本发明涉及植物培养繁殖技术领域，具体涉及一种蕙兰无毒苗培养繁殖方法。
背景技术：
蕙兰是兰科蕙兰属的地生草本植物，假鳞茎不明显，集生成丛，呈椭圆形。叶带形，直立性强，叶脉透亮，边缘常有粗锯齿。花常为浅黄绿色，唇瓣有紫红色斑，一茎多花。蕙兰是中国栽培最久和最普及的兰花之一，属于珍稀物种，为国家二级重点保护野生物种，是比较耐寒的兰花品种之一。
由于蕙兰种子非常微小，几乎无胚乳，在自然条件下种子萌发率极低，因此在生产实践中多采用分株方式进行繁殖，无性繁殖引发的病毒传播严重制约了兰花产业化发展，病毒可造成植株叶斑、坏死以及花朵变色、畸形等症状，严重影响其品质，目前尚无药物能有效防治病毒的危害与传播，因此繁殖蕙兰无毒苗是产业化发展的必经之路。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种蕙兰无毒苗培养繁殖方法，从而培养蕙兰无毒苗，实现蕙兰的无病毒栽培。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一种蕙兰无毒苗培养繁殖方法，包括以下步骤：
(1)植株热处理：将无病虫害长势良好的蕙兰放入培养箱中进行培养，培养期间，培养箱内湿度为80～90％，培养箱内温度开始时为30℃，每隔一天上升1℃，直至38℃，培养时间为22～25d，光照时间为16h/d，光照强度为3000～5000lx；
(2)材料选取：将上述热处理后的蕙兰从培养箱中取出，切取蕙兰的茎尖；
(3)材料消毒：将上述切取的茎尖用清水冲洗干净，冲洗后剥去外层叶片，在超净工作台上用体积分数为70％的酒精浸泡20～30s，然后用质量分数为0.2％的氯化汞溶液分2～3次共消毒5～6min，每次用氯化汞溶液消毒后用无菌水漂洗5次，并用消毒滤纸吸干表面水分；
(4)原球茎诱导培养：将上述消毒后的茎尖在解剖镜下剥离成长度为0.3～0.5mm的茎段，然后接种到诱导培养基中进行培养，所述诱导培养基为：B5培养基+0.3～0.7mg/L 6-BA+0.1～0.3mg/L IBA+0.2～0.3mg/L VC+0.05～0.15mg/L GA3，培养时间为22～25d，培养温度24～26℃，光照时间为12h/d，光照强度为1500～2000lx；培养时间结束后，再将培养材料整体移入新的诱导培养基中继续培养，培养时间为15～20d，培养温度24～26℃，光照时间为12h/d，光照强度为1500～2000lx；
(5)增殖继代培养：将培养后的原球茎在无菌工作台上进行分割，然后在接入到增殖培养基中继续培养，所述增殖培养基为：B5培养基+0.8～1.5mg/L6-BA+0.1～0.3mg/L NAA+8～12％椰汁，培养条件：培养温度24～26℃，光照时间为12h/d，光照强度为1500～2000lx；
(6)壮苗培养：增殖继代培养后，选择高2cm以上、基部有明显突起的小苗转入壮苗培养基中培养，所述壮苗培养基为：B5培养基+2～4mg/L NAA，培养时间为15～20d，培养温度24～26℃，光照时间为13h/d，光照强度为1800～21000lx；培养时间结束后，再向壮苗培养基中加入0.3％活性炭，培养温度27～29℃，光照时间为15h/d，光照强度为2500～3000lx；
(7)移栽：当试管苗生长至4～5cm高，根2～4条，叶1～2片时，将试管苗放在自然光下炼苗5～7天，打开瓶盖炼苗1～2天；然后取出培养苗，用清水洗净附着在根部的培养基，清洗时注意不要损害根部，然后移栽至水苔和腐殖土质量比为1:2的混合基质中，保持湿度和通风，空气湿度为75～85％，温度为20～25℃。
如上所述的一种蕙兰无毒苗培养繁殖方法，进一步说明为，所述材料消毒步骤中，每次用质量分数为0.2％的氯化汞溶液消毒时，向氯化汞溶液中加入一滴吐温-20。
如上所述的一种蕙兰无毒苗培养繁殖方法，进一步说明为，所述诱导培养基为：B5培养基+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA+0.25mg/L VC+0.1mg/L GA3。
如上所述的一种蕙兰无毒苗培养繁殖方法，进一步说明为，所述增殖培养基为：B5培养基+1mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+10％椰汁。
本发明的有益效果是：采用本方法能使培养后的蕙兰苗株发病率低，成苗率高，苗株品质好，栽培后适应性强，苗株长势良好，通过生物技术手段在短时间内，满足了商业化生产的需求，为企业规模化、产业化培养蕙兰无毒苗提供了技术支持。
具体实施方式
下面对本发明具体实施方式做进一步的阐述。
本发明提供了一种蕙兰无毒苗培养繁殖方法，从而培养蕙兰无毒苗，实现蕙兰的无病毒栽培，该方法包括以下步骤：
(1)植株热处理：将无病虫害长势良好的蕙兰放入培养箱中进行培养，培养期间，培养箱内湿度为80～90％，培养箱内温度开始时为30℃，每隔一天上升1℃，直至38℃，培养时间为22～25d，光照时间为16h/d，光照强度为3000～5000lx；部分病毒在高温条件下会失去活性，持续一定时间后，病毒含量不断下降，经过热处理能在一定程度上脱掉部分病毒，蕙兰热处理的温度上限为38℃，超过38℃，会使蕙兰失去活性，甚至枯死，热处理温度采用阶梯上升，能使蕙兰植物逐渐适应温度的变化。
(2)材料选取：将上述热处理后的蕙兰从培养箱中取出，切取蕙兰的茎尖；植物病毒在植株体内主要沿植物输导组织蔓延发展，植物顶端分生组织没有导管、筛管的分化，同时植物顶端细胞生活力强，能不断分裂摆脱病毒的侵入，所以植物顶端分生细胞中一般不含病毒，切取蕙兰的茎尖进行组培，从而可以获得蕙兰无毒苗。
(3)材料消毒：将上述切取的茎尖用清水冲洗干净，冲洗后剥去外层叶片，在超净工作台上用体积分数为70％的酒精浸泡20～30s，然后用质量分数为0.2％的氯化汞溶液分2～3次共消毒5～6min，每次用氯化汞溶液消毒后用无菌水漂洗5次，并用消毒滤纸吸干表面水分；一般消毒用的0.1％氯化汞溶液灭菌效果不佳，而浓度较高的氯化汞溶液又易使茎尖失去活性，抑制诱导，而本培育方法采用质量分数为0.2％的氯化汞溶液能较好起到灭菌作用而又对其活性影响较小，并且采用分2～3次操作，能更好的保护茎尖活性；
表1为采用上述消毒方法对蕙兰茎尖进行处理后，放置于普通诱导培养基中进行培养，对培养后蕙兰茎尖诱导率的试验结果：
由表1中可以看出，采用质量分数为0.2％的氯化汞溶液能较好起到灭菌作用而又对其活性影响较小，并且采用分2～3次操作，能更好的保护蕙兰茎尖活性，大大增加蕙兰茎尖的诱导率。作为优选，每次用质量分数为0.2％的氯化汞溶液消毒时，向氯化汞溶液中加入一滴吐温-20。
(4)原球茎诱导培养：将上述消毒后的茎尖在解剖镜下剥离成长度为0.3～0.5mm的茎段，接种成活率与茎段大小成正比关系，茎段小于0.2mm时，成活率不超过25％，所以本发明采用0.3～0.5mm的茎段，然后接种到诱导培养基中进行培养，所述诱导培养基为：B5培养基+0.3～0.7mg/L 6-BA+0.1～0.3mg/L IBA+0.2～0.3mg/L VC+0.05～0.15mg/L GA3，通过加入VC和GA3，能有效遏制培养材料的褐化，在诱导培养基中的培养时间为22～25d，培养温度24～26℃，光照时间为12h/d，光照强度为1500～2000lx，经过22～25天的培养后茎尖顶端周围开始出现白色晶莹的小突起，并逐渐长大形成1至数个原球茎，这时再将培养材料整体移入新的诱导培养基中继续培养，培养时间为15～20d，培养温度24～26℃，光照时间为12h/d，光照强度为1500～2000lx，经过15～20天的继续培养后，原球茎体积不断增大，逐渐转绿，在表面长出毛状假根，此时可进行增殖继代培养；
表2为诱导培养基成分及用量
作为优选，所述诱导培养基为：B5培养基+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA+0.25mg/L VC+0.1mg/L GA3，即为表2中诱导培养基1的成分及用量；
(5)增殖继代培养：将培养后的原球茎在无菌工作台上进行分割，然后在接入到增殖培养基中继续培养，所述增殖培养基为：B5培养基+0.8～1.5mg/L6-BA+0.1～0.3mg/L NAA+8～12％椰汁，培养条件：培养温度24～26℃，光照时间为12h/d，光照强度为1500～2000lx；通过在增殖培养基中继续培养，加快了原球茎的吸收，使原球茎体积和数量得到快速繁殖；
表3为增殖培养基成分及用量
作为优选，所述增殖培养基为：B5培养基+1mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+10％椰汁，即为表3中增殖培养基1的成分及用量；
(6)壮苗培养：增殖继代培养后，选择高2cm以上、基部有明显突起的小苗转入壮苗培养基中培养，所述壮苗培养基为：B5培养基+2～4mg/L NAA，培养时间为15～20d，培养温度24～26℃，光照时间为13h/d，光照强度为1800～21000lx；培养时间结束后，再向壮苗培养基中加入0.3％活性炭，培养温度27～29℃，光照时间为15h/d，光照强度为2500～3000lx；加入活性炭能模拟土壤黑暗环境有利于根系的生长，同时增加培养温度和光照强度，试管苗边分化边生根。
(7)移栽：当试管苗生长至4～5cm高，根2～4条，叶1～2片时，将试管苗放在自然光下炼苗5～7天，打开瓶盖炼苗1～2天；然后取出培养苗，用清水洗净附着在根部的培养基，清洗时注意不要损害根部，然后移栽至水苔和腐殖土质量比为1:2的混合基质中，保持湿度和通风，空气湿度为75～85％，温度为20～25℃，移栽成活率达90％以上。采用本方法能使培养后的蕙兰苗株发病率低，成苗率高，苗株品质好，栽培后适应性强，苗株长势良好，通过生物技术手段在短时间内，满足了商业化生产的需求，为企业规模化、产业化培养蕙兰无毒苗提供了技术支持。
本发明并不限于上述实例，在本发明的权利要求书所限定的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可做出的各种变形或修改均受本专利的保护。