，可以从转基因细胞中除去或切除。用于标记基因去除的技术在本领域公知，有用的技术在上文“定义”部分有说明。调控元件/控制序列/启动子术语“调控元件”、“控制序列”和“启动子”在文中均可互换使用，取其广义，是指能够影响与之相连的序列表达的调控性核酸序列。术语“启动子”通常是指位于基因转录起点上游的核酸控制序列，其参与识别和结合RNA聚合酶及其他蛋白质，由此指导有效连接的核酸进行转录。上述术语包括源自经典真核生物基因组基因的转录调控序列(包括对于精确的转录起始是必需的TATA盒，带或不带CCAAT盒序列)，以及其他调控元件(即上游激活序列、增强子和沉默子)——它们通过应答发育刺激和/或外部刺激或以组织特异的方式改变基因表达。该术语还包括经典原核生物基因的转录调控序列，在此情况下可以包括-35盒序列和/或-10盒转录调控序列。术语“调控元件”也涵盖合成的融合分子或衍生物，其赋予、激活或增强细胞、组织或器官中核酸分子的表达。“植物启动子”包含调控元件，其介导编码序列区段在植物细胞中的表达。因此， 植物启动子不必是植物来源的，其还可来自病毒或微生物，例如来自攻击植物细胞的病毒。 “植物启动子”还可源于植物细胞，例如，来源于待用欲在本发明方法中表达的以及本文所述的核酸序列转化的植物。这对于其他“植物”调控信号同样适用，例如“植物”终止子。位于可用于本发明方法的核苷酸序列上游的启动子可以通过一个或多个核苷酸取代、插入和 /或缺失进行修饰，而不干扰启动子、开放读框(ORF)或者3’调控区如终止子或远离ORF的其他3’调控区的功能或活性。此外，还可以通过修饰启动子的序列而增加其活性，或者将其完全替换为活性更强的启动子、甚至是来自异源生物体的启动子。为在植物中表达，核酸分子必须，如上文所述的那样，有效连接于或者包含适宜的启动子，所述启动子将在恰当的时间点以所需的空间表达模式表达所述基因。为鉴定功能上等同的启动子，可以例如通过将候选启动子与报告基因有效连接、 测定所述报告基因在植物多种组织中的表达水平和模式，来分析候选启动子的启动子强度和/或表达模式。公知的适宜报告基因包括例如葡糖醛酸糖苷酶或半乳糖苷酶。 通过测量β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶的酶活来测定启动子活性。然后可以将该启动子强度和/或表达模式与参照启动子(如本发明方法中所用的启动子)相比较。可选地，可以利用本领域公知的方法，如Northern印迹(RNA分析)结合放射自显影图的密度计量分析、定量实时 PCR 或 RT-PCR(Heid 等，1996 Genome Methods 6 :986-994)，通过定量mRNA水平或者将本发明方法所用核酸的mRNA水平与持家基因如18S rRNA的mRNA水平进行比较，来测定启动子强度。通常，“弱启动子”表示驱动编码序列低水平表达的启动子。 “低水平”表示每个细胞约1/10，000个转录物到约1/100，000个转录物、到约1/500，0000 个转录物的水平。相反，“强启动子”驱动编码序列高水平表达，或者说每个细胞约1/10个转录物到约1/100个转录物、到约1/1000个转录物。一般，“中等强度启动子”表示以低于强启动子的水平，特别是以在所有情况下都低于在35S CaMV启动子控制下所获得水平的水平，驱动编码序列表达的启动子。有效连接本文所用的术语“有效连接”是指启动子序列和目的基因之间的功能性连接，从而启动子序列能够起始目的基因的转录。组成型启动子“组成型启动子”是指在生长和发育的大多数但不必然是所有阶段，在大多数环境条件下，在至少一种细胞、组织或器官中具有转录活性的启动子。下表加给出了组成型启动子的实例。
表加植物组成型启动子的实例
权利要求
1.相对于对照植物增强植物的产量相关性状的方法，包括调节 (i)任何两个或三个编码相应的两个或三个iSYT样多肽的核酸；或 ( )两个或三个核酸，每一个各编码单个iSYT样多肽；或(iii)根据(i)的核酸和根据(ii)的核酸在植物中的表达，其中所述iSYT样多肽选自表A的任何多肽、其同源物和它们的融合物。
2.权利要求1的方法，其中至少一个所述多肽是滑膜肉瘤转运(SYT)多肽或其同源物，所述SYT多肽或其同源物优选包含SNH结构域，所述结构域按照递增的优选次序与SEQ ID NO :670 的 SNH 结构域(IQQYLDENKSLILKIVESQNSGKLSECAENQARLQRNL MYLAAIAD)具有至少 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99% 的序列同一性。
3.权利要求1或2的方法，其中所述核酸编码选自表3中所列多肽的相应多肽。
4.权利要求1至3之任一的方法，其中所述经调节的表达通过向植物中引入和表达所述核酸来实现。
5.权利要求1至4之任一的方法，其中所述核酸选自编码表A和表A2至表似6中所列的任何蛋白质的核酸，或为这样的核酸的部分或为能够与这样的核酸杂交的核酸。
6.权利要求1至5之任一的方法，其中所述核酸编码表A所给出的任何蛋白质的直向同源物或旁系同源物。
7.任何前述权利要求的方法，其中所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物增加的产量，优选增加的生物量和/或增加的种子产量。
8.任何前述权利要求的方法，其中在非胁迫条件下获得所述增强的产量相关性状。
9.任何前述权利要求的方法，其中在干旱胁迫、盐胁迫或氮缺乏的条件下获得所述增强的产量相关性状。
10.权利要求4至9之任一的方法，其中所述一个或多个核酸有效地连接至植物启动子，优选连接至组成型启动子，更优选连接至G0S2启动子，最优选连接至稻G0S2启动子。
11.权利要求1至10之任一的方法，其中所述一个或多个核酸是植物来源的，优选来自双子叶植物，更优选来自十字花科，更优选来自拟南芥属，最优选来自拟南芥。
12.可通过权利要求1至11之任一的方法获得的植物或其部分，包括种子，其中所述植物或其部分包含任何两个或三个编码相应的两个或三个多肽的核酸，其中所述多肽选自表 A中所列的多肽、其同源物和它们的融合物。
13.一种构建体，其包含(i)任何两个或三个编码相应的两个或三个多肽的核酸，其中所述多肽选自表A中所列的任何多肽、其同源物和它们的融合物；( )能够驱动(i)的核酸序列表达的一个或多个控制序列，优选植物启动子，更优选组成型启动子，甚至更优选G0S2启动子，最优选稻G0S2启动子；和任选的 (iii)转录终止序列。
14.权利要求12的构建体，其中所述(i)的核酸编码选自表3中所列的多肽的两个或三个多肽。
15.权利要求13或14的构建体在用于产生相对于对照植物具有增加的产量，特别是增加的生物量和/或增加的种子产量的植物的方法中的用途。
16.权利要求13或14的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
17.用于产生相对于对照植物具有增加的产量，特别是增加的生物量和/或增加的种子产量的转基因植物的方法，其包括(i)向植物中引入和表达任何两个或三个编码相应多肽的核酸，其中所述多肽选自表 A中所列的任何多肽、其同源物和它们的融合物；和( )在促进植物生长和发育的条件下培养所述植物细胞。
18.相对于对照植物具有增加的产量，特别是增加的生物量和/或增加的种子产量的转基因植物、或源自所述转基因植物的转基因植物细胞，其中所述增加的产量因任何两个或三个编码相应多肽的核酸的调节的表达而产生，其中所述多肽选自表A的任何多肽、其同源物和它们的融合物。
19.权利要求12、16或18的转基因植物或源自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物或单子叶植物或谷类植物如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯佩耳特小麦、黑麦、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、买罗高粱和燕麦。
20.权利要求19的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是枝条生物量和/或种子。
21.从权利要求18或19的植物和/或从权利要求20的植物的可收获部分产生的产PΡΠ O
22.权利要求12的构建体，其中所述(i)的构建体编码选自表3的组合的两个多肽。
23.权利要求13或14的构建体在用于产生相对于对照植物具有增加的产量，特别是增加的生物量和/或增加的种子产量的植物的方法中的用途。
24.利用权利要求13或14的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
25.用于产生与对照植物相比较具有增加的产量，特别是增加的生物量和/或增加的种子产量的转基因植物的方法，其包括(i)向植物中引入和表达一个或多个(分离的)核酸，所述核酸编码选自表A的任何多肽、其同源物和它们的融合物的至少1个，优选2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个多肽；和 ( )在促进植物生长和发育的条件下培养所述植物细胞。
26.相对于对照植物具有增加的产量，特别是增加的生物量和/或增加的种子产量的转基因植物、或来源于所述转基因植物的转基因植物细胞，所述增加的产量因一个或多个 (分离的)核酸的调节的表达而产生，其中所述核酸编码选自表A的任何多肽、其同源物和它们的融合物的至少1个，优选2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个多肽。
27.权利要求12、16或18的转基因植物或源于其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物或单子叶植物或谷类植物，例如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯佩耳特小麦、黑麦、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、买罗高粱和燕麦。
28.权利要求19的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选是枝条生物量和/或种子。
29.从权利要求18或19的植物和/或从权利要求20的植物的可收获部分产生的产PΡΠ O
30.任何两个或三个编码两个或三个多肽的核酸在植物中相对于对照植物增加产量，特别是增加种子产量和/或枝条生物量的用途，其中所述多肽选自表A的任何多肽、其同源物和它们的融合物。
全文摘要
本发明一般地涉及分子生物学领域，涉及通过调节编码至少两个iSYT(SYT-滑膜肉瘤转运-的相互作用分子)多肽的一个或多个核酸在植物中的表达来增强产量相关性状的方法。本发明还涉及具有编码至少两个iSYT多肽的核酸的经调节表达的植物，该植物相对于相应的野生型植物或其他对照植物具有增强的产量相关性状。本发明还提供可以用于实施本发明方法的、迄今未知的编码至少两个iSYT多肽的核酸、和含有其的构建体。本发明还提供了用于本发明方法的构建体。此外本发明还涉及基于iSYT的蛋白质复合物。本发明还涉及所述复合物促进植物生长的用途以及通过过表达所述复合物的至少两个成员而刺激复合物形成的方法。
文档编号A01H5/00GK102257142SQ200980142864
公开日2011年11月23日 申请日期2009年8月31日 优先权日2008年8月29日
发明者A·安德里安卡亚, A·韦尔凯斯特, D·因泽, 耶格尔 G·德, M·劳尔斯, S·范德纳比利, V·弗兰卡德, Y·海茨费尔德 申请人:巴斯夫植物科学有限公司