本发明涉及生物技术领域，具体来说涉及一种，同时还涉及该含嘧菌酯的杀菌剂组合物的制备方法，及该含嘧菌酯的杀菌剂组合物在防治烟草赤星病、烟草白粉病及烟草灰霉病方面的用途。
背景技术：
烟草赤星病(brown spot)和烟草白粉病(white powder)是烟草生长期发生的分别由烟草赤星病菌Alternaria alternata(Fr.)Keissl和烟草白粉病菌Erysiphe cichoracearum DC引起的真菌性病害。它们均具有间歇性和爆发性的特点，严重时烟叶发病率可高达90％，使烤烟质量下降1-2个等级，重病区减产、减收达50％以上。近年来，烟草赤星病和烟草白粉病一直是严重威胁我国烟草生产的主要病害之一。此外，由灰葡萄孢(Botrytis cinerea Pers.:Fr)引起的烟草灰霉病也是烟草上的重要病害之一，烟草整个生育期内均可发病，以苗期及现蕾期发生较重。苗期主要发生于近地面的叶片上，高湿环境下病斑迅速扩展，直径可达5厘米以上，病斑呈湿腐状，其上布满灰色霉层。在集约化漂浮育苗的情况下，病菌很快扩散，严重威胁着烟苗的生产。因此，对烟草赤星病、白粉病、灰霉病的防治迫在眉睫。
长期以来，生产上主要靠化学防治药剂依靠菌核净来防治烟草赤星病，多菌灵、三唑酮等来防治烟草白粉病与灰霉病。由于病菌具有繁殖速率高、遗传变异大和适合度高的特性，多年连续大量使用化学药剂使得病原菌对主要防治杀菌剂产生严重的抗药性。因此，亟待寻找新的病害防治解决方案。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂嘧菌酯是一种现代广谱、高效、内吸性杀菌剂，纯品为浅综合结晶固体，别名为(E)-[2-[6-(2-氰基苯氧基)嘧啶-4-基氧]苯基]-3-甲氧基丙烯酸甲酯，相对密度为1.34g/cm3，溶解度20℃时为6mg/L，蒸气压20℃为1.1×10-7mPa，沸点为581.3℃。还未用于烟草病害的防治；同时，微生物菌剂可与病原菌竞争营养、空间位点，诱导植物产生抗病性，其次生代谢产物对病原菌具有抑制作用、对植物具有促生作用，且绿色、环保、安全，在植物病害的防治中具有重要的应用价值。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服上述问题而提供的一种对烟草赤星病、烟草白粉病及烟草灰霉病具有较好的防治效果，环境友好的含嘧菌酯的杀菌剂组合物。
本发明的另一目的在于提供该嘧菌酯组合物的制备方法。
本发明的再一目的在于提供该含嘧菌酯的杀菌剂组合物在防治烟草赤星病、烟草白粉病及烟草灰霉病方面的用途。
本发明的一种含嘧菌酯的杀菌剂组合物，其中：含嘧菌酯浓度为20-300μg/ml，解淀粉芽孢杆菌X60的浓度为1×106-1×1010CFU/ml。
上述的一种含嘧菌酯的杀菌剂组合物，其中：解淀粉芽孢杆菌X60，其形态特征：在NA培养基上培养24小时后产生单菌落，菌落为乳白色，圆形，边缘有细齿，中间隆起，表面光滑，菌体为短直杆状，革兰氏阳性菌，可产生芽孢，可分泌蛋白酶、纤维素酶等。
该菌种已于2013年8月13日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址：湖北省武汉市武昌珞珈山，武汉大学)，保藏号：CCTCC M 2013375，名称为：解淀粉芽孢杆菌X60(Bacillus amyloliquefaciens X60)。
(一)解淀粉芽孢杆菌X60(Bacillus amyloliquefaciens)的分离步骤：
采用“稀释分离法”称取10g烟草根围土壤于洁净烧杯中，加于90ml无菌水，磁力搅拌使其充分混匀，静置20分钟后吸取0.5ml上清液于15×150mm洁净试管中，添加4.5ml无菌水充分混匀得10-1浓度母液，再从稀释后的试管中吸取0.5ml上清液，再加入4.5ml无菌水充分混匀制得10-2浓度溶液，依次稀释至10-9不同浓度的土壤溶液待用。分别吸取上述不同浓度土壤溶液100μl，均匀涂布于培养细菌的NA平板上，28℃黑暗培养，待细菌长出后挑取单菌落纯化。
(二)培养基：
牛肉膏蛋白胨固体培养基(NA)：牛肉膏3g，蛋白胨10g，琼脂粉16g，水1000ml，pH 6.8-7.2。
牛肉膏蛋白胨液体培养基(NB)：牛肉膏3g，蛋白胨10g，水1000ml，pH 6.8-7.2。
(三)菌种的保种和传代：
用18×180mm的试管，盛NA培养基9ml，做成斜面，接种细菌，28℃培养2-3天，置4℃保存，3个月转种一次。
将纯化后的细菌在NA培养基上划线培养，待细菌长出后挑出单菌落，用灭菌的牙签将细菌单菌落挑至装有5ml NB培养基的试管(15×150mm)里摇培24h，吸取700μl菌液至2ml菌株保存管中，再向保存管中添加700μl30％灭菌甘油，置于-20℃冰柜中长期保存。
(四)菌种的形态特征：
该菌形成的菌落在NA平板上，30℃，培养2d，菌落直径5-15mm，菌落近圆形、白色、半透明、光滑湿润、稍隆起，菌体为短直杆状，为好氧细菌，革兰氏反应阳性。经细菌鉴定手册描述，结合Biolog鉴定结果及16S rDNA序列分析结果，将这一菌株记为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens X60)。
(五)菌种的培养特性
培养温度20-50℃，最适温度范围30-37℃；培养初始pH4.0-9.0，最适6.0-7.0；培养盐浓度0.5-5％，最佳0.5％；可培养碳源有葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、纤维二塘、淀粉，其中葡萄糖最佳；可培养氮源有牛肉膏、蛋白胨、KNO3、NH4NO3、(NH4)2SO4和NaNO2，其中牛肉膏和蛋白胨最佳。
本发明的一种含嘧菌酯的杀菌剂组合物的制备方法。包括以下步骤：
(1)将质量浓度为95％嘧菌酯原药用甲醇配成1×104μg/ml母液，4℃低温保存；
(2)在NB培养液中摇培解淀粉芽孢杆菌X60，10000rpm下离心10分钟收集解淀粉芽孢杆菌X60湿菌体；将解淀粉芽孢杆菌X60在NB培养液中30℃180rpm振荡培养36-48小时，然后10000rpm离心10分钟，取X60湿菌体与菌体保藏液，按质量体积比为1:50配成菌剂，菌剂成品活菌浓度为1×1010-1×1012CFU/ml；
(3)将嘧菌酯与解淀粉芽孢杆菌X60湿菌体混合，配制成含嘧菌酯浓度为20-300μg/ml，解淀粉芽孢杆菌X60的浓度范围为1×106-1×1010CFU/ml。
上述的的一种含嘧菌酯的杀菌剂组合物的制备方法，其中NB培养液的配制方法为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，加去离子水至1L，pH 6.8-7.2，经120℃灭菌20分钟。
上述的的一种含嘧菌酯的杀菌剂组合物的制备方法，其中：菌体保藏液含0.01mol/L磷酸盐缓冲液、0.001mol/L的Tween 40非离子型表面活性剂。
本发明的一种含嘧菌酯的杀菌剂组合物在防治烟草赤星病、烟草白粉病及烟草灰霉病方面的用途。
本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知：本发明经活体试验表明，嘧菌酯与解淀粉芽孢杆菌菌株X60组合物对烟草赤星病、烟草白粉病及烟草灰霉均具有较好的抑制作用，且具有较长时间的预防作用。病害防治效果比嘧菌酯单独作用、及解淀粉芽孢杆菌单独作用时的防治效果好。该组合物中解淀粉芽孢杆菌用湿菌与菌种保藏液配制而成，菌体保藏液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液、及0.001mol/L的Tween 40非离子型表面活性剂；嘧菌酯先用甲醇(分析纯)配成1×104μg/ml的母液，使用时用含0.01％吐温40的无菌水稀释。该组合物可以直接喷雾大田期的烟叶及漂浮育苗苗床上的烟苗。本发明是专门针对烟草赤星病、烟草白粉病及烟草灰霉病开发的防病组合物。由于组合物对病原菌的作用位点多，对环境友好，可有效解决烟草赤星病菌和烟草白粉病菌对传统防治药剂产生的抗药性问题，有利于烟叶的安全可持续发展。
具体实施方式
实施例1
一种含嘧菌酯的杀菌剂组合物的制备方法。包括以下步骤：
(1)将质量浓度为95％嘧菌酯原药用甲醇配成1×104μg/ml的母液，4℃低温保存；
(2)将解淀粉芽孢杆菌X60(Bacillus amyloliquefaciens X60)在NB培养液(配制方法为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，加去离子水至1L，pH6.8-7.2，经120℃灭菌20分钟)，30℃180rpm振荡培养36-48小时，然后10000rpm离心10分钟，取X60湿菌体与菌体保藏液(菌体保藏液含0.01mol/L、磷酸盐缓冲液0.001mol/L的Tween 40非离子型表面活性剂)，按质量体积比为1:50配成菌剂，菌剂成品活菌浓度为1×1010-1×1012CFU/ml；
(3)将嘧菌酯与解淀粉芽孢杆菌X60湿菌体混合，配制成含嘧菌酯浓度为20μg/ml，解淀粉芽孢杆菌X60的浓度范围为1×1010CFU/ml。
实施例2
一种含嘧菌酯的杀菌剂组合物的制备方法。包括以下步骤：
(1)将质量浓度为95％嘧菌酯原药用甲醇配成1×104μg/ml的母液，4℃低温保存；
(2)将解淀粉芽孢杆菌X60(Bacillus amyloliquefaciens X60)在NB培养液(配制方法为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，加去离子水至1L，pH6.8-7.2，经120℃灭菌20分钟)，30℃180rpm振荡培养36-48小时，然后10000rpm离心10分钟，取X60湿菌体与菌体保藏液(菌体保藏液含0.01mol/L磷酸盐缓冲液0.001mol/L的Tween 40非离子型表面活性剂)，按质量体积比为1:50配成菌剂，菌剂成品活菌浓度为1×1010-1×1012CFU/ml；
(3)将嘧菌酯与解淀粉芽孢杆菌X60湿菌体混合，配制成含嘧菌酯浓度为300μg/ml，解淀粉芽孢杆菌X60的浓度范围为1×106CFU/ml。
实施例3
一种含嘧菌酯的杀菌剂组合物的制备方法。包括以下步骤：
(1)将质量浓度为95％嘧菌酯原药用甲醇配成1×104μg/ml的母液，4℃低温保存；
(2)将解淀粉芽孢杆菌X60(Bacillus amyloliquefaciens X60)在NB培养液(配制方法为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，加去离子水至1L，pH6.8-7.2，经120℃灭菌20分钟)，30℃180rpm振荡培养36-48小时，然后10000rpm离心10分钟，取X60湿菌体与菌体保藏液(菌体保藏液含0.01mol/L磷酸盐缓冲液0.001mol/L的Tween 40非离子型表面活性剂)，按质量体积比为1:50配成菌剂，菌剂成品活菌浓度为1×1010-1×1012CFU/ml；
(3)将嘧菌酯与解淀粉芽孢杆菌X60湿菌体混合，配制成含嘧菌酯浓度为100μg/ml，解淀粉芽孢杆菌X60的浓度范围为1×107CFU/ml。
试验例1：对烟草赤星病的抑制试验
赤星病的防治试验在大田中进行，待成熟期烟叶上开始零星出现烟草赤星病病斑时开始实验。生防菌处理组Ⅰ，将上述生防菌液均匀喷雾至烟苗叶片表面，直至流失；嘧菌酯处理组Ⅱ，200μg/ml的嘧菌酯喷雾，直至流失；实施例1处理组Ⅲ-1(20μg/ml的嘧菌酯与1×1010CFU/ml解淀粉芽孢杆菌混合物)、实施例2处理组Ⅲ-2(300μg/ml的嘧菌酯与1×106CFU/ml解淀粉芽孢杆菌混合物)、实施例3处理组Ⅲ-3(100μg/ml的嘧菌酯与1×107CFU/ml解淀粉芽孢杆菌混合物)喷雾，直至流失；菌核净对照处理组Ⅳ，40％菌核净可湿性粉剂1500倍液喷雾，直至流失；空白对照组Ⅴ，喷雾无菌水。每处理处理烟苗60株。烟叶于自然条件下发病。20天后观察记录叶片发病情况，并调查病情指数，计算防效。
按照以下的病情统计分级，根据叶片发病面积进行病情统计：
0级：全叶无病斑；
1级：病斑面积占叶片面积的1％以下；
3级：病斑面积占叶片面积的2％-5％；
5级：病斑面积占叶片面积的6％-10％；
7级：病斑面积占叶片面积的11％-20％；
9级：病斑面积占叶片面积的21％以上。
田间试验表明，嘧菌酯与解淀粉芽孢杆菌X60菌剂组合物组能够很好的预防烟草赤星病的发生。
表1嘧菌酯与解淀粉芽孢杆菌X60菌剂组合物施用20天后对烟草赤星病的防效
试验例2：对烟草白粉病的抑制试验
白粉病的防治试验在大田中进行，待旺长期烟叶上开始零星出现烟草白粉病病斑时开始实验。生防菌处理组Ⅰ，将上述生防菌液均匀喷雾至烟苗叶片表面，直至流失；嘧菌酯处理组Ⅱ，200μg/ml的嘧菌酯喷雾，直至流失；嘧菌酯与解淀粉芽孢杆菌组合物处理组Ⅲ，100μg/ml的嘧菌酯与1×1010CFU/ml解淀粉芽孢杆菌混合物喷雾，直至流失；多菌灵对照处理组Ⅳ，80％多菌灵可湿性粉剂1000倍稀释喷雾，直至流失；空白对照组Ⅴ，喷雾无菌水。每处理处理烟苗60株。烟叶于自然条件下发病。20天后观察记录叶片发病情况，并调查病情指数，计算防效。
按照以下的病情统计分级，根据叶片发病面积进行病情统计：
0级：全叶无病斑；
1级：病斑面积占叶片面积的1％以下；
3级：病斑面积占叶片面积的2％-5％；
5级：病斑面积占叶片面积的6％-10％；
7级：病斑面积占叶片面积的11％-20％；
9级：病斑面积占叶片面积的21％以上。
田间试验表明，嘧菌酯与解淀粉芽孢杆菌X60菌剂组合物组能够很好的预防烟草白粉病的发生，其防治效果达到91.09％
表2嘧菌酯与解淀粉芽孢杆菌X60菌剂组合物施用20天后对烟草白粉病的防效
试验例3：对烟草灰霉病的抑制试验
灰霉病菌孢子悬浮液的制备：将烟草灰霉病菌接种于PDA培养基平板，25℃黑暗条件下培养6d，然后将平板置于15℃黑暗条件下诱导分生孢子的形成，3d后用无菌纱布滤去菌丝得到分生孢子悬浮液。用血球计数板测定孢子悬浮液的浓度，并将孢子悬浮液浓度调至105个孢子/ml，备用。
在烤烟漂浮育苗盘中育苗(品种：红花大金元)，待烟苗长至5-6叶时备用。生防菌处理组Ⅰ，将上述生防菌液均匀喷雾至烟苗叶片表面，直至流失；嘧菌酯处理组Ⅱ，200μg/ml的嘧菌酯喷雾，直至流失；嘧菌酯与解淀粉芽孢杆菌组合物处理组Ⅲ，100μg/ml的嘧菌酯与1×1010CFU/ml解淀粉芽孢杆菌混合物喷雾，直至流失；多菌灵对照处理组Ⅳ，80％多菌灵可湿性粉剂1000倍稀释喷雾，直至流失；空白对照组Ⅴ，喷雾无菌水。处理24小时后，将上述烟草灰霉病菌孢子悬浮液均匀喷雾至叶片表面，每处理处理烟苗60株。接菌后将烟苗置于自然光照下，15-27℃，RH>80％培养。10天后观察记录叶片发病情况，并调查病情指数，计算防效。
按照以下的病情统计分级，根据叶片发病面积进行病情统计：
0级--全株无病；
1级--病斑面积占叶片面积的5％以下，或茎部病斑不超过茎围的1/3；
3级--病斑面积占叶片面积的6％-10％，或茎部病斑环绕茎围1/3-1/2；
5级--病斑面积占叶片面积的11％-20％，或茎部病斑超过茎围的1/2，但未全部环绕茎围；
7级--病斑面积占叶片面积的21％-40％，或茎部病斑全部环绕茎围；
9级--病斑面积占叶片面积的41％以上，或茎部病斑全部环绕茎围，植株凋萎甚至枯死；
漂浮育苗烟苗温室试验结果表明，嘧菌酯与解淀粉芽孢杆菌X60菌剂混合物处理组能够很好的预防烟草灰霉病的发生，其防治效果达到92.09％
表3嘧菌酯与解淀粉芽孢杆菌X60菌剂组合物施用10天后对烟草灰霉病的防效
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。