一种美味牛肝菌菌丝多糖的提取方法
【专利摘要】本发明涉及一种美味牛肝菌菌丝多糖的提取方法，该方法包括以下步骤：⑴制备马铃薯葡萄糖斜面培养基；⑵制备种子培养基；⑶制备发酵培养基；⑷将美味牛肝菌菌丝接种至马铃薯葡萄糖斜面培养基，经恒温培养得菌丝体；⑸菌丝体接种至种子培养基，经振荡培养得菌种种子液；⑹菌种种子液接种至发酵培养基，经振荡培养得发酵液；离心、洗涤、烘干、磨粉后，得到菌丝体干粉末；⑺菌丝体干粉末先超声提取再浸提得到多糖浸提液；⑻多糖浸提液与正丁醇-三氯乙酸溶液混合后离心后即得多糖提取液；⑼多糖提取液加乙醇静置，得沉淀物；⑽沉淀物离心、洗涤、干燥，即得美味牛肝菌多糖。本发明操作简单，成本低，多糖得率高。
【专利说明】一种美味牛肝菌菌丝多糖的提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及真菌多糖【技术领域】，尤其涉及一种美味牛肝菌菌丝多糖的提取方法。【背景技术】
[0002]真菌多糖是从真菌子实体、菌丝体及发酵液中分离出的活性物质，具有调节机体免疫力、抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、抗辐射、降血脂、血糖和胆固醇、健胃护肝等多种药理作用。真菌多糖的多种生物活性功能在临床上的广泛应用，使其已成为生命科学、生物学、医学和食品科学等领域的研究热点。
[0003]美味牛肝菌eWis)属于担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、牛肝菌科中的一种与高等植物共生的外生菌根真菌，是一种药、食兼用的珍稀食用菌。我国美味牛肝菌资源丰富，主要分布于河南、四川、云南、内蒙古、福建、陕西等地。研究表明，美味牛肝菌菌丝体中主要含有碳水化合物、粗蛋白、胞内多糖以及少量的脂类和纤维等成分，具有降低血脂，提高人体免疫力和明显的抗癌作用。由于其优良的食疗保健功效，已成为我国出口创汇的重要菌类产品。美味牛肝菌多糖是一种有效的生物免疫调节剂，具有调节血糖、血脂及胆固醇水平、改善免疫系统功能以及显著的抗肿瘤等作用。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单、成本低、多糖得率高的美味牛肝菌菌丝多糖的提取方法。
[0005]为解决上述问题，本发明所述的一种美味牛肝菌菌丝多糖的提取方法，包括以下步骤:
⑴制备马铃薯葡萄糖斜面培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4飞倍加水煮沸25~35min后用纱布过滤，得到滤液A，该滤液A补足至1.0L依次加入5~IOg葡萄糖和5~IOg琼脂，使其pH值为6.0-8.0,在90~l00°C温度下充分加热溶解后分装，在压强为
1.05Kg/cm2、温度为121 °C的条件下灭菌20min即得；
⑵制备种子培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4飞倍加水煮沸25~35min后用纱布过滤，得到滤液B，该滤液B补足至1.0L加入5~IOg葡萄糖，使其pH值为6.0-8.0，在9(T10(TC温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得；
⑶制备发酵培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4飞倍加水煮沸25~35min后用纱布过滤，得到滤液C，该滤液C补足至1.0L加入5~IOg葡萄糖，使其pH值为6.0-8.0，在9(T10(TC温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得；
⑷真菌的发酵培养:接一环美味牛肝菌菌丝至所述马铃薯葡萄糖斜面培养基上，于28°C恒温培养4~10天后，置于4°C冰箱中，得到活化培养后的菌丝体；
(5)接一环所述活化培养后的菌丝体至装有IOmL所述种子培养基的试管中，并置于恒温振荡器上，在28°C条件下以100?200 r/min的速率进行振荡培养4?10天，制得pH值为 5. (T7. 0的菌种种子液；
(6)将所述菌种种子液按5?20%的接种量接种至含有所述发酵培养基的摇瓶中，并置于 恒温振荡器上，在28°C条件下以10(T200 r/min的速率进行振荡培养4?10天，即得发酵液； 所述发酵液在高速冷冻离心机中于5000r/min离心20min,得到菌丝体；所述菌丝体用蒸懼 水洗涤后在真空干燥箱于60°C下烘干至恒重后磨成粉，得到菌丝体干粉末；所述发酵培养 基在所述摇瓶中的装瓶量为1(T30% ；
(7)在所述菌丝体干粉末中按1g:5 mL?20mL的料液比加入去离子水，在功率为 10(T300W的条件下超声提取10?20 min后，在温度为7(T90°C的条件下浸提次数2?4次，每 次llh，合并提取液，得到多糖浸提液；
⑶将所述多糖浸提液与正丁醇-三氯乙酸溶液按lmL ：lmL的比例，充分混合，在转速 150 r/min条件下，振荡15min,再静置45min,用高速冷冻离心机4000r/min离心20min,除 掉变性蛋白质，将水相再加入相当于其体积的正丁醇-三氯乙酸溶液，反复多次直到上清 液与有机相中间有清晰的分界面为止，视为蛋白质除尽，即得多糖提取液；
⑶在所述多糖提取液中按其体积的2?4倍加入质量浓度为95%的乙醇，在4°C下静置 24h，得到沉淀物A ；
(10)将所述沉淀物A经高速冷冻离心机以4000 r / min离心10 min后，得到沉淀物B,
该沉淀物B经无水乙醇多次洗涤后置于真空干燥箱内，经50°C真空干燥至恒重，即得美味 牛肝囷多糖。
[0006]所述步骤⑷中美味牛肝菌菌丝是指采集于陇南康县的美味牛肝菌 edulis KX920NG按常规方法经组织分离获得的美味牛肝菌菌丝；所述美味牛肝菌 edulis KX920NG在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO :M 2012113 (保藏 单位地址：中国.武汉.武汉大学；保藏日期：2012年4月13日），其分子生物学鉴定后的 核酸序列提交至GenBank的登录号为JQ086386。
[0007]所述步骤(8)中正丁醇-三氯乙酸溶液是指正丁醇与三氯乙酸按5mL :lmL混合而成 的混合液。
[0008]本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明采用超声波辅助热水浸提法取代传统的水提醇析法，与原来工艺相比，降低 了提取液黏度、缩短了提取时间，多糖得率显著提高。同时，超声波辅助提取能加速真菌胞 内多糖的释放、扩散及溶解，具有提取效率闻、时间短、多糖结构稳定等优点。
[0009]2、本发明整个过程中无需试剂和化学反应，不但设备简单，可操作性强，而且成本 低，易于实现生产工艺的连续化和工业化。
[0010]3、本发明发酵菌丝体培养周期短，生长快，利于大规模工业生产，从其发酵液或固 体培养物中得到菌丝体提取多糖，对进一步深入开发美味牛肝菌资源具有重要意义。
【具体实施方式】
[0011]实施例1 一种美味牛肝菌菌丝多糖的提取方法，包括以下步骤：
⑴制备马铃薯葡萄糖斜面培养基：将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4倍加水煮沸 25min后用纱布过滤，得到滤液A，该滤液A补足至1. 0L依次加入5g葡萄糖和5g琼脂，使其pH值为6.0-8.0，在90°C温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得。
[0012]⑵制备种子培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4倍加水煮沸25min后用纱布过滤，得到滤液B，该滤液B补足至1.0L加入5g葡萄糖，使其pH值为6.0-8.0,在90°C温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得。
[0013]⑶制备发酵培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4倍加水煮沸25min后用纱布过滤，得到滤液C，该滤液C补足至1.0L加入5g葡萄糖，使其pH值为6.0-8.0,在90°C温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得。
[0014]⑷真菌的发酵培养:接一环美味牛肝菌菌丝至马铃薯葡萄糖斜面培养基上，于28°C恒温培养4天后，置于4°C冰箱中，得到活化培养后的菌丝体。
[0015]其中:美味牛肝菌菌丝是指采集于陇南康县的美味牛肝菌沒edulisKX920NG按常规方法经组织分离获得的美味牛肝菌菌丝；美味牛肝菌Boletus edulisKX920NG在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO:M 2012113 (保藏单位地址:中国.武汉.武汉大学；保藏日期:2012年4月13日)，其分子生物学鉴定后的核酸序列提交至GenBank的登录号为JQ086386。
[0016](5)接一环活化培养后的菌丝体至装有IOmL种子培养基的试管中，并置于恒温振荡器上，在28°C条件下以100 r/min的速率进行振荡培养4天，制得pH值为5.0-7.0的菌种种子液。
[0017](6)将菌种种子液按5%的接种量接种至含有发酵培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在28°C条件下以100 r/mi`n的速率进行振荡培养4天，即得发酵液；发酵液在高速冷冻离心机中于5000r/min离心20min,得到菌丝体；菌丝体用蒸懼水洗漆后在真空干燥箱于60°C下烘干至恒重后磨成粉，得到菌丝体干粉末。
[0018]其中:发酵培养基在摇瓶中的装瓶量为10%。
[0019](7)在菌丝体干粉末中按I g:5 mL的料液比加入去离子水，在功率为100W的条件下超声提取20 min后，在温度为70°C的条件下浸提次数2次，每次lh，合并提取液，得到多糖浸提液。
[0020](8)将多糖浸提液与正丁醇-三氯乙酸溶液按ImL =ImL的比例，充分混合，在转速150 r/min条件下,振荡15min,再静置45min,用高速冷冻离心机4000r/min离心20min,除掉变性蛋白质，将水相再加入相当于其体积的正丁醇-三氯乙酸溶液，反复多次直到上清液与有机相中间有清晰的分界面为止，视为蛋白质除尽，即得多糖提取液。
[0021]其中:正丁醇-三氯乙酸溶液是指正丁醇与三氯乙酸按5mL:lmL混合而成的混合液。
[0022](9)在多糖提取液中按其体积的2倍加入质量浓度为95%的乙醇，在4°C下静置24h，得到沉淀物A。
[0023](K))将沉淀物A经高速冷冻离心机以4000 r / min离心10 min后,得到沉淀物B,
该沉淀物B经无水乙醇多次洗涤后置于真空干燥箱内，经50°C真空干燥至恒重，即得美味牛肝菌多糖。[0024]采用苯酚-硫酸法测定美味牛肝菌多糖含量，并按下式计算:
粗多糖含量(mg/g菌丝干重)=粗多糖总质量(mg)/菌丝体干粉末质量(g)。
[0025]实施例2 —种美味牛肝菌菌丝多糖的提取方法，包括以下步骤:
⑴制备马铃薯葡萄糖斜面培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的6倍加水煮沸35min后用纱布过滤，得到滤液A，该滤液A补足至1.0L依次加入IOg葡萄糖和IOg琼脂，使其PH值为6.0-8.0，在100°C温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得。
[0026]⑵制备种子培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的6倍加水煮沸35min后用纱布过滤，得到滤液B，该滤液B补足至1.0L加入IOg葡萄糖，使其pH值为6.0-8.0，在100°C温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得。
[0027]⑶制备发酵培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的6倍加水煮沸35min后用纱布过滤，得到滤液C，该滤液C补足至1.0L加入IOg葡萄糖，使其pH值为6.0-8.0，在100°C温度下充分加热溶解后分 装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得。
[0028]⑷真菌的发酵培养:接一环美味牛肝菌菌丝至马铃薯葡萄糖斜面培养基上，于28°C恒温培养10天后，置于4°C冰箱中，得到活化培养后的菌丝体。
[0029]其中:美味牛肝菌菌丝同实施例1。
[0030](5)接一环活化培养后的菌丝体至装有IOmL种子培养基的试管中，并置于恒温振荡器上，在28°C条件下以200 r/min的速率进行振荡培养10天，制得pH值为5.0-7.0的菌种种子液。
[0031](6)将菌种种子液按20%的接种量接种至含有发酵培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在28°C条件下以200 r/min的速率进行振荡培养10天，即得发酵液；发酵液在高速冷冻离心机中于5000r/min离心20min,得到菌丝体；菌丝体用蒸懼水洗漆后在真空干燥箱于60°C下烘干至恒重后磨成粉，得到菌丝体干粉末。
[0032]其中:发酵培养基在摇瓶中的装瓶量为30%。
[0033](7)在菌丝体干粉末中按I g:20mL的料液比加入去离子水，在功率为300W的条件下超声提取10 min后，在温度为90°C的条件下浸提次数4次，每次3h，合并提取液，得到多糖浸提液。
[0034](8)将多糖浸提液与正丁醇-三氯乙酸溶液按ImL =ImL的比例，充分混合，在转速150 r/min条件下,振荡15min,再静置45min,用高速冷冻离心机4000r/min离心20min,除掉变性蛋白质，将水相再加入相当于其体积的正丁醇-三氯乙酸溶液，反复多次直到上清液与有机相中间有清晰的分界面为止，视为蛋白质除尽，即得多糖提取液。
[0035]其中:正丁醇-三氯乙酸溶液同实施例1。
[0036](9)在多糖提取液中按其体积的4倍加入质量浓度为95%的乙醇，在4°C下静置24h，得到沉淀物A。
[0037](K))将沉淀物A经高速冷冻离心机以4000 r / min离心10 min后,得到沉淀物B,
该沉淀物B经无水乙醇多次洗涤后置于真空干燥箱内，经50°C真空干燥至恒重，即得美味牛肝菌多糖。[0038]采用苯酚-硫酸法测定美味牛肝菌多糖含量，并按实施例1中的公式计算。
[0039]实施例3 —种美味牛肝菌菌丝多糖的提取方法，包括以下步骤:
⑴制备马铃薯葡萄糖斜面培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的5倍加水煮沸30min后用纱布过滤，得到滤液A，该滤液A补足至1.0L依次加入8g葡萄糖和8g琼脂，使其pH值为6.0-8.0，在95°C温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得。
[0040]⑵制备种子培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的5倍加水煮沸30min后用纱布过滤，得到滤液B，该滤液B补足至1.0L加入8g葡萄糖，使其pH值为6.0-8.0,在95°C温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得。
[0041]⑶制备发酵培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的5倍加水煮沸30min后用纱布过滤，得到滤液C，该滤液C补足至1.0L加入8g葡萄糖，使其pH值为6.0-8.0,在95°C温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌20min即得。
[0042]⑷真菌的发酵培养:接一环美味牛肝菌菌丝至马铃薯葡萄糖斜面培养基上，于28°C恒温培养7天后，置于4°C冰箱中，得到活化培养后的菌丝体。
[0043]其中:美味牛肝菌菌丝同实施例1。
[0044](5)接一环活化培养后的菌丝体至装有IOmL种子培养基的试管中，并置于恒温振荡器上，在28°C条件下以150 r/min的速率进行振荡培养7天，制得pH值为5.0-7.0的菌种种子液。
[0045](6)将菌种种子液按12%的接种量接种至含有发酵培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在28°C条件下以150 r/min的速率进行振荡培养7天，即得发酵液；发酵液在高速冷冻离心机中于5000r/min离心20min,得到菌丝体；菌丝体用蒸懼水洗漆后在真空干燥箱于60°C下烘干至恒重后磨成粉，得到菌丝体干粉末。
[0046]其中:发酵培养基在摇瓶中的装瓶量为20%。
[0047](7)在菌丝体干粉末中按I g:12mL的料液比加入去离子水，在功率为200W的条件下超声提取15 min后，在温度为80°C的条件下浸提次数3次，每次2h，合并提取液，得到多糖浸提液。
[0048](8)将多糖浸提液与正丁醇-三氯乙酸溶液按ImL =ImL的比例，充分混合，在转速150 r/min条件下,振荡15min,再静置45min,用高速冷冻离心机4000r/min离心20min,除掉变性蛋白质，将水相再加入相当于其体积的正丁醇-三氯乙酸溶液，反复多次直到上清液与有机相中间有清晰的分界面为止，视为蛋白质除尽，即得多糖提取液。
[0049]其中:正丁醇-三氯乙酸溶液同实施例1。
[0050](9)在多糖提取液中按其体积的3倍加入质量浓度为95%的乙醇，在4°C下静置24h，得到沉淀物A。
[0051](10)将沉淀物A经高速冷冻离心机以4000 r / min离心10 min后,得到沉淀物B,
该沉淀物B经无水乙醇多次洗涤后置于真空干燥箱内，经50°C真空干燥至恒重，即得美味牛肝囷多糖。
[0052]采用苯酚-硫酸法测定美味牛肝菌多糖含量，并按实施例1中的公式计算。
【权利要求】
1.一种美味牛肝菌菌丝多糖的提取方法，包括以下步骤: ⑴制备马铃薯葡萄糖斜面培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4飞倍加水煮沸25~35min后用纱布过滤，得到滤液A，该滤液A补足至1.0L依次加入5~IOg葡萄糖和5~IOg琼脂，使其pH值为6.0-8.0,在9(Tl00°C温度下充分加热溶解后分装，在压强为.1.05Kg/cm2、温度为121 °C的条件下灭菌20min即得； ⑵制备种子培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4飞倍加水煮沸25~35min后用纱布过滤，得到滤液B，该滤液B补足至1.0L加入5~IOg葡萄糖，使其pH值为6.0-8.0，在9(T10(TC温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌.20min即得； ⑶制备发酵培养基:将马铃薯洗净去皮切碎，按其质量的4飞倍加水煮沸25~35min后用纱布过滤，得到滤液C，该滤液C补足至1.0L加入5~IOg葡萄糖，使其pH值为6.0-8.0，在9(T10(TC温度下充分加热溶解后分装，在压强为1.05Kg/cm2、温度为121°C的条件下灭菌.20min即得； ⑷真菌的发酵培养:接一环美味牛肝菌菌丝至所述马铃薯葡萄糖斜面培养基上，于.28°C恒温培养4~10天后，置于4°C冰箱中，得到活化培养后的菌丝体； (5)接一环所述活化培养后的菌丝体至装有IOmL所述种子培养基的试管中，并置于恒温振荡器上，在28°C条件下以10(T200 r/min的速率进行振荡培养4~10天，制得pH值为.5.0-7.0的菌种种子液 ； (6)将所述菌种种子液按5~20%的接种量接种至含有所述发酵培养基的摇瓶中，并置于恒温振荡器上，在28°C条件下以10(T200 r/min的速率进行振荡培养5~?Ο天，即得发酵液；所述发酵液在高速冷冻离心机中于5000r/min离心20min,得到菌丝体；所述菌丝体用蒸懼水洗涤后在真空干燥箱于60°C下烘干至恒重后磨成粉，得到菌丝体干粉末；所述发酵培养基在所述摇瓶中的装瓶量为10-30%; ⑴在所述菌丝体干粉末中按I g:5 mL~20mL的料液比加入去离子水，在功率为.10(T300W的条件下超声提取1(T20 min后，在温度为7(T90°C的条件下浸提次数2~4次，每次llh，合并提取液，得到多糖浸提液； ⑶将所述多糖浸提液与正丁醇-三氯乙酸溶液按ImL =ImL的比例，充分混合，在转速.150 r/min条件下,振荡15min,再静置45min,用高速冷冻离心机4000r/min离心20min,除掉变性蛋白质，将水相再加入相当于其体积的正丁醇-三氯乙酸溶液，反复多次直到上清液与有机相中间有清晰的分界面为止，视为蛋白质除尽，即得多糖提取液； ⑶在所述多糖提取液中按其体积的2~4倍加入质量浓度为95%的乙醇，在4°C下静置.24h，得到沉淀物A; (10)将所述沉淀物A经高速冷冻离心机以4000 r / min离心10 min后,得到沉淀物B,该沉淀物B经无水乙醇多次洗涤后置于真空干燥箱内，经50°C真空干燥至恒重，即得美味牛肝囷多糖。
2.如权利要求1所述的一种美味牛肝菌菌丝多糖的提取方法，其特征在于:所述步骤⑷中美味牛肝菌菌丝是指采集于陇南康县的美味牛肝菌沒edulis KX920NG按常规方法经组织分离获得的美味牛肝菌菌丝；所述美味牛肝菌沒edulis KX920NG在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO:M 2012113，其分子生物学鉴定后的核酸序列提交至GenBank的登录号为JQ086386。
3.如权利要求1所述的一种美味牛肝菌菌丝多糖的提取方法，其特征在于:所述步骤⑶中正丁醇-三氯乙 酸溶液是指正丁醇与三氯乙酸按5mL =ImL混合而成的混合液。
【文档编号】A01G1/04GK103554287SQ201310480673
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月15日 优先权日:2013年10月15日
【发明者】陈朋, 严晓娟, 梁宁, 胡先望 申请人:甘肃省商业科技研究所