专利名称：三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6基因及其编码蛋白和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术领域，具体的说是一种三疣梭子蟹抗脂多糖因子 PtALF-6基因及其编码蛋白和应用。
背景技术：
三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是一种重要的海产经济蟹类，由于其营养价值丰富、生长迅速等优点，已成为我国重要海水养殖品种。但随着养殖规模不断扩大以及集约化程度不断提高，由细菌、真菌等引起的多种疾病在三疣梭子蟹养殖群体中频频爆发，造成了巨大的经济损失，严重制约了三疣梭子蟹养殖产业的健康可持续发展。由于对三疣梭子蟹的免疫系统缺乏深入了解，目前蟹病的防治仍主要采用传统抗生素药物防治，但长期盲目滥用药物，造成抗药性问题日益严重，非但难以有效地控制病情，反而带来资金的浪费，蟹品质的下降，环境污染及对人类健康构成潜在威胁等不良后果。因此，这就迫切需要从三疣梭子蟹自身的免疫防御因子入手研究其抗病机制和开发新型的抗菌药物进行免疫防治。抗脂多糖因子(ALF)是一种能够结合脂多糖(LPS)并中和其毒性作用的小分子抗菌肽，因其作用机制与传统抗生素不同，细菌不易产生耐药性，对正常真核细胞无毒害，日益受到广泛关注。ALF最初是从美洲鲎中发现，它可以结合LPS，并对R型革兰氏阴性菌有明显的抑制生长作用。晶体结构分析表明，鲎ALF结构中有两个高度保守的半胱氨酸残基， 它们形成二硫键所限制的β折叠区域即为LPS结合域。体外合成鲎ALF的LPS结合域，证明其确实可以与LPS结合，能够在体外调节细胞因子的分泌，有助于保护小鼠免受内毒素的攻击。随后，从对虾、螯虾、蟹等甲壳动物中也鉴定或克隆出多种抗脂多糖因子。研究表明这些甲壳动物ALF的表达水平在细菌刺激后明显上调，其重组蛋白能够抑制革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的生长，提示ALF在甲壳动物固有免疫中发挥重要作用。到目前为止，关于三疣梭子蟹抗脂多糖因子的报道较少。因此，识别、定性抗菌效应分子_抗脂多糖因子对研究三疣梭子蟹的免疫防御机制和进行病害防治具有重要的理论和实践意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6基因及其编码蛋白和应用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6基因三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6 基因为序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列所示。三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6基因编码蛋白所述PtALF-6基因编码蛋白为序列表SEQ ID No. 2中氨基酸序列所示。
三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6基因编码蛋白的应用所述三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6基因的重组表达产物可制备为抗菌药物、免疫增强剂、饲料添加剂、防腐剂或保鲜剂。所述三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6基因的重组表达产物可作为革兰氏阴性菌、真菌的抑菌药物。所述革兰氏阴性菌为溶藻弧菌、铜绿假单胞菌、爱德华氏菌，真菌为毕赤酵母。本发明所具有的优点 本发明利用表达序列标签技术(EST)、RACE技术从三疣梭子蟹中克隆到PtALF-6 基因cDNA全长序列，通过PCR技术扩增编码PtALF-6成熟肽的基因片段并将其克隆到 pET32a(+)表达载体中，在大肠杆菌BL21(DE3)-plysS实现体外重组表达。重组蛋白经 TALON柱纯化和透析复性后，对革兰氏阴性菌溶藻弧菌、铜绿假单胞菌、迟缓爱德华氏菌、 真菌毕赤酵母具有显著的抑菌活性，最小抑菌浓度分别为1. 00 μ M、2. 01 μ Μ、16. 08 μ Μ、 16. 08 μ M ；而对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌没有明显的抑制作用。本发明基因及其重组蛋白在药物生产、免疫增强剂、饲料添加剂以及防腐剂和保鲜剂生产中的应用，另外还可以进一步研究三疣梭子蟹免疫防御机制提供基础，并为三疣梭子蟹的病害防治、基因辅助选育和饲料添加剂。
图1为本发明实例提供的纯化的三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6编码成熟肽的基因扩增产物(其中，M =DNA marker, 1 成熟肽的基因扩增产物)。图2为本发明实例提供的诱导和纯化的三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6重组蛋白(其中M 蛋白marker ;1 未诱导菌体中表达的蛋白；2 :IPTG诱导后表达的蛋白；3 纯化的重组蛋白)。
具体实施例方式下面的实施例中将本发明作进一步阐述，但本发明不限于此。本发明中的三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6的cDNA序列克隆包括下列步骤a)三疣梭子蟹总RNA的提取及mRNA的纯化；b)三疣梭子蟹cDNA文库构建；c)三疣梭子蟹cDNA文库EST序列的大规模测定；d)三疣梭子蟹EST序列的同源性分析及Pt ALF-6基因片段的筛选；e) RACE扩增获得PtALF-6的全序列以及全序列的验证。实施例1.三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6基因为SEQ ID No. 1中所示的碱基序列。序列表SEQ ID No. 1 为:ggggattcag tgggtgatga gctacgagaa gtaataacaa cagcatcaaaagcaacgcca acgagttttc atcaagtgtt gcccttgctt ccctccacgagcttccctca ag atg egg aaa gga gtg gtg gcc ggc ctg tgcctg gca ctg gtg gtg atg tgc ctg tac ctg ccc cag cct tgc
gag get cag tat gag get ctg gta act tcc att ctt gga aaactc act gga ctg tgg cac aac gac tcg gtg gac ttc atg ggccac att tgc tac ttc cgc cgc cgc cct aag ate aga aga ttt
aag ctg tac cac gag ggc aag ttt tgg tgt cct ggt tgg gcgcct ttc gag ggc agg tgt aag tat tgt gtc gtc ttc tgaattattattt tttttttcat acctgaatat tgatactaat ctccgtttggtttcgcagcg aggacaaaga gcaggtcggg gtcatccagg gaggccaccaaggacttcgt gcgcaaagct ttacagaacg gactcgtcac acagcaggatgcttctctgt ggctgaataa ctaaagcaga ggaagtgagt gctgtgtacgacgaggagga gaaagaggat aacatgaaag taactgtctg acttgtaatcatatattttt ttttttctca agggacttgc tggtaaatgc aaggttaatgaaactatgga ggtagtgaac gtgatggaaa gtcaagtatg tggagaagtaccacatatat ttttttttat agatttttct aatgtacttg cgtctttgcctttttctctc agtttccacc atcagtgcct ttgacactta tgctaaaaacgaaaatgaaa tgaaagaaaa atagatatat aattacaaac acaaaatatatagaagacga aaaacaaaga aatccatcat atcttaacta ttataacggtagtaagccta ttttcttttt ttatggatga ggtaagaaaa agtaatgaaacatatcttaa ttgcacttga gctgttggat cgtaatagcc gtaagacttgaaaaagacat tcagttactt gttgtatctc taaactctct ataagtgttaataaagatat atgctgttga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa(a)序列特征參长度1138bp(有效长度 113-391)參类型碱基序列參链型单链參拓扑结构线性(b)分子类型双链DNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)(f)特异性名称CDS构建具体操作如下1.三疣梭子蟹总RNA的提取及mRNA的纯化利用Invitrogen公司的Trizol试剂提取三疣梭子蟹总RNA，利用QIAGENE公司的Oligitex mRNA纯化试剂盒纯化mRNA。2.三抚梭子蟹cDNA文库构建利用Clontech公司的Creator Smart cDNA Library Construction Kit试剂盒使用说明构建cDNA文库。以纯化后的mRNA为模板， SMART IV Oligonucleotide^' AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG 3')和CDS 111/3'PCR Primer (5r ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T) 30N_1N 3')为引物，在反转录酶(MMLV reverse transcriptase)作用下转录合成 cDNA 第一链。用 5' PCR Prime r(5' AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT 3')和 CDSII1/3' PCR Primer(5‘ ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d (T) 30N_1N3')为引物经 long distance (LD-PCR)合成 cDNA 第二链。双链 cDNA(ds cDNA)在45°C条件下经蛋白酶K(0. 8mg/ml)消化20min，然后用Sf Π酶进行酶切， 酶切产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳，利用QIAGEN公司QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit回收l-3kb的片段。将回收的片段与载体pDNR-LIB连接后纯化，通过电转化导入大肠杆菌感受态细胞，37°C条件下220rpm/min培养lh，加入终体积20%的甘油，即为全长cDNA 原始文库。3.三疣梭子蟹cDNA文库EST序列的大规模测定文库中筛选阳性克隆，使用载体通用引物M13F(5' TGTAAAACGACGGCCAGT 3')在ABI 3730x1测序仪上进行序列测定，将得到的原始峰图文件(*. abl，*. abd文件)数据经Phred程序处理转化为序列文件(*. seq) 和质量文件(*. seq. qual)，依据质量文件提供的数值确定获得序列的误差概率，去除低质量的碱基，用cross-match程序屏蔽数据中的载体序列，从得到的数据中选取连续碱基质量大于Q13(准确率大于95% )且长度大于IOObp的序列作为EST数据，具体《基因表达序列(EST)数据分析手册》(胡松年著，浙江大学出版社，2005年)。
4.三疣梭子蟹EST序列的同源性分析及PtALF-6基因片段的筛选将获得的全部有效的EST数据进行聚类拼接，生成Contigs和Singletons，分别将所获得的Contigs与 Singletons在数据库中进行BLASTn和BLASTx分析，结果显示在EST序列中发现了与岸蟹抗脂多糖因子相似性较高(75% )的序列，根据相似性分析结果确定了三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6基因的EST序列。5.三疣梭子蟹PtALF-6基因cDNA全长序列的克隆根据与PtALF-6 基因同源的EST序列设计特异引物Fl (5 ‘ GTAAGTATTGTGTCGTCTTCTGA 3 ‘)和Rl(5 ‘ CGAAACCAAACGGAGATTAG3 ‘)，分别禾U用载体通用引物 M13F(5' TGTAAAACGACGGCCAGT 3')禾口 M13R(5' CAGGAAACAGCTATGACC 3')进 亍 3'禾口 5'末端的扩增。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，用Axygen胶回收试剂盒进行 PCR产物回收和纯化，再与pMD-18T载体(大连宝生物工程有限公司)连接，然后转化大肠杆菌感受态Transl-Tl (北京全式金生物技术有限公司)，挑选阳性克隆用载体引物Μ13-47 和RV-M进行测序，所得结果经Phred/Phrap软件进行拼接，得到三疣梭子蟹PtALF-6基因全长cDNA序列见SEQ ID No. 1。6.三疣梭子蟹PtALF-6基因cDNA全长的验证在测序拼接的PtALF-6全长序列上设计两对弓 I 物 F2 (5 ‘ GCTTCCCTCAAGATGCGGAAAG3 ‘)和 R2 (5 ‘ CAAACGGAGATTAGTATCAAT 3' )、F3(5‘ CTAATCTCCGTTTGGTTTCG 3')和 R 3 (5 ‘ TCAAGTCTTACGGCTATTAC3‘)，以 cDNA为模板进行全长的验证。测序及分析同5。3' RACE扩增反应体系及反应条件25 μ 1反应体系IOxPCR buffer2. 5 μ 1
MgCl2 (25mM)1. 5 μ 1
dNTP (IOmM)0. 5 μ 1
引物 Fl (5μΜ)Ιμ
引物 M13R(5MM)1 μ 1
cDNA文库模板1 μ 1
Taq DNA 聚合酶(5U/ μ 1 )0. 2 μ 1
細2017. 3μ 1反应在 TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Model TP600 (Takara Bio Inc.)中进行，反应条件为94°C变性3min ；94°C变性30s，57°C退火50s，72°C延伸lmin，34个循环； 72°C延伸 lOmin。5' RACE扩增反应体系及反应条件25 μ 1反应体系
IOxPCR buffer2. 5 μ 1
MgCl2 (25mM)1. 5 μ 1
dNTP (IOmM)0. 5 μ 1
引物 Rl (5μΜ)1 μ 1
引物 M13F(5pM)1 μ 1
cDNA文库模板1 μ 1
Taq DNA 聚合酶(5U/ μ 1 )0. 2 μ 1
ddH2017. 3μ 1反应在 TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Model TP600 (Takara Bio Inc.)中进行，反应条件为94°C变性3min ；94°C变性30s，58°C退火50s，72°C延伸lmin，34个循环； 72°C延伸 lOmin。全长验证的PCR反应体系和反应条件为25 μ 1反应体系
IOxPCR buffer2. 5 μ 1
MgCl2 (25raM)1. 5 μ 1
dNTP ( IOraM)0. 5 μ 1
引物 F2 (5μΜ)Ιμ
引物 R2 (5μΜ)Ιμ
cDNA文库模板1 μ 1
Taq DNA 聚合酶(5U/ μ 1 )0. 2 μ 1
ddH2017. 3μ 1SiS^TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Model TP600 (Takara Bio Inc.)中it 行，反应条件为94°C变性3min ；94°C变性30s, 57. 5°C退火50s，72°C延伸40s，34个循环； 72°C延伸 lOmin。25 μ 1反应体系10xPCR buffer2. 5 μ 1
MgCl2 (25mM)1. 5 μ 1
dNTP (IOmM)0. 5 μ 1
引物 F3(5juM)Ιμ
引物 R3(5]uM)Ιμ
cDNA文库模板1 μ 1
Taq DNA 聚合酶(5U/ μ 1 )0. 2 μ 1
ddH2017. 3μ 1反应在 TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Model TP600 (Takara Bio Inc.)中进行，反应条件为94°C变性3min ；94°C变性30s，56°C退火50s，72°C延伸40s，34个循环； 72°C延伸 lOmin。序列表SEQ ID No. 1从三疣梭子蟹中克隆到PtALF_6基因cDNA全长1138bp， 其中开放阅读框279bp，5'非翻译区112bp，3'非翻译区747bp，有多聚腺苷酸加尾信号 (AATAAA)和多聚腺苷酸尾巴。实施例2.三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6序列表SEQ ID No. 1所述碱基序列，所述的氨基酸序列如序列表SEQ ID No. 2所述。序列表SEQ ID No. 2 为:Met Arg Lys Gly Val Val Ala Gly Leu Cys Leu Ala Leu Val Val MetCys Leu Tyr Leu Pro Gln Pro Cys Glu Ala Gln Tyr Glu Ala Leu ValThr Ser lie Leu Gly Lys Leu Thr Gly Leu Trp His Asn Asp Ser ValAsp Phe Met Gly His lie Cys Tyr Phe Arg Arg Arg Pro Lys lie ArgArg Phe Lys Leu Tyr His Glu Gly Lys Phe Trp Cys Pro Gly Trp AlaPro Phe Glu Gly Arg Cys Lys Tyr Cys Val Val Phe其具有完整的编码蛋白含有92个氨基酸，其中编码序列的1-26个氨基酸为信号肽，成熟肽包含66个氨基酸，预测的分子量为7. 96Da，等电点为9. 46。成熟肽具有典型的抗脂多糖因子模式结构两个保守的半胱氨酸残基和保守单元W(T)CPGWT(A),两个保守的半胱氨酸残基形成二硫键，构成一个典型的β发夹结构。三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6重组蛋白的获得，具体操作如下 根据SEQ ID No. 2对应的cDNA序列，设计含有限制性内切酶BamHI和XhoI酶切位点的特异性引物 F4 (5 ‘ GGATCCCAGTATGAGGCTCTGGTAA3 ‘)和 R4 (5 ‘ CTCGAGTCAGAA GACGACACAATACTTAC 3')，通过PCR技术扩增编码PtALF-6成熟肽的基因片段(参见图 1), β,Ι^ TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Model TP600 (Takara Bio Inc.)中iti于， 反应条件为94°C变性3min ；94°C变性30s，59°C退火50s，72°C延伸30s，34个循环；最后72°C延伸lOmin。然后通过酶切将其克隆到pET32a(+)表达载体中，转化到大肠杆菌 BL21 (DE3)-plysS，测序确认表达框正确后，接种阳性克隆到LB培养基中，37°C振荡培养至 0. D. 600 = 0. 4-0. 6，加入IPTG至终浓度为ImM诱导4小时后离心收集菌体。菌体在冰浴条件下用超声波180W处理30-60min (每次2s，间隔2s)，离心去掉上清，收集沉淀(含重组蛋白包涵体)。沉淀以8M的尿素溶解后，利用Clontech公司的TALON柱纯化重组产物。将纯化的重组蛋白转移到透析袋中，4°C条件下，在含有2mM还原谷胱苷肽、0. 2mM氧化谷胱苷肽、Imm EDTA、50mM Tris_H Cl、50mM NaCl、10%甘油和1 %甘氨酸的及梯度降低的尿素 (6M、5M、4M、3M、2M、1M、0M)的透析复性液(pH = 8. 0)中透析，使重组蛋白复性，最后在50mM Tris-HCl (pH = 8. 0)的缓冲液透析2次，以除去溶液中其它成分。透析复性后的重组蛋白经PALL公司的Micros印Advance超滤离心浓缩管进行浓缩，用碧云天公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒测得三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6重组蛋白的浓度为1. 65mg/ml (参见图2)。实施例3.三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6重组蛋白的体外抑菌试验1.微生物的培养及制备溶藻弧菌用TSB培养基28°C，铜绿假单胞菌用TSB培养基37°C，迟缓爱德华氏菌用LB培养基28°C，金黄色葡萄球菌用LB培养基37°C，藤黄微球菌用LB培养基37°C，毕赤酵母用YPD培养基28°C，上述各菌株用摇床220rpm/min培养使菌浓度达到对数生长期时，分别用50mM Tris-HCl (pH = 8. 0)缓冲液稀释菌体，分别使其每毫升菌液中的菌落数约为1X103。2.重组蛋白PtALF-6抑菌活性测定利用上述实施例所得重组蛋白PtALF-6用 Tris-HCl (50mM, pH = 8. 0)梯度稀释(1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128)后，取 50 μ 1 加到无菌平底 96 孔板(Costar, Fisher)中，50 μ 1 Tris-HCl (50mM, pH = 8. 0)设为对照，然后加入50 μ 1稀释好的菌悬液，并且混勻。只加入50 μ 1菌液的孔为空白孔。 96孔板在菌液的培养温度下孵育3小时后，加入相应的培养基150 μ 1，空白孔加入培养基 200 μ 1,.孵育过夜。加溶藻弧菌、铜绿假单胞菌、迟缓爱德华氏菌、毕赤酵母的96孔板在波长为560nm的可见光下读数，加金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌的96孔板在波长为600nm 的可见光下读数。发现上述实施例重组蛋白PtALF-6对革兰氏阴性菌溶藻弧菌、铜绿假单胞菌和迟缓爱德华氏菌、真菌毕赤酵母有明显的抑制作用，最小抑菌浓度分别为Ι.ΟΟμΜ、 2. 01 μ Μ、16. 08 μ Μ、16. 08 μ M ；而对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌没有明显的抑制作用。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6基因，其特征在于三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6基因为序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列所示。
2.—种权利要求1所述的三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6基因编码蛋白，其特征在于所述PtALF-6基因编码蛋白为序列表SEQ ID No. 2中氨基酸序列所示。
3.一种按权利要求2所述的三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6基因编码蛋白的应用， 其特征在于所述三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6基因的重组表达产物可制备为抗菌药物、免疫增强剂、饲料添加剂、防腐剂或保鲜剂。
4.按权利要求3所述的三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6基因编码蛋白的应用，其特征在于所述三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6基因的重组表达产物可作为革兰氏阴性菌、真菌的抑菌药物。
5.按权利要求4所述的三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6基因编码蛋白的应用，其特征在于所述革兰氏阴性菌为溶藻弧菌、铜绿假单胞菌、迟缓爱德华氏菌，真菌为毕赤酵母。
全文摘要
本发明属于分子生物学技术领域，具体的说是一种三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6基因及其编码蛋白和应用。本发明利用cDNA文库和RACE技术从三疣梭子蟹中扩增到PtALF-6基因cDNA，该基因在三疣梭子蟹免疫防御方面发挥着重要作用。重组的PtALF-6蛋白对革兰氏阴性菌溶藻弧菌、铜绿假单胞菌和迟缓爱德华氏菌、真菌毕赤酵母具有较强的抑菌活性，最小抑菌浓度分别为1.00μM、2.01μM、16.08μM、16.08μM；而对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌没有明显的抑制作用。本发明为三疣梭子蟹的病害防治、基因辅助选育和饲料添加剂开发奠定基础。
文档编号A23K1/16GK102329803SQ20111029050
公开日2012年1月25日 申请日期2011年9月23日 优先权日2011年9月23日
发明者刘媛, 崔朝霞 申请人:中国科学院海洋研究所