专利名称：一种检测石榴枯萎病菌致病蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测石榴枯萎病菌致病蛋白的方法，具体涉及一种在芋头叶片上检测石榴枯萎病菌致病分泌蛋白致病性的方法，属于植物保护领域。
背景技术：
石榴枯萎病为最近几年在中国云南和四川省石榴种植发生的新病害，已经造成大量的经济损失，这种病害为甘薯长_壳菌(Ceratocystis fimbriata)引起(Huang等， 2003)。2004年在云南省蒙自县石榴枯萎病造成的经济损失达1500万元以上，其中部分重病区病株率高达29. 2%，特别是挂果石榴树的大面积死亡，造成石榴产业的毁灭性损失(邓吉等，2005)。在石榴枯萎病菌致病性的研究中，通常用石榴枯萎病菌的孢子在石榴植株茎干上进行伤口接种并观察产生症状的方法来确定其致病性，接种后产生的病斑大小为鉴定不同石榴枯萎病菌菌株致病力差异检测的主要手段。已有报道表明来自中国石榴枯萎病菌和芋头黑腐病菌的C. fimbriata对中国石榴寄主植物和芋头寄主植物具有一样的强致病性，这表明它们之间可以互相侵染对方的寄主植物，没有表现出寄主专化性(Huang等， 2008;余磊，2010)。并且它们在分别接种芋头植株后，生理生化水平上的反应也具有一致性(余磊等，2011; 2011)。近年来的研究表明，病原菌产生的蛋白与寄主抗性基因蛋白产物的分子互作是病原菌与寄主互作机制的核心。与孢子接种的目的类似，这些蛋白的功能也要通过在寄主植物上接种后观察致病的症状来进行检测。目前实验中石榴枯萎病菌致病分泌蛋白主要来源于其菌丝体产生的蛋白，且对石榴枯萎病菌进行液体培养是获得致病分泌蛋白的主要方法。还未见到专门用于石榴枯萎病菌致病分泌蛋白致病性检测方法的文献和专利报道。因石榴为木本植物，对其茎干进行伤口接种存在致病性反应周期较长、症状不易观察等局限。这导致了无法像石榴枯萎病孢子接种那样通过测量病斑长度，来对石榴枯萎病菌产生的不同致病性分泌蛋白的致病力差异进行定量分析 ，限制了对石榴枯萎病菌致病分泌蛋白致病机制的研究。
经文献检索，未见与本发明相同的公开报道。
参考文献
Huang Q, Zhu Y Y, Chen H R, Wang Y Y, Liu YL, Lu W J, Ruan X Y. 2003.First Report of Pomegranate Wilt Caused by Ceratocystis fimbriata in Yunnan, China[J]. Plant Disease, 87，1150.
Huang Q，Wang Y Y，Zhao Y Y，Jiao Y X，Li X F，Chen H R，and Zhu Y Y. 2008. First report of taro black rot caused by Ceratocystis fimbriata in China[J]. Plant Pathology, 57: 780.
邓吉，陆进，李健强，潘俊，朱春雨，吴新平.2005.石榴枯萎病病害分级标准研究[J].中国农业科学，38(12): 2440-2445.
余磊.2010.云南农业大学.三种寄主的甘薯长喙壳病菌研究[博士论文].
余磊，高玲玲，郭建伟，陈小龙，李秀芬，刘芬，黄琼，陈海如.2011.甘薯长喙壳侵染对甘薯块根抗氧化酶活性影响.中国生态农业学报.19(1): 141-145.
余磊，陈小龙，郭建伟，高玲玲，李秀芬，刘芬，黄琼，陈海如.2011.不同寄主甘薯长_壳菌侵染对芋头抗氧化酶活性影响.华中农业大学学报.30(1):61-65.
发明内容
本发明的目的在于提供一种在芋头叶片上检测石榴枯萎病菌致病蛋白的方法。
本发明的目的是这样实现的
(I)芋头生长至第3片时，选择完全展开的健康叶片进行接种；
(2)选择在接种芋头叶片主脉与边缘的近中间部分，用致伤设备分别等距形成直径2 mm的压伤斑3个，在致伤处接种致病分泌蛋白，该致病分泌蛋白是石榴枯萎病菌在配方为蔗糖20g/L，酵母提取物5g/L，pH 6. 3的蔗糖液体培养基中培养72小时后获得，蛋白的接种浓度为50 μ g/ml，接种体积为5 μ I ;
(3)接种后96小时在芋头叶片上形成的病斑为椭圆形或圆形，测量向叶尖和叶基方向延伸的最长值作为病斑的长度值；
(4)将石榴枯萎病菌致病分泌蛋白致病性大小按病斑长度值划分的标准进行致病性弱、中等和强的分类；其分类标准为病斑长度为3. 5mm至4mm之间为弱致病性；病斑长度在4.1mm至5mm之间为中等致病性；病斑长度大于5.1mm为强致病性。
本发明优点在于解决了石榴枯萎病菌分泌蛋白致病性检测的问题。能够在芋头叶片上形成规则的接种点而对其组织没有明显的伤害，接种石榴枯萎病菌的致病分泌蛋白后形成的病斑与孢子接种的症状一致，沿叶脉方向延伸的病斑长度即作为不同致病分泌蛋白致病力大小比较的依据。具体实施方案
实施例一
芋头生长至第3片叶完全展开时接种。选择在接种芋头叶片主脉与边缘的近中间部分，用致伤设备分别在叶片主脉两边近叶缘4cm处和叶尖3cm处形成直径2mm的压伤斑 3个，将培养后的石榴枯萎病菌转入到蔗糖液体培养基中，进行培养后得到弱致病力石榴枯萎病菌分泌蛋白，分别在芋头植株的叶片致伤处接种，用灭菌去离子水接种作为对照。蛋白的接种浓度为50 μ g/ml，接种体积为5 μ I。接种后96小时在芋头叶片上形成的病斑为椭圆形， 测量向叶尖和叶基方向延伸的最长值作为病斑的长度值。按照病斑长度为2. 5_至 4mm之间为弱致病性；病斑长度在4.1mm至5mm之间为中等致病性；病斑长度大于5.1mm为强致病性的分类标准，对该分泌蛋白的致病性进行检测，结果见表I。
实施例二
芋头生长至第3片叶完全展开时接种。选择在接种芋头叶片主脉与边缘的近中间部分，用致伤设备分别在叶片主脉两边近叶缘4cm处和叶尖3cm处形成直径2mm的压伤斑 3个，将培养后的石榴枯萎病菌转入到蔗糖液体培养基中，进行培养后得到中等致病力石榴枯萎病菌分泌蛋白，分别在芋头植株的叶片致伤处接种，用灭菌去离子水接种作为对照。蛋白的接种浓度为50 μ g/ml，接种体积为5 μ I。接种后96小时在芋头叶片上形成的病斑为椭圆形，测量向叶尖和叶基方向延伸的最长值作为病斑的长度值。按照病斑长度为2. 5mm至4mm之间为弱致病性；病斑长度在4.1mm至5mm之间为中等致病性；病斑长度大于5.1mm 为强致病性的分类标准，对该分泌蛋白的致病性进行检测，结果见表I。
实施例三
芋头生长至第3片叶完全展开时接种。选择在接种芋头叶片主脉与边缘的近中间部分，用致伤设备分别在叶片主脉两边近叶缘4cm处和叶尖3cm处形成直径2mm的压伤斑 3个，将培养后的石榴枯萎病菌转入到蔗糖液体培养基中，进行培养后得到强致病力石榴枯萎病菌分泌蛋白，分别在芋头植株的叶片致伤处接种，用灭菌去离子水接种作为对照。蛋白的接种浓度为50 μ g/ml，接种体积为5 μ I。接种后96小时在芋头叶片上形成的病斑为椭圆形，测量向叶尖和叶基方向延伸的最长值作为病斑的长度值。按照病斑长度为2. 5_至 4mm之间为弱致病性；病斑长度在4.1mm至5mm之间为中等致病性；病斑长度大于5.1mm为强致病性的分类标准，对该分泌蛋白的致病性进行检测，结果见表I。
表I石榴枯萎病菌致病分泌蛋白在芋头(香芋)接种后病斑的长度
权利要求
1.一种检测石榴枯萎病菌致病蛋白的方法，其特征在于该方法的具体步骤如下a.芋头生长至第3片时，选择完全展开的健康叶片进行接种；b.选择在接种芋头叶片主脉与边缘的近中间部分，用致伤设备分别形成直径2mm的压伤斑3个，在致伤处接种致病分泌蛋白，该致病分泌蛋白是石榴枯萎病菌在配方为蔗糖 20g/L，酵母提取物5g/L，pH 6. 3的蔗糖液体培养基中培养72小时后获得，蛋白的接种浓度为50 μ g/ml，接种体积为5 μ I ;c.接种后96小时在芋头叶片上形成的病斑为椭圆形或圆形，测量向叶尖和叶基方向延伸的最长值作为病斑的长度值；d.将石榴枯萎病菌致病分泌蛋白致病性大小按病斑长度值划分的标准进行致病性弱、 中等和强的分类；其分类标准为病斑长度为3. 5mm至4mm之间为弱致病性；病斑长度在4.1mm至5_之间为中等致病性；病斑长度大于5.1mm为强致病性。
全文摘要
一种检测石榴枯萎病菌致病蛋白的方法，属于植物保护领域。方法为芋头生长至第3片时，选择完全展开的健康叶片接种。在接种芋头叶片的边缘近中间部分，致伤直径2 mm的压伤斑3个，将石榴枯萎病菌液体培养后得到的分泌蛋白在致伤处接种，蛋白的接种浓度为50μg·ml-1，接种体积为5μl。接种后96小时在芋头叶片上形成椭圆形或圆形的病斑，测量向叶尖和叶基方向延伸的最长值作为病斑的长度值，该值是比较不同蛋白致病力大小的依据。其分类标准为病斑长度为3.5mm至4mm为弱致病性；病斑长度在4.1mm至5mm为中等致病性；病斑长度大于5.1mm为强致病性。该方法解决了石榴枯萎病菌分泌蛋白致病性检测的问题，对于研究石榴枯萎病菌致病相关分泌蛋白的功能具有重要意义。
文档编号A01G7/06GK103026910SQ201210580190
公开日2013年4月10日 申请日期2012年12月27日 优先权日2012年12月27日
发明者余磊, 赵建荣, 徐胜光, 吴旭, 苏源, 刘佳妮, 陈泽斌 申请人:昆明学院