专利名称：厚叶岩白菜离体培养和快速繁殖的方法
技术领域：
本发明属于植物快繁方法技术领域，具体为厚叶岩白菜离体培养和快速繁殖。
背景技术：
厚叶岩白菜crassifolia (Linn. ) Fritsch)为虎耳草科岩白菜,属多年生常绿草本，是同属植物中形体较大种类 ，国内野生种仅见分布于新疆阿尔泰山海拔2000 m左右灌木丛下的岩石缝隙中，在蒙古、俄罗斯、朝鲜也有少量分布，开花极早，进人冬季，叶片呈红绿色或紫红色，花叶俱美，观赏价值高。全草含有岩白菜素，是治疗呼吸系统疾病的特效药，岩白菜素存在于我国五科九属植物中，在意大利、日本、印度等国家植物中也有发现，但为不同科属，岩白菜素得率差别很大，其中以厚叶岩白菜得率最高，约4. 5%，并含有独特的缩合鞣质、熊果酚甙等物质。自然状态下，厚叶岩白菜主要靠地下根状茎分株繁殖，繁殖率低，生长缓慢。自然结实率极低，春季播种出苗率最高也仅达22. 5%，实生苗也非常细小，幼苗很难在恶劣的环境下存活。种子细小，千粒重仅为O. 21g，无后熟休眠特性，成熟撒落时，原生长地的气温阻碍了种子的萌发，所以目前未实现大规模的人工栽培。岩白菜属植物主要含有三大类物质酚类、黄酮类以及多糖类等，酚类物质容易引起离体培养中植物材料的褐变。其根状茎粗大，长期深埋于土壤中，感染各种外源微生物机会多，而且有报道岩白菜属植物中存在众多内生真菌。植物材料褐变和内生菌引发的污染，成为岩白菜能否离体培养成功进而实现快速繁育的瓶颈所在。国内外植物界在化学成分分析、资源开发、临床应用、栽培驯化上都有了较深的研究。随着厚叶岩白菜药用价值的拓宽和绿化用途的提升，野生资源被过度的采挖利用，野生岩白菜属植物资源日趋濒危。为兼顾植物多样性保护与资源的合理开发，我们进行了系统引种栽培驯化试验，在单株选优的基础上开展了快速繁殖技术研究，不仅有益于经济发展，保护野生资源，也是制药企业长期持续发展的必由之路，从根本上解决岩白菜属药用植物资源尖锐的供需矛盾。
发明内容
本发明目的在于提供一种厚叶岩白菜离体培养和快速繁殖的方法，在离体条件下快速繁殖厚叶岩白菜，且生产的厚叶岩白菜种苗品质高，一致性好。本发明解决上述技术问题所采取的技术方案包括下述步骤取厚叶岩白菜外植体在无菌环境下，经初代培养、增殖培养、壮苗培养和生根培养获得再生植株，进行栽种，其按下列步骤进行
所述的初代培养选择并清洗、消毒处理带顶芽的新鲜根状茎获得起始的无菌试管苗，在无菌环境的显微镜下修切为O. 2^0. 5mm大小的芽点，接种到初代培养基上，进行初代培养，获得初代培养的无菌苗，所述的初代培养基为
MS+6-BA0. 15 O. 25mg · I/1+NAAO· 15 O. 25mg · L-1+VC0. 5 5. Omg · L-1+ 蔗糖 25 35g · L-1+琼脂 4 8g · L 1 ;
所述的增殖培养是将初代培养的无菌苗转入增殖培养基，诱导不定芽，该增殖培养基
为
MS+BAO. 5 3. 5mg · L ^NAAO. 2 I. 5mg · L ^VCO. 5 5. Omg .L1+ 鹿糖 25 35 g · L :+ 琼脂4^8 g .171,诱导出丛生芽；
所述的壮苗培养将诱导出的丛生芽分切后，转移至壮苗培养基，进行壮苗培养，获得
I.5cm以上的试管苗；
所述的生根培养将经壮苗培养生长到I. 5cm以上的试管苗分切后，转移至生根培养基中，获得生根试管苗，该生根培养基为1/2MS+NAA1. 5 4. 5mg Γ'+ΙΒΑΟ. 5 2· 5 mg Γ1+ VCO. 5 5· Omg · L-1 + 蔗糖 15 25g · L-1+ 琼脂 4 8g · L-1 ；
最后，对所得的生根试管苗进行清洗，移至珍珠岩、草炭土、腐殖质的混合基质中进行栽种。本发明选用VC做为抗褐化剂，凡是有切割植物操作的试验中，无菌水或培养基都要添加VC，保证整个流程中，褐化率比较低，不影响试验的顺利进行。采用茎尖消毒后，继续无菌修切为O. 2^0. 5mm大小芽点的方法，可以有效克服外源微生物和内生菌引起的植物材料污染，是保证整个快繁培养的关键步骤之一。本发明一旦得到无菌苗后，可以利用无菌苗诱导增殖出大量不定芽，不定芽生根和移栽成活后，即再生为完整植株，形成了一个良好的生产体系。到目前为止，仅见中国科学院新疆理化技术研究所在野生厚叶岩白菜愈伤组织发生途径方面有所报道，但未见标准化育苗方面报道。本发明在单株选优的基础上，采用直接器官发生形式，通过对培养基成分、激素配比以及环境因子的确定，建立了厚叶岩白菜完整的再生体系，以芽繁芽进行组培快繁生产出来的试管苗无变异发生，可以保持母本的优良性状，使得这一日趋枯竭的濒危物种得以保存和繁育。本发明中，所用到的培养基及激素包括
MS培养基(Murashing and Skoog medium,以下简称MS),MS配方中的药品成分和培养基的具体配制方法为现有公知技术，在此不再赘述。附加的植物激素为6-节基氨基嘌呤(benzylaminopurine,简称为6-BA)、奈乙酸(naphthylene acetic acid,简称为 NAA)、卩引哚丁酸(3_Indolebutyric acid,简称为 IBA)、维生素C ( Vitamin C，简称VC)。方法包括下述步骤
a、选择生长健壮，无病虫害厚叶岩白菜地下生长的带顶芽的新鲜根状茎做为起始外植体，用洗洁精擦洗表面流水冲洗20分钟，再进行消毒处理。b、将消毒处理后的茎尖在无菌环境的显微镜下继续修切为O. 2^0. 5mm大小的芽点，接种到初代培养基上，进行初代培养；
C、将初代培养的无菌苗转入增殖培养基，该增殖培养基为MS+BAO. 5^3. 5mg -L^+NAAO. 2 I. 5mg · L^+VCO. 5 5. Omg · L-1+ 蔗糖 25 35 g · L-1+ 琼脂 4 8 g · L—1，诱导不定芽；
d、将诱导出的丛生芽分切，转移至壮苗培养基，进行壮苗培养；
e、将经壮苗培养生长到I.5cm以上的试管苗分切后，转移至生根培养基中，该生根培养基为 1/2MS+NAA1. 5 4. 5mg · I^+IBAO. 5 2· 5 mg · L-1+ VC0. 5 5. Omg · L-1 + 蔗糖15 25g · L—1+琼脂 4 8g · L-1。f、对所得的生根试管苗进行清洗，移至珍珠岩、草炭土、腐殖质的混合基质中进行栽种。步骤a中，取厚叶岩白菜包含顶芽生长点的根状茎，切取成为长度O. 5^1cm,直径为O. 3^0. 6cm的圆柱体，并使顶芽生长点位于圆柱体的中央，保留两片叶柄基部保护生长点，进行消毒处理。步骤a中，先用72%浓度的酒精消毒3(T60s，再用无菌水冲洗3 4次，然后用加有2 4滴吐温80的O. I O. 2%的升汞液(含O. 5 5. Omg · L^1VC)浸泡15 30分钟，用含O. 5^5. Omg · PVC无菌水冲洗至无残留，得到无菌的外植体。步骤b中，将步骤a中所得到的无菌外植体在无菌环境的显微镜下继续修切为O. 2 O. 5mm大小的芽点，接种到初代培养基MS+6-BA0. 15 O. 25mg L^+NAAO. 15 O. 25mg .171+VC O. 5 5. Omg · L-1 + 蔗糖 25 35g · Γ1+ 琼脂 4 8 g · L'·步骤c 中，所述的最佳增殖培养基为 MS+BA3mg · L_1+NAA1 mg · I71+ VC2. 5 mg · L-1+蔗糖30g · Γ1+琼脂6 g · L—1，丛芽增殖率为I :3 5
步骤d中，所述的壮苗培养基为MS+6-BA0. 15 O. 25 mg · I^+IBAO. 15 O. 25mg · Γ1+ VC
O.5 5. Omg · L-1+蔗糖25 35g · L-1+琼脂4 8 g · Λ苗高可以达到2 3厘米，4 7片叶。步骤e中，所述的最佳生根培养基为l/2MS+NAA2mg · L_1+IBA Img · Γ1+ VC2. 5mg · L-1+蔗糖20g · L-1+琼脂6g · L_\生根率为85 95 %，平均生根数3. 37条，根长2 3厘米。步骤b至e中，初代培养、增殖培养、壮苗培养和生根培养的培养条件均为无菌环境，光周期为l(Tl5h/d，光照强度150(Γ25001χ，培养温度为室温。步骤b至e中，初代培养的周期为22 28天，增殖培养的周期为28 32天，壮苗培养的周期为18 22天，生根培养的周期为28 32天。步骤f中，将生根试管苗置于自然环境中6 10天，取出洗净根部，用50(Γ600倍托布津水溶液浸泡数秒，移栽到草炭土、珍珠岩和腐殖质的混合基质中，起始6 10天内保持苗的叶面湿润并适当遮阳，其后按干透湿透的原则浇水，逐渐加强光照至全光照，进行栽种。步骤f中，生根试管苗移栽入混合基质的营养成分为草炭土 珍珠岩腐殖质=2:1:1。在上述方案的基础上，步骤a中，所述的外植体长度为O. 5 lcm，可以为O. 5,0. 6、
O.7,0. 8,0. 9、lcm，直径为 O. 3 O. 6cm，可以为 O. 3,0. 4,0. 5,0. 6 的圆柱体。在上述方案的基础上，步骤a中，所述的清洗消毒处理的方法包括取厚叶岩白菜根状茎，用水冲洗干净，去除叶片和肉质根，切成圆柱体，并使根状茎的生长点位于圆柱体的中央，保留两片叶柄基部保护生长点，先用72%浓度的酒精消毒3(T60s，再用无菌水冲洗3 4次，然后用加有2 4滴吐温80的O. I O. 2%的升汞液(含O. 5 5. Omg -L^1VC)浸泡15 30分钟，用含O. 5^5. Omg · L^1VC无菌水冲洗至无残留无异味，得到无菌的外植体。具体的，72%浓度酒精消毒可以为30s、40s、50s、60s，升汞液浓度可以为O. 1%、
O.15%、0· 2%, VC 浓度可以为 O. 5、I. O、I. 5,2. 0,2. 5,3. 0,3. 5,4. 0,4. 5,5. O mg .Γ1，浸泡时间可以为15、18、20、25、28、30分钟。
在上述方案的基础上，步骤b中，所述的芽点大小为O. 2^0. 5mm，可以为O. 2、O. 3、O. 4、0· 5mm大小的芽点。在上述方案的基础上，步骤b中，所述初代培养基为MS+6-BA0. 15^0. 25mg -L^+NAA
0.15 O. 25mg · L ^VCO. 5 5. Omg · L 1 + 鹿糖 25 35g .L1+ 琼脂 4 8g · L、具体的，在初代培养基中，6-BA的激素浓度可以为O. 15,0. 18,0. 2,0. 22,0. 25mg ·I/1，NAA 的激素浓度可以为 O. 15,0. 18,0. 2,0. 22,0. 25 mg ·Ι^，VC浓度可以为 O. 5,1. O、
1.5,2. 0,2. 5,3. 0,3. 5,4. 0,4. 5,5. O mg · Γ1，蔗糖的浓度可以为 25、28、30、32、35 g · Λ琼脂的浓度可以为4、5、6、7、8 g.L-1。在初代培养过程中，培养条件为无菌室内光周期为l(Tl5h/d，优选12h/d，光照强度150(Γ25001χ，优选20001χ，培养温度为室温，优选25 °C，培养周期为22 28天，优选25 天。在上述方案的基础上，步骤c中，所述增殖培养基为MS+BAO. 5^3. 5mg -L^+NAAO. tT
1.5mg · L kVCO. 5 5. Omg .L1+ 鹿糖 25 35g .L1+ 琼脂 4 8g · L、具体的，BA的激素浓度可以为 O. 5、I. O、I. 5,2. 0,2. 5,2. 8,3. 0,3. 2,3. 5 mg · ΛNAA 的激素浓度可以为 O. 2,0. 4,0. 8,1. 0,1. 2,1. 5 mg · L_\ VC 浓度可以为 O. 5,1. 0,1. 5、
2.0,2. 5,3. 0,3. 5,4. 0,4. 5,5. O mg · L—1，蔗糖的浓度可以为 25,28,30,32,35 g · Λ 琼脂的浓度可以为4、5、6、7、8 g.L—1。所述的增殖培养基最佳的激素组合及浓度为MS+BA3mg · L—1+NAAlmg · L_1+VC2. 5mg · L—1+ 鹿糖 30g · L—1+ 琼脂 6g · L—1 ;在增殖培养过程中，培养条件为无菌室内光周期为l(Tl5h/d，优选12h/d，光照强度150(Γ25001χ，优选20001χ，培养温度为室温，优选25°C，培养周期为28 32天，优选30天，由此厚叶岩白菜试管苗的月增殖系数平均为3. 65。在上述方案的基础上，步骤d中，所述的壮苗培养基为MS+6-BA0. 15^0. 25mg -L^+IBAO. 15 O. 25mg · L ^VCO. 5 5. Omg .L1+ 鹿糖 25 35g .L1+ 琼脂 4 8g · L、具体的，在壮苗培养基中，6-BA的激素浓度可以为O. 15,0. 18,0. 2,0. 22,0. 25mg -I/1, IBA 的激素浓度可以为 O. 15,0. 18,0. 2,0. 22,0. 25 mg ·Ι^，VC浓度可以为 O. 5,1. O、
I.5,2. 0,2. 5,3. 0,3. 5,4. 0,4. 5,5. O mg · Γ1，蔗糖的浓度可以为 25、28、30、32、35 g · Λ琼脂的浓度可以为4、5、6、7、8 g.L-1。优选的壮苗培养基为MS+6-BA0.2mg · I^+IBAO. 2mg · L_1+VC2. 5 mg · Γ1+ 蔗糖30g · Γ1+琼脂6g · Γ1 ;在壮苗培养过程中，培养条件为无菌室内光周期为l(Tl5h/d，优选12h/d，光照强度150(Γ25001χ，优选20001χ，培养温度为室温，优选25°C，培养周期为18 22天，优选20天,由此试管苗长至I. 5cm高，比较整齐。在上述方案的基础上，步骤e中，所述生根培养基为1/2MS+NAA1. 5^4. 5mg -L^+IBA
O.5 2. 5mg · L ^VCO. 5 5. Omg · L 1 + 鹿糖 15 25g .L1+ 琼脂 4 8g · L、具体NAA的激素浓度可以为 I. 5,2. 0,2. 5,3. 0,3. 5,3. 8,4. 0,4. 2,4. 5 mg · Λ IBA的激素浓度可以为 O. 5,1. 0,1. 5,2. 0,2. 5 mg · L_\ VC 浓度可以为 O. 5,1. 0,1. 5,2. 0,2. 5、
3.0,3. 5,4. 0,4. 5,5. O mg · L—1，蔗糖的浓度可以为 15、18、20、22、25 g · L—1，琼脂的浓度可以为 4、5、6、7、8 g · L'所述的生根培养基最佳的激素和矿质元素及碳源组合浓度值为l/2MS+NAA2mg · L^+IBAlmg · L_1+VC 2. 5mg · Γ1+ 蔗糖 20g · Γ1+ 琼脂 6 g · Γ1 ;培养条件为无菌室内光周期为l(Tl5h/d，优选12h/d，光照强度150(Γ25001χ，优选20001χ，培养温度为室温，优选25°C，生根培养的周期为28 32天，优选30天。由此生根率最高可达95%，平均生根条数为3. 37条，诱导生成的根比较粗壮。在上述方案的基础上，步骤f中，将生根试管苗至于自然环境中6 10天，一般为一周，取出洗净，用50(Γ600倍托布津水溶液浸泡数秒，移栽到草炭土、珍珠岩和腐殖质的混合基质中，一般草炭土 珍珠岩腐殖质=2:1:1,起始6 10天(一般为一周)内采用喷雾保持苗的叶面湿润，相对湿度为95%左右，并适当遮阳，其后(约二周后)按干透湿透的原则浇水，逐渐加强光照至全光照。本发明的有益效果是
本发明采用快繁技术极大加快了厚叶岩白菜的繁殖速度，年繁殖系数由自然状态下的I :2，提高到I :600000，成本由原来的每株8 10元，降低至每株2 3元。且不受季节限 制，环境易控，适合全国各地，解决了厚叶岩白菜繁殖慢、种苗参差不齐等问题。直接器官发生的方式由于不经过愈伤组织阶段，可以减少变异植株的产生，为快繁中保持种质资源的优良特性提供保障，生产得到的厚叶岩白菜种苗品质高，一致性好，具有广阔的市场前景。
图I为本发明初代培养外植体；
图2为本发明外植体萌发 图3为本发明诱导增殖 图4为本发明壮苗培养 图5为本发明生根培养 图6为本发明炼苗移栽图。
具体实施例方式本实施例中的基本培养基中所用药剂和各类激素均由sigma公司购得。—种厚叶岩白菜离体培养和快速繁殖的方法，厚叶岩白菜外植体经初代培养、增殖培养、壮苗培养和生根培养获得再生植株，进行移栽，包括下述步骤
第一岩白菜属植物主要含有三大类物质酚类、黄酮类以及多糖类等，极容易引起离体培养中植物材料的褐变，因此消毒处理中外植体不能修切过小。厚叶岩白菜根状茎粗大，长期深埋于土壤中，感染各种外源微生物机会多，因此消毒获得完全无菌的材料非常困难。经过反复实验，本发明得到以下最佳外植体处理方式于天气晴朗的中午，选择生长健壮，无病虫害厚叶岩白菜带顶芽的根状茎做为外植体，切取成为长度O. 5^1cm,直径为O. 3^0. 6cm的圆柱体，并使顶芽生长点位于圆柱体的中央，保留两片叶柄基部保护生长点，以减弱消毒处理时消毒液对生长点分生细胞的伤害。先用72%浓度的酒精消毒3(T60s，再用无菌水冲洗3 4次，然后用加有2 4滴吐温80的O. Γθ. 2%的升汞液(含O. 5^5. Omg · IZ1VC)浸泡15 30分钟,用含O. 5^5. Omg · L^1VC无菌水冲洗至无残留无异味。第二 有报道岩白菜属植物中存在众多内生菌，一般情况下，茎尖分生组织细胞内内生菌分布较少，所以本发明在步骤a中消毒所得到的无菌外植体需要在无菌环境的显微镜下继续修切为O. 2^0. 5_大小的芽点，得到如图I所示的本发明初代培养的外植体。再接种到初代培养基 MS+6-BA0. 15 O. 25 mg · L、NAA0· 15 O. 25mg · Γ1+ VC O. 5 5. Omg · Γ1+蔗糖25 35g · L—1+琼脂4 8g · L'培养基pH调为5. 8左右，一个试管接种一个，避免交叉感染，于光周期为12h/d，光照强度为20001x，培养温度为25°C的无菌室内培养25天左右开始萌发。图2为本发明外植体萌发图。无菌操作室在使用前30分钟，打开紫外灯和超净工作台，紫外灯在关闭10分钟后，才可进行接种操作；接种用具在121°C条件下高压灭菌35分钟，培养基在121°C条件下高压灭菌18分钟。第三将初代培养获得的健壮一致的无菌苗转到增殖培养基MS+BAO. 5^3. 5mg · Γ1+NAAO· 2 I. 5mg -L^+VCO. 5 5. Omg .L—1+ 蔗糖 25 35g .L—1+ 琼脂 4 8g · Λ 结果表明，厚叶岩白菜增殖需要浓度较高的细胞分裂素，当BA为Img · Γ1时，增殖速度非常 缓慢，当BA浓度为3 mg *L_1时,对厚叶岩白菜丛生芽的增殖效果最好,而当浓度达到3. 5mg *L_1时,厚叶岩白菜又非常容易出现玻璃化的畸形现象，添加生长素对厚叶岩白菜的增殖有促进作用。本发明中所述的增殖培养基最佳的激素组合及浓度为MS+BA3mg · L^+NAAlmg · \l+W2. 5
mg · L—1+鹿糖30g · L—1+琼脂6g · L—1 ;在增殖培养过程中，培养条件为无菌室内光周期优选12h/d，光照强度优选20001x，培养温度优选25°C，培养周期优选30天，厚叶岩白菜试管苗的月增殖系数平均为3. 65。图3为本发明诱导增殖图，诱导出的丛生芽发育正常，叶色浓绿，长势旺盛，可以做为厚叶岩白菜扩繁增殖的培养基。第四在增殖培养基上，厚叶岩白菜试管苗生长高度参差不齐，将丛生芽分切后，转移至壮苗培养基 MS+6-BA0. 15 O. 25mg · L_1+IBA0. 15 O. 25mg · L_1+VC0. 5 5. Omg · Γ1+ 蔗糖25 35g · I/1+琼脂4 8g · L'本发明优选的壮苗培养基为MS+6_BA0. 2mg · Γ'+ΙΒΑΟ. 2m
蔗糖3(^171+琼脂6 g-Γ1 ;在壮苗培养过程中，培养条件为无菌室内光周期优选12h/d，光照强度优选20001x，培养温度优选25°C，培养周期优选20天，试管苗长至I. 5cm高，比较整齐可以用来诱导生根，图4为本发明壮苗培养图。第五元素减半的1/2MS比MS更有利于生根，本发明中生根培养基为1/2MS+NAA1
5 4. 5mg · L_1+IBA0. 5 2. 5mg · L-1+VC O. 5 5. Omg · L-1 + 蔗糖 15 25g · L-1+ 琼脂 4 8g · L'当NAA浓度为I mg · Γ1时，生根率比较低；当上调至4. 5 mg · Γ1时，生根率虽然可以达到100%，但是在试管苗的基部容易出现愈伤化组织，不利于后期的移栽；蔗糖含量为20 g-L-1时，也能够提高生根率及平均生根数。厚叶岩白菜生根培养时最佳的激素和矿质元素及碳源组合浓度值为1/2MS+NAA 2mg · L_1+IBA Img · I^+VC 2· 5 mg · Γ1+ 蔗糖 20 g · Γ1+ 琼脂6 g · L-1 ;培养条件为无菌室内光周期优选12h/d，光照强度优选20001x，培养温度优选250C，生根培养的周期优选30天。由此生根率最高可达95%，平均生根条数为3. 37条，诱导生成的根比较粗壮，图5为本发明生根培养图。第六步将厚叶岩白菜生根试管苗置于自然环境中6 10天，一般为一周，取出洗净，用50(Γ600倍托布津水溶液浸泡数秒，移栽到草炭土、珍珠岩和腐殖质的混合基质中，本发明中草炭土 珍珠岩腐殖质=2:1:1,起始6 10天(一般为一周)内采用喷雾保持苗的叶面湿润，相对湿度为95%左右，并适当遮阳，其后(约二周后)按干透湿透的原则浇水，逐渐加强光照至全光照。厚叶岩白菜成活率可以达到90%。图6为本发明炼苗移栽图。采用本发明所提供的方法，对加快厚叶岩白菜的繁殖速度，是一种很有效的途径，一旦得到无菌苗后，可以利用无菌苗诱导出不定芽，不定芽生根和移栽成活后，即再生为完整植株，形成了一个良好的生产体系。年繁殖系数由自然状态下的1:2，提高到1:600000，成本由原来的每株8 10元，降低至每株2 3元。且不受季节限制，环境易控，适合全国各地，解决了厚叶岩白菜繁殖慢、种苗参差不齐等问题。直接器官发生的方式由于不经过愈伤组织阶段，可以减少变异植株的产生，为快繁中保持种质资源的优良特性提供保障，生产得到的厚叶岩白菜种苗品质高，一致性好，具有广阔的市场前景。·
权利要求
1.一种厚叶岩白菜离体培养和快速繁殖的方法，取厚叶岩白菜外植体在无菌环境下，经初代培养、增殖培养、壮苗培养和生根培养获得再生植株，进行栽种，其特征在于按下列步骤进行 所述的初代培养选择并清洗、消毒处理带顶芽的新鲜根状茎获得起始的无菌外植体，在无菌环境的显微镜下修切为O. 2^0. 5_大小的芽点，接种到初代培养基上，进行初代培养，获得初代培养的无菌苗，所述的初代培养基为MS+6-BA0. 15 O. 25mg · I/1+NAAO· 15 O. 25mg · L-1+VC0. 5 5. Omg · L-1+ 蔗糖 25 35g · L-1+琼脂 4 8g · L 1 ; 所述的增殖培养是将初代培养的无菌苗转入增殖培养基，诱导不定芽，该增殖培养基为MS+BA0. 5 3. 5mg · L ^NAAO. 2 I. 5mg · L ^VCO. 5 5. Omg .L1+ 鹿糖 25 35 g · L :+ 琼脂4^8 g .171,诱导出丛生芽； 所述的壮苗培养将诱导出的丛生芽分切后，转移至壮苗培养基，进行壮苗培养，获得高度为I. 5cm以上的试管苗； 所述的生根培养将经壮苗培养生长到I. 5cm以上的试管苗分切后，转移至生根培养基中，获得生根试管苗，该生根培养基为1/2MS+NAA1. 5 4. 5mg Γ'+ΙΒΑΟ. 5 2· 5 mg Γ1+ VCO. 5 5· Omg · L-1 + 蔗糖 15 25g · L-1+ 琼脂 4 8g · L-1 ； 最后，对所得的生根试管苗进行清洗，移至珍珠岩、草炭土、腐殖质的混合基质中进行栽种。
2.根据权利要求I所述的厚叶岩白菜离体培养和快速繁殖的方法，其特征在于，获得无菌外植体的方法是取厚叶岩白菜包含顶芽生长点的根状茎，切取成为长度O. 5 lcm，直径为O. 3^0. 6cm的圆柱体，并使顶芽生长点位于圆柱体的中央，保留两片叶柄基部保护生长点，用洗洁精擦洗表面流水冲洗20分钟，再进行消毒处理，并将消毒处理后的茎尖在无菌环境的显微镜下继续修切为O. 2^0. 5mm大小的芽点。
3.根据权利要求I或2所述的厚叶岩白菜离体培养和快速繁殖的方法，其特征在于，对外植体清洗、消毒处理方法是先用72%浓度的酒精消毒3(T60s，再用无菌水冲洗3 4次，然后用加有2 4滴吐温80的O. I O. 2%的升汞液(含O. 5 5. Omg · L、C)浸泡15 30分钟，用含O. 5^5. O mg · PVC无菌水冲洗至无残留，得到无菌外植体。
4.根据权利要求I所述的厚叶岩白菜离体培养和快速繁殖的方法，其特征在于，所述的最佳增殖培养基为MS+BA3mg · L_1+NAAlmg · L_1+VC2. 5mg · L-1 + 鹿糖 30g · L-1+ 琼脂 6 g · L-1,丛生芽增殖率为1:3 5。
5.根根据权利要求I所述的厚叶岩白菜离体培养和快速繁殖的方法，其特征在于，所述的壮苗培养基为MS+6-BA0. 15 O. 25mg L^+IBAO. 15 O. 25mg L^+VCO. 5 5. Omg .171+ 蔗糖 25 35 g .171+琼脂4 8 g · L—1，试管苗的苗高达到2 3厘米，4 7片叶。
6.根据权利要求I所述的厚叶岩白菜离体培养和快速繁殖的方法，其特征在于，最佳生根培养基为l/2MS+NAA2mg · L ^IBAlmg .L1+ VC2. 5 mg · L :+ 鹿糖 20 g · L :+ 琼脂 6 g · L S 生根率为85、5%，平均生根数3. 37条，根长2 3厘米。
7.根据权利要求I所述的的方法，其特征在于所述的初代培养、增殖培养、壮苗培养和生根培养的培养条件均为无菌环境，光周期为l(Tl5h/d，光照强度150(Γ25001χ，培养温度为室温。
8.根据权利要求7所述的厚叶岩白菜离体培养和快速繁殖的方法，其特征在于，所述初代培养的周期为22 28天，增殖培养的周期为28 32天，壮苗培养的周期为18 22天，生根培养的周期为28 32天。
9.根据权利要求I所述的厚叶岩白菜离体培养和快速繁殖的方法，其特征在于，将生根试管苗置于自然环境中6 10天，取出洗净根部，用50(Γ600倍托布津水溶液浸泡数秒，移栽到草炭土、珍珠岩和腐殖质的混合基质中，起始6 10天内保持苗的叶面湿润并遮阳，其 后按干透湿透的原则浇水，逐渐加强光照至全光照，进行栽种。
10.根据权利要求I所述厚叶岩白菜离体培养和快速繁殖的方法，其特征在于，生根试管苗移栽入混合基质的营养成分为草炭土 珍珠岩腐殖质=2:1:1。
全文摘要
本发明涉及厚叶岩白菜离体培养和快速繁殖的方法，选择带顶芽的新鲜根状茎做为无菌外植体，接种到初代培养基中，进行初代培养；将初代培养的无菌苗转入增殖培养基，增殖培养基为MS+BA0.5~3.5mg·L-1+NAA0.2~1.5mg·L-1+VC0.5~5.0mg·L-1+蔗糖25~35g·L-1+琼脂4~8g·L-1，诱导不定芽；将诱导出的丛生芽分切后，转移至壮苗培养基，进行壮苗培养；试管苗分切后，转移至生根培养基中，生根培养基1/2MS+NAA1.5~4.5mg·L-1+IBA0.5~2.5mg·L-1+VC0.5~5.0mg·L-1+蔗糖15~25g·L-1+琼脂4~8g·L-1；生根试管苗清洗移至基质中栽种。本发明年繁殖系数提高到1600000，成本降至每株2~3元，且不受季节限制，环境易控，减少变异植株的产生，种苗品质高，一致性好。
文档编号A01H4/00GK102948367SQ20121006961
公开日2013年3月6日 申请日期2012年3月16日 优先权日2012年3月16日
发明者吕秀立, 王健, 沈烈英, 崔心红, 张春英, 孙伟墨 申请人:上海市园林科学研究所