专利名称：电磁辐射致癌的Scid小鼠模型及构建方法
技术领域：
本发明涉及一种电磁辐射致癌的Scid小鼠模型及构建方法。
背景技术：
随着科学技术的飞速发展，电磁技术已经成为工业、医疗、通讯等领域中不可或缺的重要工具之一。电磁技术在方便人们日常生活的同时，对人体的影响也受到越来越多的 关注。电磁波可以透入生物体，并与生物组织发生相互作用，导致不同生物层次上的形态、 结构及功能发生改变，甚至诱发癌症。如何预防或减少电磁辐射对人体的伤害，已日益成为 生命科学、环境科学和医疗卫生领域的研究热点。通过对电磁辐射的生物效应进行深入研 究，目前已经提出了多种作用机理的模型、假说和理论。1982年美国政府制订了一套基于热 效应的射频辐射标准，用比吸收率(Specific Absorption Rate，SAR，单位为W/kg)值来衡 量电磁辐射的热效应，该标准逐渐被全世界所接收并沿用至今。但是，越来越多的现象表明 仅仅用SAR值来衡量电磁辐射对人体的影响是不够的，因为长期的电磁辐射给人体造成一 系列的健康问题无法用热效应解释和评价。于是，大量研究尝试分析其它一些参数指标来 确定电磁辐射的危害。Leszczynski 等人(D. Leszczynski, et al. Differentiation. 2002,70:120 ~ 129)研究了电磁辐射对人内皮细胞的影响，发现能引起热休克蛋白27(HSP27)的短暂磷 酸化，并能激活多种细胞信号转换路径，并提出电磁辐射诱导的HSP27活化能阻止细胞 色素C的凋亡路径，从而导致脑瘤的发生。Di carlo等人(A.DiCarlo，et al. J. Cell. Biochem. 2002,84 447 454)用功率为3. 5mff的电磁辐射对鸡胚胎进行每日30 60分钟 的辐射，连续辐射4天，结果发现与对照组相比热休克蛋白70(HSP70)水平下降了 27%，从 而胚胎防御缺氧应激的能力降低，提示长期暴露于电磁辐射会由于HSP70水平降低而导致 细胞自我保护能力降低，从而增加发生肿瘤的可能性。Kramarenko等人(Α. V. Kramarenko, et al. Int. J. Neurosci. 2003，113 1007 1019)研究了高频电磁辐射对人脑电图的影响， 发现用手机照射人脑后，在颞骨部位出现2. 5 6. OHz的慢波，每15 20秒出现一次，持续 约1秒；在儿童中有类似的发现，但慢波出现较早、振幅较大、持续时间长且间隔短，表明手 机辐射会影响人的大脑，而且可能更容易对儿童大脑造成损伤。然而，并非所有实验都证明 电磁辐射会对人体的正常生理指标产生影响。比如在Tahvanainen等人(K. Tahvanainen, et al. Bioelectromagnetics. 2004,25 73 83)的研究中，他们用 900MHz 和 1800MHz 的 手机辐射作用于志愿者35分钟，结果发现动脉血压和心率与对照组没有显著差异。以上这些研究由于受到实验条件的限制，不能确定长期的电磁辐射所造成的危害 及程度，特别是不能对电磁辐射的致癌作用进行评价。由于在实验研究中利用不同的生物 学体系，如不同的细胞或动物亚型及生物体处于不同的生理状态等个体差异，或使用不同 的辐射装置、实验程序等分析电磁辐射的生物学后果，有的甚至得出相反的结论，从而对确 定电磁辐射的致癌作用带来了困难。因此，目前亟需构建一种可靠的动物模型以用于研究 电磁辐射的致癌作用。
Scid小鼠即重度联合免疫缺陷小鼠，携带位于第16对染色体的单个隐性突变基 因。Scid小鼠外观与普通小鼠差别不大，但胸腺、脾、淋巴结的重量不及正常的30%，组织 学上表现为淋巴细胞显著缺陷。Scid小鼠极易感染，是继裸鼠出现之后发现的一种十分有 价值的免疫缺陷动物。目前，利用Scid小鼠构建电磁辐射致癌的动物模型的方法尚未见国 内外文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种方法简单、重复性好、效果显著的电磁辐射致癌的Scid 小鼠模型及构建方法。本发明所提供的一种电磁辐射致癌的Scid小鼠模型及构建方法，包括以下步骤(1)NIH/3T3细胞的培养与传代将NIH/3T3细胞在37°C、5% CO2培养箱内用DMEM培养液培养，培养液中含有10% 小牛血清、1 %青霉素、1 %链霉素和1 %谷氨酰胺，当细胞生长增殖形成单层细胞并扩展汇 合后，吸出旧培养液，加入0. 03% Versene溶液冲洗一遍，吸出洗液，然后加入胰蛋白酶消 化液37°C进行消化，消化结束后再进行传代；(2)暴露实验 将NIH/3T3细胞在细胞培养板上用DMEM培养液培养，将装有NIH/3T3细胞的培养 板置于横电磁波传输小室(Transverse Electromagnetic TransmissionCell，简称 TEM 小 室)中，再将TEM小室置于5% CO2培养箱中，同时，将NIH/3T3细胞暴露于功率密度为30 90ff/m2的电磁辐射下，设定培养箱温度为36. 5°C，每天辐射2小时，培养4 6周；(3)软琼脂培养实验配制浓度分别为1. 2%和0. 6%的琼脂糖溶液，以及2XDMEM培养液，培养液中含 有20%小牛血清、2%青霉素、2%链霉素和2%谷氨酰胺，向一支试管中加入2XDMEM培养 液和1. 2%琼脂糖溶液各lmL，倒入细胞培养板中，待凝固后制成琼脂糖基础层，再向另一 支试管中加入2XDMEM培养液和0. 6%琼脂糖溶液各0. 5mL，然后接种0. 2mL NIH/3T3细胞 溶液，均勻混合后加在基础层上，待凝固后制成双层琼脂，将细胞培养板置于37°C、5% CO2 培养箱中培养2周；(4) Scid小鼠致瘤实验收集经过电磁辐射的NIH/3T3细胞，对2只Scid小鼠进行背部皮下接种，每只小 鼠注射细胞悬液0. lmL，饲养6周后对形成的瘤块进行病理切片检查。上述步骤(1)中的MH/3T3细胞是一种小鼠胚胎成纤维细胞，该细胞对外界因素 敏感、容易发生转化，适用于癌基因转化试验。本发明方法采用对外界因素敏感、容易发生转化的NIH/3T3细胞系，暴露于电磁 辐射后接种于Scid小鼠，6周后形成肿瘤，表明微波辐射对细胞的恶性转化具有诱导作用。本发明方法以OTH/3T3永生细胞作为体外细胞转化实验的靶细胞，建立了电磁辐 射诱发肿瘤的Scid小鼠模型。本发明方法效果显著、步骤简单、重复性好，具有良好的应用 前景。本发明方法建立的体外细胞转化实验模型可用于模拟体内细胞的恶性转化，为电 磁辐射诱发肿瘤的发病机制及其防治措施的研究提供了一种良好的实验模型和有力的技术手段。本发明方法可以应用于工业、科学、医疗以及日常生活中电磁辐射的致癌性风险 预评价，这将对预防电磁辐射对人体健康的远期危害具有重要的价值。
图1 软琼脂糖培养的NIH/3T3细胞图片；图2 =Scid小鼠的肿瘤组织病理切片。
具体实施例方式实施例1(1)NIH/3T3细胞的培养与传代将NIH/3T3细胞在37°C、5% CO2培养箱内用DMEM培养液培养，当细胞生长增殖形 成单层细胞并扩展汇合后，吸出旧培养液，加入0. 03% Versene溶液冲洗一遍，吸出洗液， 然后加入胰蛋白酶消化液37°C进行消化，同时在倒置显微镜下观察消化细胞，当原来的贴 壁细胞逐渐趋于圆形、胞质回缩、间隙增大、细胞之间不再连接成片时，立即终止消化，吸弃 消化液加入新鲜的DMEM培养液，用吸管将已经消化好的细胞吹打成单细胞悬液，将细胞悬 液吸出分装至3个培养瓶中，加入培养基旋紧瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养；(2)暴露实验将NIH/3T3细胞在细胞培养板上用DMEM培养液培养，将装有NIH/3T3细胞的培 养板置于横电磁波传输小室(Transverse Electromagnetic TransmissionCell，简称 TEM 小室)中，再将TEM小室置于5% CO2培养箱中，同时，将NIH/3T3细胞暴露于功率密度为 30ff/m2的电磁辐射下，设定培养箱温度为36. 5°C，每天辐射2小时，培养6周，电磁辐射由 Agilent 8648C信号源产生，经20W功率放大器放大，电磁辐射强度由Narda场强计控制；(3)软琼脂培养实验配制浓度分别为1. 2%和0. 6%的琼脂糖溶液，高压灭菌后置于40°C水浴中备用， 配制2XDMEM培养液，高压灭菌后置于37°C水浴中备用，在试管中加入2XDMEM培养液 lmL，再加入1. 2%琼脂糖溶液lmL，均勻混合后，倒入细胞培养板中，放置于室温，待凝固后 形成琼脂糖基础层，置于37°C、5% CO2培养箱中备用，另取一支试管，加入2XDMEM培养液 0. 5mL，再加入0. 6%琼脂糖溶液0. 5mL，然后接种0. 2mL NIH/3T3细胞悬液，均勻混合后，力口 在预先制备好的基础层上，放置于室温，待凝固后形成双层琼脂，将细胞培养板置于37°C、 5% CO2培养箱中培养2周，在倒置光学显微镜下观察细胞克隆形成的情况；(4) Scid小鼠致瘤实验收集经过电磁辐射的NIH/3T3细胞，用带6号针头的注射器抽取0. ImL细胞悬液， 注射于Scid小鼠背部皮下，平行对2只小鼠进行接种，饲养6周后观察致瘤情况，并将形成 的肿瘤组织经过固定、包埋和切片后，置于显微镜下进行病理切片检查。软琼脂糖培养的OTH/3T3细胞如图1所示，有细胞集落形成，集落中央有隆起 ，有 多层细胞。致瘤实验的两只Scid小鼠均出现了肿瘤，形成肿瘤的Scid小鼠接种处皮下出 现结节状隆起。瘤块体积为1 1. 5cm3，瘤块表面不平，质地硬，中间有坏死，与皮下组织粘 连，为梭形细胞肉瘤。肿瘤组织病理切片如图2所示，经染色可见瘤组织细胞相互重叠，呈类多角形，生长无方向性，失去接触抑制，向三度空间延伸，浸润并破坏肌层。实施例2步骤(2)中电磁辐射的功率密度为50W/m2，其它步骤同实施例1。两只Scid小鼠 均出现了肿瘤。实施例3
步骤(2)中电磁辐射的功率密度为70W/m2，其它步骤同实施例1。两只Scid小鼠 均出现了肿瘤。实施例4步骤(2)中电磁辐射的功率密度为90W/m2，其它步骤同实施例1。两只Scid小鼠 均出现了肿瘤。实施例5步骤(2)中暴露时间为4周，其它步骤同实施例1。两只Scid小鼠均出现了肿瘤。实施例6步骤⑵中暴露时间为4周，其它步骤同实施例2。两只Scid小鼠均出现了肿瘤。实施例7步骤⑵中暴露时间为4周，其它步骤同实施例3。两只Scid小鼠均出现了肿瘤。实施例8步骤⑵中暴露时间为4周，其它步骤同实施例4。两只Scid小鼠均出现了肿瘤。
权利要求
一种电磁辐射致癌的Scid小鼠模型及构建方法，包括以下步骤(1)NIH/3T3细胞的培养与传代将NIH/3T3细胞在37℃、5％CO2培养箱内用DMEM培养液培养，培养液中含有10％小牛血清、1％青霉素、1％链霉素和1％谷氨酰胺，当细胞生长增殖形成单层细胞并扩展汇合后，吸出旧培养液，加入0.03％Versene溶液冲洗一遍，吸出洗液，然后加入胰蛋白酶消化液37℃进行消化，消化结束后再进行传代；(2)暴露实验将NIH/3T3细胞在细胞培养板上用DMEM培养液培养，将装有NIH/3T3细胞的培养板置于横电磁波传输小室中，再将该小室置于5％CO2培养箱中，同时，将NIH/3T3细胞暴露于功率密度为30～90W/m2的电磁辐射下，设定培养箱温度为36.5℃，每天辐射2小时，培养4～6周；(3)软琼脂培养实验配制浓度分别为1.2％和0.6％的琼脂糖溶液，以及2×DMEM培养液，培养液中含有20％小牛血清、2％青霉素、2％链霉素和2％谷氨酰胺，向一支试管中加入2×DMEM培养液和1.2％琼脂糖溶液各1mL，倒入细胞培养板中，待凝固后制成琼脂糖基础层，再向另一支试管中加入2×DMEM培养液和0.6％琼脂糖溶液各0.5mL，然后接种0.2mL NIH/3T3细胞溶液，均匀混合后加在基础层上，待凝固后制成双层琼脂，将细胞培养板置于37℃、5％CO2培养箱中培养2周；(4)Scid小鼠致瘤实验收集经过电磁辐射的NIH/3T3细胞，对2只Scid小鼠进行背部皮下接种，每只小鼠注射细胞悬液0.1mL，饲养6周后对形成的瘤块进行病理切片检查。
全文摘要
本发明涉及一种电磁辐射致癌的Scid小鼠模型及构建方法。该方法首先培养NIH/3T3细胞并传代，然后将细胞暴露于30～90W/m2的电磁辐射下，培养4～6周，再进行软琼脂糖培养实验，并接种于Scid小鼠进行致瘤实验。结果表明软琼脂糖实验中有细胞集落形成，致瘤实验中Scid小鼠均产生肿瘤。本发明方法建立了电磁辐射诱发肿瘤的Scid小鼠模型，效果显著、步骤简单、重复性好。本发明方法建立的体外细胞转化实验模型可用于模拟体内细胞的恶性转化，为电磁辐射诱发肿瘤的发病机制及防治措施的研究提供了一种良好的实验模型和有力的技术手段。本发明方法可以应用于工业、科学、医疗以及日常生活中电磁辐射的致癌性风险预评价，对预防电磁辐射对人体健康的远期危害具有重要价值。
文档编号A01K67/027GK101838633SQ20101012338
公开日2010年9月22日 申请日期2010年3月12日 优先权日2010年3月12日
发明者崔亚松, 曾毅, 赵丽娇, 钟儒刚 申请人:北京工业大学