一种抗奶牛热应激的饲料添加剂的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种抗奶牛热应激的饲料添加剂。酿酒酵母菌(Saccharomyces?cerevisiae,Sc)NAU‐ZH‐GY1可在制备抗奶牛热应激的饲料添加剂中的应用。本发明在高渗条件下通过连续补料方式发酵生产出富含甘油、酵母活菌，以及丰富的氨基酸、维生素等微生物代谢产物的抗奶牛热应激的饲料添加剂，能协同发挥甘油和酵母菌的双重功效，可显著提高热应激条件下奶牛的泌乳量、4%乳脂校正乳产量和乳脂率，提高血糖浓度，降低乳中体细胞数、非酯化脂肪酸和尿素氮的浓度，为奶牛补充能量，减缓体重的降低，增强抗氧化能力，降低HSP70mRNA水平，有效缓解了奶牛的热应激。
【专利说明】一种抗奶牛热应激的饲料添加剂
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种抗奶牛热应激的饲料添加剂，属于饲料添加剂应用领域。
技术背景
[0002]我国饲养的奶牛以源于北欧的荷斯坦奶牛为主，经过风土驯化和长期选育形成中国荷斯坦奶牛。荷兰气候温和，全年温度在2?17°C之间，这样的气候使得荷斯坦奶牛耐寒，但耐热性较差；再加上荷斯坦奶牛体型较大，单位体重的散热面积小，被毛和体组织保温性能好，汗腺机能不发达，皮肤蒸发散热量少。此外，奶牛采食量大，粗饲料经过瘤胃发酵，产生大量的代谢热，而且产奶量高，新陈代谢旺盛，增加了散热负担。因此中国荷斯坦奶牛是耐寒而不耐热的动物。而我国大部分地区，尤其是长江流域及以南地区夏季不仅气温高，而且湿度大，持续时间长，奶牛极易发生热应激，从而严重影响了荷斯坦奶牛高产性能的发挥。
[0003]奶牛的最佳产奶环境温度为5?25°C，即温度适中区。当气温高于26°C时，即表现热应激。处于热应激的奶牛排汗增加，体温升高，呼吸频率加快，体内代谢减慢，采食量下降，进而造成泌乳量和乳品质显著降低。热应激使机体物质代谢紊乱，内分泌改变，还会显著降低奶牛的免疫力和繁殖性能，给奶牛造成了极大的负面影响。另外，有研究表明热应激条件下的奶牛因能量摄入不足及维持需求增加，常会处于能量负平衡状态。产奶量越高的奶牛，受热应激的影响就会越大。每年夏季的高温天气都会给奶牛养殖业带来巨大的经济损失，我国南方地区尤其明显。
[0004]国外主要是通过调整日粮组成、选育耐热品种、改善环境及管理来防控奶牛热应激综合症。但环境的控制和品种选育需要高额投入，费力耗时；使用高营养性、高品质的奶牛饲料会增加饲养成本，这在国内奶牛养殖场，特别是小型养殖场很难达到。而抗热应激添加剂可直接添加到动物饲料和饮水中，操作简便，效果突出，成为现在国内外的研究热点。目前用于奶牛养殖业的抗热应激添加剂主要包括酵母培养物、铬制剂、复合酶制剂、矿物质缓冲盐类、β_胡萝卜素、瘤胃素、脂肪酸钙等一些化学合成类物质，都有一定效果，但某些化学药物尤其是瘤胃素等长期使用会对奶牛产生副作用，且易残留，给人类健康带来潜在的危害。而酵母培养物是酵母菌在特定的培养基上经过充分发酵后形成的含酵母菌、胞外代谢产物及其残留培养基的微生态制品，具有安全、无污染、无残留，来源广泛、成本低廉等特点，在畜牧业中具有良好的应用前景。
[0005]目前养殖业中所应用的甘油主要来源于生物柴油过程的副产品或工业合成，在加工过程中会引入一些重金属或甲醇等有害物质，对奶牛食欲产生不良影响或对机体产生有害刺激。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种简单、低成本生产的奶牛抗热应激的饲料添加剂。[0007]本发明的目的可通过如下技术方案实现:
[0008]保藏号为CGMCC N0.4551 的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae, Sc)NAU - ZH - GYl在制备抗奶牛热应激的饲料添加剂中的应用。
[0009]—种抗奶牛热应激的饲料添加剂的生产方法，包括:
[0010]I)菌种:
[0011]保藏号为CGMCC N0.4551 的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae, Sc)NAU - ZH - GYl，为农业部允许使用的饲料级益生菌菌种；
[0012]2)培养基:
[0013]斜面活化培养基(YPD):葡萄糖20g、酵母浸膏10g、蛋白胨20g、琼脂20g，水1L，自然pH, 115°C,高压蒸汽灭菌15min,备用；
[0014]种子培养基:1.5%?2.5%葡萄糖、0.5%?1.5%酵母浸膏、1.5%?2.5%蛋白胨，自然pH, 115°C,高压蒸汽灭菌15min,备用；
[0015]生产培养基:25%?35%葡萄糖、0.1%?0.3%蛋白胨、0.2%?0.4%尿素、0.5%?
1.5% 玉米浆干粉、3.5% ?4% 氯化钠、0.03% ?0.07%MgS04.7Η20、0.005% ?0.015% 氯化钙，0.03%?0.07%硫胺素(单独添加)，其余为水。
[0016]3)菌种的活化与种子液的获得:
[0017]将保存在4°C的酿酒酵母菌接种于斜面活化培养基上，于20?30°C恒温培养36?48h ;如此连续传代活化2?5次后，再接种到种子培养基中，于28?32°C、150r/min恒温摇床培养12?24h，得到酿酒酵母菌种子液。
[0018]4)生产:
[0019]将除硫胺素以外的生产培养基配料溶解于水中加到不锈钢机械搅拌发酵罐中，115°C，高压蒸汽灭菌15min，冷却至28?32°C，接入已过滤除菌的硫胺素溶液，然后按5?15% (v/v)的接种量接入酿酒酵母菌种子液，在罐温为28?32°C，pH为恒定5.0?5.5，转速为200?400r/min，通气量为0.5m3/h，罐压为0.02Mpa的条件下发酵，于发酵24和48h分别补料一次，共发酵72?96h，得到抗奶牛热应激的饲料添加剂。
[0020]上述获得的抗奶牛热应激的饲料添加剂中含酿酒酵母菌的活菌数达到IO9CFU/mL，甘油含量为67?80g/L。
[0021]有益效果:
[0022]酵母培养物可以调整菌群结构，刺激瘤胃微生物生长，改变胃肠内挥发性脂肪酸的比例，增加采食量，提高饲料利用率和生产性能等。另一方面，甘油作为一种能量补充物已应用到围产期、泌乳早期及泌乳中期的奶牛。在产前与产后添加甘油可以提高能量利用率，改善奶牛能量平衡，减轻或预防奶牛能量代谢病。因此，甘油可以缓解奶牛热应激中的能量不足。本发明利用酵母菌可将糖转化为甘油的原理，对培养基和培养条件进行优化，在高渗条件下通过连续补料方式发酵生产出富含甘油、酵母活菌，以及丰富的氨基酸、维生素等微生物代谢产物的发酵制品，能协同发挥甘油和酵母菌的双重功效，可显著提高热应激条件下奶牛的泌乳量、4%乳脂校正乳产量和乳脂率，提高血糖浓度，降低乳中体细胞数、非酯化脂肪酸和尿素氮的浓度，为奶牛补充能量，减缓体重的降低，在一定程度上增强抗氧化能力，降低热休克蛋白HSP70mRNA水平，有效缓解了奶牛的热应激。
[0023]本发明中涉及的甘油是由酿酒酵母菌而来，真正实现了安全、无污染和成本低廉；并且省却了普通甘油的提纯过程。目前，国内外关于甘油和直接饲喂微生物联合应用对奶牛热应激的影响的研究报道较少，而对富甘油酵母菌发酵制品缓解奶牛热应激的研究，在国内外均未见报道。
[0024]本发明在已公开专利201110057770.6生产含甘油酵母培养物方法的基础上，对发酵培养基进行了优化，且通过连续补料发酵的方式，使生产等量的甘油所需的部分原料减少，发酵时间缩减了一半，尤其是产物中甘油浓度增加了一倍，更重要的是首次通过动物试验发现富甘油酵母菌发酵制品具有显著缓解奶牛热应激的作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1.试验期间奶牛泌乳量随THI变化图。C为对照组，Y为酵母菌组，G为甘油组，GY为抗奶牛热应激的饲料添加剂组。
[0026]图2.富甘油酵母菌对泌乳早期奶牛外周血淋巴细胞热休克蛋白HSP70mRNA表达的影响。C为对照组，Y为酵母菌组，G为甘油组，GY为抗奶牛热应激的饲料添加剂组。柱形图代表平均数土标准误，标有不同小写字母表示差异显著(P〈0.05)。
[0027]图3.试验期间牛舍平均温度、湿度和温湿度指数(THI)变化图。
[0028]图4.富甘油酵母菌对泌乳中期奶牛的直肠温度(A)和呼吸频率(B)的影响。C为对照组，Y为酵母菌组，G为甘油组，GY为抗奶牛热应激的饲料添加剂组。柱形图代表平均数土标准误，标有不同小写字母表示差异显著(P〈0.05)。
[0029]生物材料保藏信息
[0030]NAU-ZH-GY1,分类命名为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2011 -1 - 13，保藏编号为CGMCC N0.4551。
具体实施方案
[0031]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0032]实施例1南京某奶牛场
[0033]1.抗奶牛热应激的饲料添加剂的生产
[0034]I)菌种:
[0035]酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae, Sc)NAU -ZH- GYl,由本实验室提供，已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号CGMCC N0.4551。
[0036]2)培养基:
[0037]斜面活化培养基(YPD):葡萄糖20g、酵母浸膏10g、蛋白胨20g、琼脂20g，水1L，自然pH, 115°C,高压蒸汽灭菌15min,备用；
[0038]种子培养基:葡萄糖28g、酵母浸膏Hg、蛋白胨28g，水1.4L，自然pH，115°C，高压蒸汽灭菌15min，备用；
[0039]生产培养基配料:葡萄糖42kg、蛋白胨280g、尿素420g、玉米浆干粉1.4kg，氯化钠
5.6kg、MgSO4.7H2070g、氯化钙14g，硫胺素70g (单独添加)。
[0040]3)菌种的活化与种子液的获得:
[0041]将保存在4°C的酿酒酵母菌NAU - ZH - GYl (CGMCC N0.4551)接种于斜面活化培养基上，于30°C恒温培养36h ;如此连续传代活化4次后，再接种到1.4L种子培养基中，于30°C、150r/min恒温摇床培养15h,得到酿酒酵母菌初级种子液。
[0042]将种子培养基配料葡萄糖280g、酵母浸膏140g、蛋白胨280g放入30L不锈钢机械搅拌发酵罐中，用水溶解至12.6L，115°C高压蒸汽灭菌15min，冷却至30°C，然后将1.4L初级种子液接入罐中扩大培养，培养温度:30°C ；pH:恒定5.0 ;转速:200r/min ;通气量:0.5mVh ;罐压:0.02Mpa ;培养时间:15h，得到酿酒酵母菌次级种子液。
[0043]4)发酵:
[0044]将上述生产培养基配料(除硫胺素)放入300L不锈钢机械搅拌发酵罐中，用水溶解至124.5L，115°C高压蒸汽灭菌15min，冷却至30°C，接入已过滤除菌的硫胺素溶液1.5L，然后接入14L酿酒酵母菌次级种子液。发酵温度:30°C ；pH:恒定5.0 ;转速:350r/min ;通气量:0.5mVh ;罐压:0.02Mpa ;发酵时间:72h。在发酵24和48h各补料一次，每次加入35L已灭菌的生产培养基溶液(含70L溶质配料，但氯化钠仍为35L量即1.4kg)，发酵结束，得到抗奶牛热应激的饲料添加剂。
[0045]按上述系列方法连续发酵6次，每次发酵结束后都进行分装，室温20°C保存，备用。
[0046]上述获得的抗奶牛热应激的饲料添加剂中所含酿酒酵母菌干重15.8g/L (含活菌数 2.42X 109CFU/mL);甘油含量为 76.6g/L。
[0047]2.酵母菌饲料添加剂的生产[0048]按照生产富甘油酵母菌饲料添加剂的方法生产酵母菌饲料添加剂，与之不同的是生产酵母菌添加剂时所用的生产培养基配料为(200L):葡萄糖10kg、酵母浸膏500g、蛋白胨500g、尿素1kg、玉米浆干粉1.5kg，转速为200r/min，发酵24h结束；连续发酵3次，室温20°C保存，备用。最终得到的酵母菌饲料添加剂中所含酿酒酵母菌干重33.lg/L(含活菌数
5.31 X 109CFU/mL,不含甘油)。
[0049]3.抗奶牛热应激的饲料添加剂饲喂高温环境下的泌乳奶牛
[0050](I)实施动物与分组
[0051]试验选择40头健康、2~4胎、体重为648±57kg、泌乳早期(60± 13天)的中国荷斯坦奶牛，根据胎次、泌乳天数和试验前10天平均泌乳量，并考虑奶牛位置，将奶牛随机均分为对照组C和试验组G、Y、GY四个处理组，每组5个重复，每个重复2头牛。对照组C饲喂基础日粮，试验组G、Y和GY，在此基础上分别添加食品级甘油150g/头?天(0.998g/g)、酵母菌添加剂IL/头.天(相当于酵母菌33.1g/头.天)和实施例1制备的抗奶牛热应激的饲料添加剂2L/头.天(相当于甘油153.2g/头.天，酵母菌31.6g/头.天)。试验时间为2012年6月3日-8月8日，其中预饲期7d，正式试验期60d。
[0052](2)日粮组成与饲养管理
[0053]试验奶牛饲养在夏天自然高温环境下的牛舍，饲养模式为双列对尾栓系式饲养，自由饮水。每日早、中、晚挤奶3次(7:30，14:30和21:00 )，采用管道式挤奶。试验采用TMR基础日粮，每头奶牛定栏定位饲喂，每日于挤奶后各饲喂一次。根据试验奶牛的体况和泌乳量，参照NRC (2001)奶牛营养需要并结合生产实践统一配制TMR基础日粮(如表1)。每次饲喂量均保证奶牛有5%采食量的残留，并分别按所需剂量将食品级甘油、酵母菌添加剂和实施例1制备的抗奶牛热应激的饲料添加剂拌于晨饲中，单独投喂。[0054]奶牛散热方式为间歇喷淋结合吹风。每三天记录牛舍温度、湿度(7:00~21:00 )，计算温湿度指数(THI)结果均高于72 (如图1)，说明奶牛已处于热应激条件下，其他管理按奶牛场日常管理进行。
[0055]表1试验奶牛的基础日粮配方和营养水平
【权利要求】
1.保藏号为CGMCC N0.4551 的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae, Sc)NAU - ZH - GYl在制备抗奶牛热应激的饲料添加剂中的应用。
2.一种抗奶牛热应激的饲料添加剂的生产方法，其特征在于包括: 1)菌种: 保藏号为 CGMCC N0.4551 的酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae, Sc)NAU - ZH - GYl，为农业部允许使用的饲料级益生菌菌种； 2)培养基: 斜面活化培养基(YPD):葡萄糖20g、酵母浸膏10g、蛋白胨20g、琼脂20g，水1L，自然pH, 115°C,高压蒸汽灭菌15min,备用； 种子培养基:1.5%?2.5%葡萄糖、0.5%?1.5%酵母浸膏、1.5%?2.5%蛋白胨，自然pH, 115°C,高压蒸汽灭菌15min,备用； 生产培养基:25%?35%葡萄糖、0.1%?0.3%蛋白胨、0.2%?0.4%尿素、0.5%?1.5%玉米浆干粉、3.5% ?4%氯化钠、0.03% ?0.07%MgS04.7Η20、0.005% ?0.015%氯化钙，0.03% ?0.07%硫胺素，其余为水，其中硫胺素单独添加； 3)菌种的活化与种子液的获得: 将保存在4°C的酿酒酵母菌接种于斜面活化培养基上，于20?30°C恒温培养36?48h ;如此连续传代活化2?5次后，再接种到种子培养基中，于28?32°C、150r/min恒温摇床培养12?24h，得到酿酒酵母菌种子液； 4)生产: 将除硫胺素以外的所有生产培养基配料溶解于水中加到不锈钢机械搅拌发酵罐中，115°C，高压蒸汽灭菌15min，冷却至28?32°C，接入已过滤除菌的硫胺素溶液，然后按5?15% (v/v)的接种量接入酿酒酵母菌种子液，在罐温为28?32°C，pH为恒定5.0?5.5，转速为200?400r/min，通气量为0.5m3/h，罐压为0.02Mpa的条件下发酵，于发酵24和48h分别补料一次，共发酵72?96h，得到抗奶牛热应激的饲料添加剂； 上述获得的抗奶牛热应激的饲料添加剂中含酿酒酵母菌的活菌数达到109CFU/mL，甘油含量为67?80g/L。
3.用权利要求2所述的生产方法获得的抗奶牛热应激的饲料添加剂。
【文档编号】A23K1/18GK103734497SQ201310632843
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年11月29日 优先权日:2013年11月29日
【发明者】黄克和, 刘瑾, 叶耿坪, 陈兴祥, 刘永杰, 刘云欢, 甘芳 申请人:南京农业大学