一种杂交兰花多倍体的诱导方法
【专利摘要】本发明具体涉及杂交兰花多倍体诱导方法，属于多倍体育种【技术领域】，以大花蕙兰‘爱神’（ Cymbidium LuckyGloria'Aguri'）与虎雪兰[ Cymbidiumhybridium ×( Cymbidiumtracyanum varhuanghua× Cymbidiummastersii ）]的杂交种萌发形成的无菌圆球茎作试材，利用秋水仙素对F1代圆球茎进行多倍体诱导，再将诱导后的圆球茎分化成芽和丛芽增殖培养，把鉴定为多倍体的植株经生根培养后，获得多倍体植株组培苗。本发明采用圆球茎结合秋水仙素浸泡法获得的杂交兰花多倍体植株，具有倍性特征显著，采用圆球茎作为诱导材料缩短了多倍体杂交兰植株培育的周期，且方法简单易于掌握。
【专利说明】一种杂交兰花多倍体的诱导方法
【技术领域】
[0001]本发明具体涉及杂交兰花多倍体诱导方法，属于多倍体育种【技术领域】。
【背景技术】
[0002]兰花是一种姿态优美，芳香馥郁的珍贵花卉，属中国传统十大名花之一。大花蕙兰作为重要的商品盆花和切花之一，目前倍受人们青睐，大花蕙兰常见品种‘爱神’{Cymbidium Lucky Gloria ’ Aguri’)为多年生草本植物,每株有花葶1_5支,花葶斜生,稍弯曲，从叶丛基本向外抽出，长35-80cm ;着花5-10朵，花大，艳丽红色，花期11月至翌年3 月，花期较长；<虎雪兰，[Cymbidium hybridiumY, {Cymbidium tracyanumvarhuanghua'XCymbidium Hiastersii1i是沉香虎头兰黄色素花与大雪兰杂交培育出的,遗传性状稳定，花期10-12月，长达40-60 d。目前由于品种和栽培技术较落后，国产(包括台湾进口)兰的质量与日本、韩国有明显差距，这种状况已远远不能满足我国人民群众对兰花各性状要求。特别是切花兰市场，大部分切花兰主要依靠进口，与我国丰富的兰花资源背道而弛，这就迫切需要充分利用我国优异兰花资源，培育出具有我国自主知识产权的新品种，促进兰花产业健康发展，并为我国兰花走向世界奠定坚实基础。
[0003]多倍体植株茎杆粗壮，生长坚实，耐倒伏，叶片增厚增宽，绿色加深，光合作用增强，增加新的纹饰特征、花朵比较大且紧凑，花期长而迟。这些特征大大提高了花卉的产量与质量，增加了花卉的观赏价值和商品价值，所以多倍体育种在花卉上有广泛的应用。在自然条件下，由于外界环境的变化和遗传结构的不稳定性，植物本身会发生自发突变，然而这类突变发生的频率极低，并因植物种类和基因的不同而存在差异。自然界中植株变异率极低，远远不能够满足兰花育种工作的需要，化学诱变育种是目前一种迅速发展的作物育种技术，具有使用方便，特异性较强和诱变后代较易稳定遗传等特点。
[0004]化学诱变育种是利用化学诱变剂诱变产生多倍体的方法。此方式是目前应用最广泛，操作简单易行，突变频率高，专一性强，适用范围广的方法。秋水仙素是目前主要采用的诱变剂。诱导材料通常选取种子、顶芽、侧芽以及组织培养中的愈伤组织、圆球茎、不定芽等分裂旺盛的器官或组织，用秋水仙素处理诱导效果与作用时间和使用的浓度及温度、处理的植物种类和器官等因素有关，一般常用的处理浓度在0.01%-0.2%，处理温度一般在17-20。。。
[0005]化学诱变多倍体较常用的诱导方法有滴液法、浸泡法、混培法、注射法等。在实际工作中运用最简便有效的方式之一是:浸泡法，先将培养材料在化学试剂中浸泡处理之后，在转入预先制作好的培养基中进行培养的方法。二就是混培法，将培养材料与含化学试剂的培养基培养一段时间之后，诱导加倍后再转入分化培养基中培养的方式。但对于秋水仙素的浓度，针对不同材料有不同的实用范围。因秋水仙碱类的化学药品相对来说会对细胞产生毒害作用，影响细胞的正常生长，时间过长、浓度过高会抑制材料生长，甚至引起毒害，处理浓度太低、时间过短起不到作用。诱导方法也因培养材料而异。郑君强等用秋水仙碱诱导四季桔的研究结果表明浸泡法效果较好；而段英姿等用秋水仙碱诱导菘蓝多倍体时发现秋水仙碱加入培养基中更有助于多倍体的形成。
[0006]多倍体诱导会导致植物嵌合体、二倍体和多倍体植株共同存在的现象。而嵌合体现象的存在可能会导致多倍体诱导育种失去原有的意义，然而突变细胞和非突变细胞的生长竞争力则是能否形成嵌合体的重要原因。组织培养与秋水仙素诱导相结合培育植物多倍体的技术是在传统的化学诱导基础上发展而来的，并伴随植物组织培养技术的发展而日趋成熟。其优点一是减少嵌合体的发生。培育植株多倍体的传统诱导法是以植物生长点、侧芽或种子等为诱导对象，由多细胞构成的芽发育成植株，因细胞分裂不同步，容易形成嵌合体，难于获得同质的多倍体，诱导率也较低。随着生物技术的发展，通过对材料进行组织培养后再作诱导处理，能诱导加倍的多倍体单细胞分化出不定芽，并发育成单株，形成同质多倍体，提高诱导率，有效排除嵌合体的干扰，并且缩短多倍体培育时间。二是试验条件易控制。此种技术是在室内进行，室内试验条件易控制，且易于重复试验结果，提高工作效率。
[0007]一般认为影响兰花多倍体诱导成功率的因素包括植物本身的生理特性、诱导材料的选择、诱导方法的选择、实际操作过程中引起的误差等。研究表明植株上任一生物学部分均可作为处理材料，只要秋水仙素浓度和处理时间适宜，结合相应的培养基均可获得变异的多倍体。目前以丛芽为诱导材料，已在齿瓣石斛、石斛、野生黄蝉兰和碧玉兰等获得了多倍体植株。以兰花圆球茎和根状茎为材料进行多倍体诱导在国外内已有些研究报道。Hsien等用秋水仙素处理五唇兰/w/7cA6?r_ri?a)的圆球莖(直径为1^1.2mm),获得了再生植株中46%四倍体。Kim等用秋水仙素处理寒兰根状茎，获得了诱导率分别为4.5%、5.2%、6.7% (2n=66^80)的多倍体材料。国内在春兰、铁皮石斛和二倍体大花蕙兰品种“红宝石”等少数几个品种上开展研究，培育出了四倍体植株。但由于圆球茎和根状茎是兰属植物种子萌发的中间繁殖体，经过分化培养才能形成芽体，采用圆球茎或根状茎作为诱导材料，可以使多倍体诱导和芽的分化同时发生，大大缩短了获得多倍体植株的育种时间。
【发明内容】
[0008]本发明目的在于提供一种杂交兰花多倍体的植株的制备方法，利用该方法获得具有四倍体特征的杂交兰植株。
[0009]本发明采用的技术方案是:
一种兰花杂交多倍体的植株的培育方法，所述方法包括:
(O将兰花杂交种萌发形成的无菌圆球茎浸泡在0.1%_6%浓度的秋水仙素溶液中，分别处理24h-72h后用无菌水冲洗4-5次，滤干水分，转入培养基中。培养条件:pH为
5.8-6.0、温度(25±2) °C、光照 12 h/d，光照强度 1800_25001x ；
(2)根据多倍体植株与二倍体植株呈现出的较明显的特征为茎粗壮，枝少、叶少、叶片宽而厚、叶色深等特点，对变异植株进行初步筛选，将初步筛选出来的变异植株转入培养基上进行芽诱导和增殖培养，培养条件同上；
(3)选取二倍体植株和经三次继代后稳定扩繁的变异植株，通过形态学、气孔和染色体鉴定为多倍体的植株转接于培养基中，鉴定方法、培养条件同上。
[0010]步骤(I)所述兰花杂交种萌发形成的无菌圆球茎制备的消毒方法为:取大花蕙兰‘爱神’与虎雪兰发育成熟但尚未裂开的自交蒴果，用75%的酒精擦干净，在超净超净工作台上用75%的酒精消毒3?6min，无菌水清洗2次，然后放入0.2%的升汞中消毒10?15min,无菌水冲洗4次，剖开果皮，取出种子。
[0011]步骤(I)所述杂交种萌发形成的无菌圆球茎制备的培养方法:剖开消毒后自交蒴果果皮，取出种子，然后将种子撒播到种子无菌萌发的培养基中。种子无菌萌发的培养基包含 1/2MS基本培养基、0.5-2.5 mg/L6-BA、0.1-1.0 mg/LNAA、30mg/L蔗糖和 6.0-7.0g.Γ1 琼月旨。培养条件:温度25?30°C，采用暗培养。种子萌发形成的中间繁殖体即为杂交兰无菌圆球茎。
[0012]步骤(I)所述的经秋水仙素浸泡过的无菌圆球茎转入最佳配方的培养基中，培养基的最佳配方筛选方法如下:将获得的杂交兰无菌圆球茎接种到含有不同浓度细胞分裂素的培养基上进行增殖培养，从6-BA、NAA、KT、添加物四个因素研究对杂交兰无菌圆球茎增殖的影响。6-BA 浓度为 0.5-2.0mg/L、NAA 浓度为 0.1-1.5mg/L、KT 浓度为 0.1-1.5mg/L，添加物种类分别为香蕉+花宝4号、香蕉和花宝4号。每个处理5瓶(每瓶10个圆球茎)，60d后观察苗体生长情况，统计增殖情况。实验结果表明1/2MS+1.0mg/L6-BA+0.5 mg/LNAA+0.lmg/LKT+0.3%花宝4号+活性炭0.5g/L诱导增殖效果最佳，平均增殖率达342%。并且在增殖过程中，圆球茎已经开始分化为芽。1/2MS指溶液中所含的大量和微量元素为MS的一半，其他不变。
[0013]步骤(2)所述的多倍体的鉴定方法如下:取植株幼嫩根尖Icm根尖放入玻璃瓶中，加入0.004M 8-轻基喹啉于18°C下预处理9h ;将预处理材料洗漆后转入Carony’ s液(乙醇:乙酸=3:1)中，置冰箱内固定3h。取出固定好的材料，洗涤3-4次后放入Imol/L的HCl酸解20-30min。用蒸馏水清洗3_5次解离过的材料(如果清洗不干净染色效果较差，会影响压片效果)，置于载玻片上，切取根冠末端1_，用改良后的卡宝品红溶液染色4_6min，用刀片把染色的根尖捣烂，盖上盖玻片，用铅笔的橡皮头轻敲盖玻片，使细胞均匀分散。并用滤纸把盖玻片周围多余的染色剂吸干。将做好的切片放于电子显微镜下观察染色体分散情况，然后选择染色体形态、分散较好的片子，进行拍照。镜检观察2n=4x=80，而二倍体杂交兰2n=2x=40，故可确定获得的植株为四倍体植株。
[0014]按照本发明方法得到的杂交兰四倍体幼苗，与二倍体杂交兰相比，株高、叶宽、叶厚和茎粗明显比二倍体杂交兰粗大；20倍镜下，单个气孔二倍体长径均值为27.5 μ m、短径为21.4 μ m、长径X短径为588.2 μ m2，四倍体长径均值为32.4 μ m、短径为25.2 μ m、长径X短径为817.6 μ m2。
[0015]作为优选，步骤(I)所述的秋水仙素浓度最佳为3%，处理时间为72小时。对于特定品种的大花蕙兰与虎雪兰杂交品种，在该条件下诱变率高达40%。
[0016]本发明获得的杂交兰多倍体组培苗经3-4次继代转接培养后，植株性状稳定性好，与诱导当代相似。
[0017]本发明的有益效果主要体现在:本发明利用杂交兰种子萌发的无菌圆球茎作为材料获得的杂交兰多倍体植株，具有显著的多倍体特征；采用圆球茎作为诱导材料缩短了多倍体杂交兰植株培育的周期，可获得稳定高效发生的多倍体，且制备方法简单，为今后兰花复合育种进一步研究提供理论依据和应用基础，本发明获得的杂交兰多倍体具有较高的应用价值。
[0018]通过本试验结果看出，利用浸泡法对大花蕙兰和虎雪兰杂交种进行多倍体诱导效果比混培法效果好，浸泡法诱导率高于混培法。试验所得大部分变异植株均由浸泡法所得，原因可能是因为浸泡法对组织的作用较为直接。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为染色体计数结果，a为二倍体杂交兰，b为四倍体杂交兰(即本发明制备的多倍体植株)，XlOO倍镜下体细胞中期染色体；
图2为生根苗植株，左边为二倍体杂交兰植株，右边为本发明所制备的四倍体杂交兰植株；
图3为得到的杂交兰多倍体幼苗的气孔大小结果，a为二倍体杂交兰植株，b为本发明所制备的四倍体杂交兰植株；X20倍镜下单个视野中的气孔大小。
【具体实施方式】
[0020]以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0021]实施例1:
1)取大花蕙兰‘爱神’iCymbidium Lucky Gloria ’ Aguri’)与虎雪兰hybridiumY, {Cymbidium tracyanumvarhuanghua X Cymbi di um mas ter si i ) ] ^ W但尚未裂开的自交蒴果，用75%的酒精擦干净，在超净超净工作台上用75%的酒精消毒3?6min,无菌水清洗2次,然后放入0.2%的升萊中消毒10?15min,无菌水冲洗4次,剖开果皮，取出种子；
2)将种子撒播到1/2MS 基本培养基、0.5-2.5 mg/L6_BA、0.1-1.0 mg/LNAA、30mg/L 蔗糖和6.0-7.0g.Γ1琼脂的培养基中，放入温度25?30°C培养室中进行暗培养；
3)将杂交种萌发形成的无菌圆球茎浸泡在3%浓度的秋水仙素溶液中，处理72h，用无菌水冲洗 4-5 次，滤干水分，转入 1/2MS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+0.lmg/LKT+0.3% 花宝 4号+活性炭0.5g/L培养基中。培养条件:pH为5.8-6.0、温度(25±2) °C、光照12 h/d,光照强度1800-25001x。
[0022]4)根据多倍体植株与二倍体植株呈现出的叶形、叶色、株型、株色、生长势上的差别，对变异植株进行初步筛选。将初步筛选出来的变异植株转入1/2MS +1.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA +0.lmg/L ΚΤ+0.3%花宝4号+活性炭0.5g/L培养基上进行芽诱导和增殖培养，培养条件同上。
[0023]5)选取二倍体植株和经三次继代后稳定扩繁的变异植株，通过形态学、气孔和染色体鉴定多倍体植株，多倍体鉴定的具体步骤为:
早上8:30-9:00时，取组培苗植株新长出3-5天的幼嫩根尖，将取出的大小为Icm根尖放入玻璃瓶中，加入0.004M 8-羟基喹啉于18°C下预处理9h。将预处理材料洗涤后转入Carony’s液(乙醇:乙酸=3:1)中，置冰箱内固定3h。取出固定好的材料，洗涤3_4次后放入lmol/L的HCl酸解20_30min。用蒸馏水清洗3_5次解离过的材料，置于载玻片上，切取根冠末端1mm，用改良后的卡宝品红溶液染色4-6min，用刀片把染色的根尖捣烂，盖上盖玻片，用铅笔的橡皮头轻敲盖玻片，使细胞均匀分散。并用滤纸把盖玻片周围多余的染色剂吸干。将做好的切片放于电子显微镜下观察染色体分散情况，然后选择染色体形态、分散较好的片子，进行拍照。镜检观察2n=4x=80，二倍体杂交兰2n=2x=40，故可确定获得的植株为四倍体植株。
[0024]将四倍体植株转接到1/2MS+1.0mg/L6-BA+l.5mg/LNAA+l.0mg/LIBA+ 活性炭0.5g/L生根培养基中，培养条件同上。
[0025]实施例2:
具体步骤如实施例1所述，不同的是步骤3中的秋水仙素处理时采用将秋水仙素溶液直接加的培养基中，浓度为3%，处理时间为14d，变异率为26.7%。
[0026]以上实施例仅为本发明的部分实施方式，本发明不限于上述的实施例，步骤3中秋水仙素的浓度及处理时间可根据实际情况进行调整，本领域技术人员能从该
【发明内容】
中直接导出的所有变形，均因落入本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种兰花杂交多倍体的植株的培育方法，所述方法包括: (O将兰花杂交种萌发形成的无菌圆球茎浸泡在0.1%_6%浓度的秋水仙素溶液中，分别处理24h-72h后用无菌水冲洗4-5次，滤干水分，转入培养基中；培养条件:pH为5.8-6.0、温度(25±2) °C、光照 12 h/d，光照强度 1800_25001x ； (2)根据多倍体植株与二倍体植株呈现出的较明显的特征为茎粗壮，枝少、叶少、叶片宽而厚、叶色深等特点，对变异植株进行初步筛选，将初步筛选出来的变异植株转入培养基上进行芽诱导和增殖培养，培养条件同上； (3)选取二倍体植株和经三次继代后稳定扩繁的变异植株，通过形态学、气孔和染色体鉴定为多倍体的植株转接于培养基中，鉴定方法、培养条件同上。
2.如权利要求1所述的一种兰花杂交多倍体的植株的培育方法，其特征在于步骤(I)所述兰花杂交种萌发形成的无菌圆球茎制备的消毒方法为:取大花蕙兰‘爱神’与虎雪兰发育成熟但尚未裂开的自交蒴果，用75%的酒精擦干净，在超净超净工作台上用75%的酒精消毒3?6min,无菌水清洗2次,然后放入0.2%的升萊中消毒10?15min,无菌水冲洗4次，剖开果皮，取出种子。
3.如权利要求1或2所述的一种兰花杂交多倍体的植株的培育方法，其特征在于步骤(I)所述杂交种萌发形成的无菌圆球茎制备的培养方法:剖开消毒后自交蒴果果皮，取出种子，然后将种子撒播到种子无菌萌发的培养基中；种子无菌萌发的培养基包含1/2MS基本培养基、0.5-2.5 mg/L6-BA、0.1-1.0 mg/LNAA、30mg/L 蔗糖和 6.0-7.0g.Γ1 琼脂；培养条件:温度25?30°C，采用暗培养；种子萌发形成的中间繁殖体即为杂交兰无菌圆球茎。
4.如权利要求1或3所述的一种兰花杂交多倍体的植株的培育方法，其特征在于步骤(I)所述的经秋水仙素浸泡过的无菌圆球茎转入最佳配方的培养基中，培养基的最佳配方筛选方法如下:将获得的杂交兰无菌圆球茎接种到含有不同浓度细胞分裂素的培养基上进行增殖培养，从6-BA、NAA、KT、添加物四个因素研究对杂交兰无菌圆球茎增殖的影响；6_BA浓度为0.5-2.0mg/L、NAA浓度为0.1-1.5mg/L、KT浓度为0.1-1.5mg/L，添加物种类分别为香蕉+花宝4号、香蕉和花宝4号；每个处理5瓶，每瓶10个圆球茎，60d后观察苗体生长情况，统计增殖情况。
5.如权利要求1所述的一种兰花杂交多倍体的植株的培育方法，其特征在于步骤(I)所述的秋水仙素浓度最佳为3%，处理时间为72小时。
【文档编号】A01H4/00GK104273029SQ201410450488
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年9月5日 优先权日:2014年9月5日
【发明者】王玉英, 李枝林, 李光宏, 孟英, 李志敏, 王亚沉 申请人:云南农业大学