用于加速基因组编辑的单倍体诱导系的制作方法

相关申请的交叉参考本申请要求2015年6月30日提交的美国临时申请号62/186,913和2016年4月6日提交的美国临时申请号62/318,913的优先权。本文涉及使用含有靶向的核酸内切酶的单倍体诱导系以产生在植物中(inplanta)具有靶向的突变的加倍单倍体植物的方法。所述方法可用于例如，玉米，小麦，燕麦，大麦，黑小麦和使用单倍体诱导系的其他物种，以及拟南芥和可以使用转基因单倍体诱导物方法产生单倍体的其他物种。该方法可用于产生转基因或非转基因加倍单倍体植物。
背景技术：
：传统的植物育种策略已经开发了多年，以将期望的性状引入到植物物种中，例如高产量，抗病虫害，疾病和/或干旱，或适应特定的环境和生长条件。这类策略一般需要连续多轮的杂交，并且因此可能花费多年才能成功改变特定植物性状。随着转基因技术(也称为“分子育种”)的出现，通过引入转基因构建体或特定的核苷酸序列改变来通过基因组改变工程改造植物变得可能，从而为作物研究和改良提供了额外的工具。植物的遗传修饰可以通过向植物中加入一种或多种特定基因，或通过敲减基因表达(例如，用rnai)来实现，以产生所需的性状。由于大部分植物基因组没有被遗传修饰改变，因此可以较快地生产修饰的植物。为了通过添加基因来遗传修饰植物，例如，设计构建体以在植物中表达基因-通常包括感兴趣基因，驱动基因转录的启动子和终止基因转录的终止序列。携带感兴趣基因的构建体通常伴随有用于选择转化的植物的选择标记(例如，抗生素或除草剂抗性基因)。可以使用，例如农杆菌(agrobacterium)，粒子轰击或直接方法(例如显微注射)将构建体插入植物基因组中。在一些情况下，可以使用植物病毒将遗传构建体插入植物中。然而，转基因技术可能有缺点。例如，向基因组中插入转基因(如由粒子轰击介导)在很大程度上是随机的并且可能导致多次插入，这可能造成难以在分离期间追踪不同染色体上存在的多个转基因。此外，由于其染色体位置，转基因的表达可能是无法预测的，并且在一些情况中，转基因的表达是沉默的。另外，已经证明转基因植物的生产是非常有争议的话题，公众的观点通常是反对产生转基因变种，尤其是涉及的变种是将用作人类消耗的食物的作物植物时。基因组编辑是使用转基因的另一种方法。在这种方法中，可以引入转基因以在特定的dna序列处产生突变，然后从基因组中去除转基因。例如，核酸内切酶转基因可以在随机位置被插入到基因组中，并被表达以产生蛋白质或rna，其在基因组的第二位置处靶向并突变dna的特定序列。转基因插入位点很可能不与突变的基因座连锁。因此，通过植物的异交可以将转基因从基因组中去除，或者如果转基因在植物系中不是纯合的，则可以简单地通过选择不含转基因的后代来去除转基因。因此，可以生产在特定dna序列上具有突变且不含转基因的植物系。将突变引入作物品种(通常称为“原种系”)的传统方法可能是耗时且昂贵的。传统上，转基因修饰利用适合转化的系，但是这样的系通常不具有农学上的竞争性。因此，基因组工程改造的第一步通常是将核酸内切酶转基因转化入适合转化以产生所需突变的系。一旦该系发生了突变，其与农艺上竞争性的系(原种系)异交。突变的系和原种系之间的第一次杂交产生了“f1”植物，其中含有来自突变系的一半dna和来自原种系的一半dna。为了恢复具有所需突变的原种系的遗传背景，将f1植物与原种系(一种称为回交的过程)杂交以产生bc1f1植物。bc1f1含有来自原种系的大部分dna，只有部分dna来自突变系。回交过程重复两次，三次或更多次，直到恢复到足够百分比的原种系dna组成。用分子标记物进行选择可以确保在最终的回交步骤中携带所需的突变。每一轮回交和分子标记物选择都增加了过程的成本和时间。此外，如果希望突变位于超过一个原种系中，则必须重复回交过程以将所需的突变引入其他原种系。概述本文至少部分基于开发基因靶向的植物有效的方法，其在一代中产生不含转基因的突变的，加倍的单倍体植物。该方法利用含有一种或多种核酸内切酶的植物单倍体诱导物贮备系以将(a)通过杂交进行单倍体诱导的步骤与(b)由核酸内切酶工程改造的靶向的dna双链断裂的步骤合并，然后进行(c)染色体加倍步骤。具有单倍体诱导能力和核酸内切酶的植物可以同时诱导单倍体化和突变，因此被称为用于加速基因组编辑的单倍体诱导系(hilage)。这种基因靶向方法可以产生非转基因的、加倍的单倍体个体而不需要使用随后的回交过程，因此可能在植物生物学的许多领域具有显着的意义。例如，该技术可能会提高植物功能遗传学研究的速度。在一些情况下，本文提供的材料和方法可以用于产生对于外源核酸内切酶序列而言是非转基因的，但包含在目标位置处插入的转基因的植物。本文提供的方法也可以用于工程改造改良的植物性状，例如有商业价值的化合物的产量增加，改善的风味概况，谷物和/或生物质产量增加，营养品质提高，对生物和非生物胁迫的抗性和/或耐受性增加，农学性状改善，美学性状改善。本文提供的方法可以用于可以通过杂交产生单倍体个体的植物物种。利用携带核酸内切酶转基因的hilage系产生具有靶向的基因突变的加倍的单倍体个体的益处可包括，例如(i)在遗传背景下快速产生靶向的突变而不论背景的可转化性的能力；(ii)在植物中产生靶向的突变避免了缓慢且昂贵的整株植物转化，因为一旦转基因在hilage株系中则不需要进一步的整株植物转化；(iii)在得到的植物中保留极少或不存在hilage系的dna，使得不需要将突变及时和昂贵地回交到原种系中，并且没有由含有非原种遗传物的最初转化的系的残余dna引起的产量减阻；(iv)至少关于外源核酸内切酶序列，所得到的单倍体和加倍的单倍体植物的非转基因状态；和(v)通过向hilage贮备系添加更多核酸内切酶以便一次靶向超过一个基因的方法的易可放大性。除了每个系生成的突变数量的可放大性之外，该方法在每年可以突变的系的数量上也是高度可放大的。这些性质因此有助于成本有效和节省时间的方法，易于放大和广泛部署，并且可以容易地结合到当前的育种方法中。在本文中称为“hilage突变”或“hilage-mut”的一个方面，本文描述了用于产生在所选dna序列处或附近具有突变的加倍单倍体植物细胞的方法。在一些实施方式中，所述方法可以包括(a)用编码稀切核酸内切酶的核酸转化单倍体诱导系以产生其中稳定整合了所述核酸的hilage贮存系，其中编码稀切核酸内切酶的核酸与受精后的至少第一次和第二次细胞分裂期间在植物胚中表达的启动子操作性地连接，并且其中稀切核酸内切酶靶向选择的dna序列；(b)将hilage贮存系与靶向系杂交以产生含有该稳定整合的核酸的f1合子；(c)培养所述f1合子，使得(i)所述稀切核酸内切酶被表达并且在所选择的dna序列处或附近切割染色体dna，其中切割后染色体dna的修复导致所述突变，和(ii)发生基因组消除使来自hilage贮存系的染色体被消除，产生单倍体细胞；和(d)诱导单倍体细胞中的染色体加倍以产生含有突变的加倍的单倍体植物细胞。植物细胞可来自玉米，小麦，大麦，黑小麦，拟南芥，燕麦，青椒，番茄，马铃薯，大豆或荠蓝。所述稀切核酸内切酶可以是转录激活物样效应物(tale)核酸内切酶，crispr/cas基核酸酶，锌指核酸酶(zfn)或大范围核酸酶。启动子可以是花椰菜花叶病毒加倍增强35s启动子，玉米zmub1启动子，或水稻apx，oscc1，eif5，r1g1b，pgd1，act1或scp1启动子。修复可包括同源重组。该突变可包括一个或多个核苷酸取代，添加或缺失，和/或插入转基因dna序列。在一些实施方式中，用于产生在选定的dna序列处或附近具有突变的加倍单倍体植物细胞的hilage-mut方法可以包括(a)用编码稀切核酸内切酶的核酸转化植物细胞系以产生具有稳定整合其中的核酸的转基因植物细胞系，其中编码所述稀切核酸内切酶的核酸与受精后至少第一次和第二次细胞分裂期间在植物胚中表达的启动子操作性地连接，并且其中所述稀切核酸内切酶靶向选择的dna序列；(b)将所述转基因植物细胞系与单倍体诱导系杂交以产生对于编码所述稀切核酸内切酶的核酸纯合并且能够在杂交时诱导单倍体的hilage贮存系；(c)将hilage贮存系与靶向系杂交以产生含有该稳定整合的核酸的f1合子；(d)培养f1合子，使得(i)稀切核酸内切酶被表达，并在选定的dna序列处或附近切割染色体dna，其中切割后染色体dna的修复导致所述突变，和(ii)发生基因组消除使来自hilage贮存系的染色体被消除，产生单倍体细胞；和(e)在单倍体细胞中诱导染色体加倍以产生含有突变的加倍的单倍体植物细胞。植物细胞可来自玉米，小麦，大麦，黑小麦，拟南芥，燕麦，青椒，番茄，马铃薯，大豆或荠蓝。稀切核酸内切酶可以是tale核酸内切酶，crispr/cas基核酸酶，zfn或大范围核酸酶。启动子可以是花椰菜花叶病毒加倍增强35s启动子，玉米zmub1启动子，或水稻apx，oscc1，eif5，r1g1b，pgd1，act1或scp1启动子。修复可包括同源重组。该突变可包括一个或多个核苷酸取代，添加或缺失，和/或插入转基因dna序列。在一些实施方式中，用于产生在所选dna序列处或附近具有突变的加倍单倍体植物细胞的hilage-mut方法可包括(a)将hilage贮存系与靶向系杂交以产生含有稳定整合的核酸的f1合子，其中所述单倍体诱导系包含稳定整合的编码稀切核酸内切酶的核酸，其中编码所述稀切核酸内切酶的核酸与受精后至少第一和第二细胞分裂期间在植物胚中表达的启动子操作性地连接，并且其中所述稀切核酸内切酶靶向所选的dna序列；(b)培养f1合子，使得(i)稀切核酸内切酶被表达，并在选定的dna序列处或附近切割染色体dna，其中切割后染色体dna的修复导致所述突变，和(ii)发生基因组消除使来自hilage贮存系的染色体被消除，产生单倍体细胞；和(c)在单倍体细胞中诱导染色体加倍以产生含有突变的加倍的单倍体植物细胞。植物细胞可来自玉米，小麦，大麦，黑小麦，拟南芥，燕麦，青椒，番茄，马铃薯，大豆或荠蓝。稀切核酸内切酶可以是tale核酸内切酶，crispr/cas基核酸酶，zfn或大范围核酸酶。启动子可以是花椰菜花叶病毒加倍增强35s启动子，玉米zmub1启动子，或水稻apx，oscc1，eif5，r1g1b，pgd1，act1或scp1启动子。修复可包括同源重组。该突变可包括一个或多个核苷酸取代，添加或缺失，和/或插入转基因dna序列。在本文中称为“hilage-同源充足”或“hilage-hr”的另一个方面，本文描述了用于产生在所选dna序列处或附近具有插入的转基因dna序列的加倍单倍体植物细胞的方法。在一些实施方式中，所述方法可以包括(a)用以下转化单倍体诱导系：(i)第一转基因dna序列，所述第一转基因dna序列在两侧侧接与所选dna序列的上游和下游序列同源的dna序列，和(ii)编码稀切核酸内切酶的第二转基因序列，以产生具有稳定整合于其中的第一和第二转基因dna序列的hilage贮存系，其中编码稀切核酸内切酶的转基因dna序列与受精后至少第一和第二次细胞分裂期间在植物胚中表达的启动子操作性地连接，并且其中所述稀切核酸内切酶靶向所选择的dna序列；(b)将hilage贮存系与靶向系杂交以产生含有稳定整合的转基因的f1合子；(c)培养f1合子，使得(i)稀切核酸内切酶被表达，并在选择的dna序列处或附近切割靶向系的染色体dna，并将第一转基因dna序列插入切割位点，和(ii)发生基因组消除，使得来自hilage贮存系的染色体被消除，产生单倍体细胞；和(d)在单倍体细胞中诱导染色体加倍以产生含有第一转基因dna序列的加倍的单倍体植物细胞。植物细胞可来自玉米，小麦，大麦，黑小麦，拟南芥，燕麦，青椒，番茄，马铃薯，大豆或荠蓝。稀切核酸内切酶可以是tale核酸内切酶，crispr/cas基核酸酶，zfn或大范围核酸酶。启动子可以是花椰菜花叶病毒加倍增强35s启动子，玉米zmub1启动子，或水稻apx，oscc1，eif5，r1g1b，pgd1，act1或scp1启动子。在一些实施方式中，用于产生具有在选定的dna序列处或附近插入的第一转基因dna序列的加倍单倍体植物细胞的hilage-hr方法可包括(a)用以下转化植物细胞系：(i)第一转基因dna序列，在两侧侧接与所选dna序列的上游和下游序列同源的dna序列，和(ii)编码稀切核酸内切酶的第二转基因dna序列，以产生具有稳定整合于其中的第一和第二转基因dna序列的转基因植物细胞系，其中编码所述稀切核酸内切酶的转基因dna序列与受精后至少第一次和第二次细胞分裂期间在植物胚中表达的启动子操作性地连接，并且其中所述稀切核酸内切酶被靶向到选定的dna序列；(b)使所述转基因植物细胞系与单倍体诱导系杂交以产生对于所述第一和第二转基因dna序列纯合并且可以在杂交时诱导单倍体的hilage贮存系；(c)将hilage贮存系与靶向系杂交以产生含有稳定整合的转基因dna序列的f1合子；(d)培养f1合子，使得(i)稀切核酸内切酶被表达并切割所选dna序列处或附近的靶标系的染色体dna，并将第一转基因dna序列插入切割位点；以及(ii)发生基因组消除，从而消除来自hilage贮存系的染色体；和(e)诱导单倍体细胞中的染色体加倍以产生含有第一转基因dna序列的加倍的单倍体植物细胞。植物细胞可来自玉米，小麦，大麦，黑小麦，拟南芥，燕麦，青椒，番茄，马铃薯，大豆或荠蓝。稀切核酸内切酶可以是tale核酸内切酶，crispr/cas基核酸酶，zfn或大范围核酸酶。启动子可以是花椰菜花叶病毒加倍增强35s启动子，玉米zmub1启动子，或水稻apx，oscc1，eif5，r1g1b，pgd1，act1或scp1启动子。在一些实施方式中，用于产生具有在选定的dna序列处或附近插入的转基因dna序列的加倍单倍体植物细胞的hilage-hr方法可包括(a)使hilage贮存系与靶向系杂交以产生含有稳定整合的转基因dna序列的f1合子，其中所述hilage贮存系包括(i)稳定整合的第一转基因dna序列，其两侧侧接与所选dna序列上游和下游序列同源的dna序列，和(ii)稳定整合的第二转基因dna序列，其编码稀切核酸内切酶，其中编码该稀切核酸内切酶的转基因dna序列与受精后至少第一和第二细胞分裂期间在植物胚中表达的启动子操作性地连接，并且其中稀切核酸内切酶靶向选择的dna序列；(b)培养f1合子，使得(i)稀切核酸内切酶被表达并切割所选dna序列处或附近的靶向系的染色体dna，并将第一转基因dna序列插入切割位点，以及(ii)发生基因组消除，从而消除来自hilage贮存系的染色体；和(c)在单倍体细胞中诱导染色体加倍以产生含有第一转基因dna序列的加倍的单倍体植物细胞。植物细胞可来自玉米，小麦，大麦，黑小麦，拟南芥，燕麦，青椒，番茄，马铃薯，大豆或荠蓝。稀切核酸内切酶可以是tale核酸内切酶，crispr/cas基核酸酶，zfn或大范围核酸酶。启动子可以是花椰菜花叶病毒加倍增强35s启动子，玉米zmub1启动子，或水稻apx，oscc1，eif5，r1g1b，pgd1，act1或scp1启动子。除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语的意义与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同。虽然与本文所述类似或等同的方法和材料可用来实施本发明，但在下文描述合适的方法和材料。本文中述及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用全文纳入本文。在抵触的情况下，以本说明书(包括定义在内)为准。此外，材料、方法和实施例都仅是说明性的，并不意在构成限制。在附图和以下描述中详细说明了本发明的一种或多种实施方式。本发明的其他特征、目的和优势通过描述、附图以及权利要求书将是显而易见的。附图说明图1是描述用于产生含有靶向突变的加倍单倍体植物细胞的方法中的步骤的图。图2a是描述用于产生含有核酸内切酶转基因和由核酸内切酶工程改造的突变的hilage贮存系的方法中的步骤的图。图2b是描绘使用图2a的hilage贮存系以产生加倍单倍体原种系的方法的步骤的图，所述原种系对于由核酸内切酶工程改造的突变是纯合的并且不包括核酸内切酶转基因。该图中的单倍体诱导系被描述为杂交中的母本。然而，对于某些物种的单倍体诱导，单倍体诱导系被用作杂交中的父本。图3是描绘通过将hilage贮存系与靶向系杂交来将转基因插入到靶向系的基因组中的程序中的步骤的图。(1)显示了核酸内切酶靶位点和待插入的转基因。hilage系dna链的两侧为浅灰色尖端，而靶向系dna链的两侧为黑色尖端。hilage贮存系既包含在所选位置的靶向系dna中产生双链断裂的核酸内切酶转基因(“转基因a”)，又包含待在双链断裂的位置处插入靶向系的转基因(“转基因b”)。转基因每侧都侧接与核酸内切酶靶位点周围的染色体序列相同的序列。相同的序列由两条浅灰线表示。在(2)中，靶向系的染色体中的双链断裂(dsb)由hilage贮存系的核酸内切酶(“转基因a”)产生。在(3)中，靶向系使用hilage系的染色体作为模板链进行同源重组(hr)修复。由hilage系提供的染色体模板携带待插入的转基因b。使用hr将转基因b有效地整合到靶向系的染色体中。在(4)中，hilage系的染色体丢失，产生具有与靶向系相匹配的遗传学的单倍体植物，在特定位置插入转基因b。单倍体植物可经染色体加倍以产生加倍的单倍体系。图4是代表性的gmcas9核苷酸序列(seqidno：1；4140nt，包括针对gmcas9优化的终止密码子)。图5是由seqidno：1编码的gmcas9核酸酶(1379aa)的全长氨基酸序列(seqidno：2)。该序列包括用于拟南芥的在c-末端的11个氨基酸修饰的核定位信号(nls；seqidno：4，由seqidno：3编码)。图6是合成的引导rna(grna)盒的核苷酸序列(seqidno：5)。小写字母表示并入的克隆位点，包括保护性碱基对。来自u6启动子的转录起始位点显示为粗体和带下划线的鸟嘌呤碱基(即g)(这也被称为grna的第一个碱基)。带下划线的字母是用于扩增完整盒的引物序列位点。详述在一些实施方式中，本文提供了用于基因靶向的有效植物方法，其在一代中可以产生不含转基因的突变的，加倍的单倍体植物。在一些实施方式中，所述方法包括使用编码一种或多种靶向的核酸内切酶的植物hilage贮存系以将单倍体诱导(通过杂交)与由核酸内切酶工程改造的靶向的dna双链断裂组合。这样的方法可用于将一个或多个突变(例如，一个或多个核苷酸碱基的取代，缺失或插入)引入靶向的植物系中，然后可以使用染色体消除和随后的加倍过程来产生加倍的单倍体植物。本文提供的方法可用于产生非转基因的(至少就外源核酸内切酶序列而言)，加倍的单倍体个体而不使用随后回交过程。单倍体植物含有通常基因组含量的一半。大多数(但不是全部)农作物植物是二倍体的，因为它们具有两套完整的染色体，每个亲本一套。为了本公开的目的，可以假设感兴趣的物种是二倍体的，但是也应该注意，本文所述的方法和材料可以应用于具有超过两套染色体的多倍体物种。产生单倍体植物的一种方法涉及使母本与单倍体诱导父本杂交，这导致具有母系遗传染色体的单倍体胚。或者，父系单倍体植物可通过将父本与单倍体诱导母本进行杂交而产生，其导致具有父系遗传染色体的单倍体胚。单倍体胚和随后的植物通常比二倍体植物的尺寸更小，并且通常可以容易地通过视觉识别。单倍体植物可以长到成熟，但通常是不育的。通过暴露于秋水仙碱，一氧化二氮气体，热或氟乐灵等试剂，使来自单倍体组织的染色体加倍，可以从单倍体植物产生纯合的二倍体植物。参见例如wan等，theorapplgenet，77：889-892，1989；和美国公开号2003/0005479，其全部内容通过引用并入本文。染色体加倍可以产生完全纯合的二倍体植物，称为加倍单倍体。加倍的单倍体植物可以是可育的，并且可以如正常二倍体植物那样表现。可以将单倍体细胞和染色体加倍与靶向核酸内切酶组合使用，以产生具有在一个或多个选定位置上工程改造的突变的植物。图1中描绘了一种这样的方法。在该方法中，单倍体花粉用编码核酸内切酶的转基因转化，所述核酸内切酶被靶向以在选定位点切割花粉染色体dna。核酸内切酶在花粉中表达，导致在核酸内切酶靶向的位点发生染色体断裂，从而产生新生突变。通过化学或自发性单倍体加倍，细胞变成加倍的单倍体。虽然这样的方法导致在靶位点上的纯合突变，但是它们也导致纯合的转基因，其必须通过异交或回交来去除。此外，需要异交和回交，或另外的转化，然后通过异交去除转基因，以使原种系中的等位基因渗入。相反，本文提供的方法利用单倍体诱导物，核酸内切酶和染色体加倍技术来高效产生在一个或多个基因座处含有突变且不含来自hilage贮存系的dna的纯合非转基因(至少对于外源核酸内切酶序列)植物。携带编码一种或多种核酸内切酶的一个或多个转基因的hilage贮存系与需要一种或多种靶向基因突变的一种或多种系(本文称为“靶向系”)杂交。在一些实施方式中，靶向系是原种系。hilage贮存系的染色体通过单倍体诱导过程被消除，导致仅含有来自靶向系的dna的单倍体系。在hilage贮存系的染色体被消除之前，由hilage贮存系中的转基因编码的核酸内切酶在靶向系的染色体中的目标位置引起突变。由染色体消除产生的植物是单倍体，并且除了期望的靶向突变之外，具有靶向系的精确遗传组成。可以将该单倍体植物进行染色体加倍以产生不含外源核酸内切酶转基因的完全近交系，具有靶向系的遗传学和所需的突变。不需要回交来将靶向的突变渗入到靶向系中，并且不需要回交来去除来自hilage贮存系的核酸内切酶转基因或dna。在一些实施方式中，本文公开的基于hilage的方法可以使操作人员能够通过使用从转基因表达的核酸内切酶在靶基因座处产生染色体断裂，同时产生不含核酸内切酶转基因或hilage贮存系dna来实现高频率基因靶向。为了产生hilage贮存系，一种或多种核酸内切酶转基因可以直接转化到单倍体诱导系中。或者，可以首先将一种或多种核酸内切酶转基因转化到适于转化的系中，然后回交到单倍体诱导贮存系中。在图2a中描绘了用于生成hilage贮存系的示例性方法。如所示，单倍体诱导系可以用编码核酸内切酶的转基因转化，然后整合入单倍体诱导系的基因组。来自转基因的核酸内切酶蛋白的表达导致单倍体诱导物基因组中靶向dna切割和新生染色体突变。然后使用自花授粉产生对转基因(以及对于新生突变)纯合的hilage贮存系。然后，可以将hilage贮存系与其中需要一个或多个靶向基因突变的一个或多个系(在此称为“靶向系”)杂交。该方法的一个示例如图2b所示。两个系之间的杂交导致f1胚，其中一些将通过丢失hilage贮存系的染色体而变成单倍体。然而，在hilage贮存系染色体从胚中消除之前的短暂时间内，hilage贮存系的核酸内切酶转基因可以被表达，并且可以在靶向系的染色体中产生靶向断裂，从而导致靶向系dna中的靶向的新生突变。在随后的染色体消除之后，由此产生的单倍体植物可以被染色体加倍以恢复二倍体染色体数量。所得到的系(i)是二倍体，(ii)是非转基因的(至少对于核酸内切酶序列)，(iii)含有一个或多个纯合的靶向突变，(iv)不含有来自另一个系的dna，和(v)准备在一代中进行田间试验。单倍体诱导系一般由特定物种内或物种间杂交鉴定，这可能对于子代导致一定百分比的单倍体个体。例如，在某些物种(例如，玉米)中，可以使用物种间杂交进行单倍体诱导。当用于杂交时，一些玉米系倾向于产生一小部分的单倍体后代。一些物种需要物种内杂交或“宽”杂交以产生单倍体。例如，(i)小麦和玉米，(ii)大麦和玉米，和(iii)燕麦和玉米之间的杂交分别导致消除玉米染色体和产生小麦，大麦和燕麦单倍体。对于着丝粒组蛋白cenh3基因的某些转基因修饰也已被证明是开发单倍体诱导系的手段。这些系也基于有性杂交诱导单倍体化。理论上，任何基于有性杂交后基因组消除产生单倍体的单倍体诱导系可以通过添加编码靶向修饰的核酸内切酶转基因发育成hilage原种。此外，如别处(ravi和chan，nature464(7288)：615-618，2010)所述开发的转基因单倍体诱导技术涉及使用转基因修饰的拟南芥植物通过杂交产生单倍体。产生靶向染色体断裂的核酸内切酶可以是稀切核酸内切酶，例如锌指核酸酶(zfn)，转录激活物样效应物(tale)核酸酶，大范围核酸酶或基于crispr/cas系统的核酸内切酶，如下面进一步描述。编码核酸内切酶的转基因可以操作性地连接到组成型，细胞特异性，诱导型或通过自杀外显子的选择性剪接而激活的启动子，前提是启动子在染色体消除之前被激活。合适的启动子包括但不限于，花椰菜花叶病毒加倍增强35s(camvd35s)启动子，天然拟南芥60s核糖体蛋白启动子，和天然拟南芥扩展蛋白样启动子。通常，可在本文提供的核酸内切酶构建体中使用的启动子是在前几次细胞分裂中的至少一次(例如，至少第一或第二次细胞分裂，第一和第二细胞次分裂，第一至第三次细胞分裂，或第一至第四次细胞分裂)期间在植物胚中驱动表达的启动子。在一些情况下，可以在本文提供的核酸内切酶构建体中使用的启动子是这样的启动子，其驱动编码的核酸内切酶的表达，使得核酸内切酶在受精后在靶向系的染色体中存在的靶位点上有活性。如本文所用，术语“转基因”或“转基因dna序列”意在不仅包括编码多肽的序列(例如，来自外源物种的多肽，如本文所述的核酸内切酶转基因)，还包括调控序列，例如启动子序列，顺式基因(来自相同物种的不同系的遗传物质，其可被插入以例如针对天然启动子切换不同天然启动子，或添加一个或多个额外拷贝的天然基因)，和实际上，任何通常在它所插入的位置找不到的dna序列。在一些实施方式中，取决于是否需要hr或nhej，可将另外的转基因添加至核酸内切酶构建体以限制靶向系进行同源重组(hr)或非同源末端连接(nhej)的能力。此类转基因的示例包括rnai转基因，其可用于降低特定基因的表达，以促进有利于hr或nhej的植物染色体双链断裂(dsb)修复机制(参见gallego等，plantj.35：557-565，2003；nishizawa-yokoi等，newphytologist196(4)：1048-1059，20012；和qi等，genomeres.23：547-554，2013)。例如，降低ku基因同系物(例如，水稻和拟南芥ku70和ku80基因)，lig4，和/或rad50的表达可以提高hr的速率。参见，例如，jia等，j.botany2012，id9892722012；qi等，同上；tanaka等，biochem.biophys.res.commun.396：289-293，2010；nishizawa-yokoi等，同上；和gherbi等，emborep.2：287-291，2001)。另外，某些转基因可以增加hr，包括大肠杆菌reca和ruvc基因，酵母rad54，和稻exo1的同系物(参见，例如，reiss等，proc.natl.acad.sci.usa97：3358-3363，2000；shalev等，proc.natl.acad.sci.usa96：7398-7402，1999；以及osakabe和toki，voytas，ann.rev.plantbiol.64：327-350，2013中未公开的结果)。这样的转基因的表达可以由强启动子驱动，例如，但不限于35s(camvd35s)或其衍生物(例如，双35s)，zmub1(玉米)，apx(稻)，oscc1(稻)，eif5(稻)，r1g1b(稻)，pgd1(稻)，act1(稻)和scp1(稻)。替代地或除了rnai转基因之外，hilage贮存系可以在上述基因中携带突变以促进hr或nhej。在一些hilage-hr实施方式中，编码核酸内切酶的转基因构建体，或待以转基因构建体合并到相同植物系的第二构建体可以含有一个或多个拷贝的与靶位点处或侧接靶位点的dna同源的dna序列。该dna序列可以含有核苷酸变化，如一个或多个碱基对取代，缺失和/或添加。或者，该序列可含有基因，启动子，调控序列和/或转基因。在一些情况下，hilage系可以在核酸内切酶靶向的一个或多个序列处具有突变。突变的存在可增加在所得单倍体个体中产生突变的可能性。如果在靶向系中出现染色体断裂，并且使用hilage贮存系染色体作为模板通过hr修复断裂的染色体，那么dsb可以用存在于hilage贮存系中的突变进行“修复”。在一些hilage-hr实施方式中，hilage系可以在由核酸内切酶靶向的一个或多个序列处具有第二转基因dna序列，使得由于表达来自hilage贮存系的核酸内切酶而产生的dsb可以通过整合第二转基因dna序列进行修复。参见，例如，图3。此外，在一些hilage-hr实施方式中，dsb可以通过使用hilage基因型基因座作为模板的hr或者通过使用在hilage贮存系中含有特定核苷酸变化的转基因序列作为模板来修复，从而导致突变。在一些实施方式中，两个或更多个(例如，2，3，4或超过4个)不同的或相同的核酸内切酶和/或crispr引导rna可位于hilage贮存系的分开的染色体上。将两种或更多种核酸内切酶和/或crispr引导rna定位在分开的染色体上可以增加一种或多种核酸内切酶在植物中保留更长时间的可能性，特别是对于染色体随着时间丢失的植物(例如燕麦)。核酸内切酶在丢失之前持续存在的时间越长，核酸内切酶在靶位点处将有效产生双链断裂的机会就越大。在一些情况下，可靶向多个基因座用于突变。在不同的加倍单倍体后代中，可能只有一个或几个，但不是全部的多个目标位点会发生突变。衍生自相同靶向系的加倍单倍体后代可以一起杂交以组合靶向的突变。由于加倍的单倍体个体仅在目标基因座处的突变不同，所以可以组合突变而不需要在其余的基因组上选择。例如，如果在三个靶基因座(基因座a，基因座b和基因座c)处需要突变，但是仅回收在基因座a和b(a/a，b/b，c/c)以及基因座a和c(a/a，b/b，c/c)处具有突变的加倍单倍体后代，在基因座a和b(a/a，b/b，c/c)上具有突变的个体可以与在基因座a和c(a/a，b/b，c/c)上具有突变的个体杂交以产生在所有基因座都具有突变的个体(a/a，b/b，c/c)。对f1个体(a/a，b/b，c/c)进行自花授粉并筛选f2后代可以导致回收在所有三个基因座处都有突变的所需个体(a/a，b/b，c/c)。在一些实施方式中，可以在f1植物和hilage贮存系之间进行杂交(而不是通过将纯合亲本系与单倍体诱导贮存系杂交)。在这样的实施方式中，所产生的加倍单倍体后代的遗传学和靶向突变的存在或不存在是不同的。可能产生不同的突变，并且需要评估每个突变事件以确定所获得的突变是否具有期望的结果。产生所需表型的突变，例如引起移码并消除适当基因功能的突变，在本文中被称为“有效突变”(em)。在某些情况下，只有具有em的系才会前进。在一些实施方式中，基于hilage的方法用于将新的突变添加到已经具有一个或多个em的系上。这种方法也可以用来将两个或多个em组合成单一系。在一些实施方式中，具有不同hilage诱导的突变和不同遗传背景的系被一起杂交以组合em。产生的子代可以针对em和它们的遗传背景分离。在一些实施方式中，通过hr，基于hilage的方法可以产生与hilage诱导系具有相同突变的后代。在一些hilage-hr实施方式中，核酸内切酶构建体可以与待插入靶向系的核酸内切酶靶位点中的转基因或数量性状基因座(qtl)配对。核酸内切酶构建体和待插入的转基因可以在hilage系中的相同构建体中或在相同的hilage系中的不同构建体中。待插入到靶向系基因组中的转基因可以在每一侧与靶向系中核酸内切酶靶位点侧接的dna序列同源的dna序列(图3)侧接。这样的实施方式可用于转基因位于单倍体诱导基因组的“位置b”处的情况，但希望将转基因移至非单倍体诱导物的dna中的“位置a”。在一些实施方式中，这样的方法可用于在原种栽培种中的特定dna序列处插入转基因，而不必进行回交以从原种系中去除非原种系染色体物质。在一些实施方式中，可以将核酸内切酶设计成在转基因已经定位于基因组中之后靶向与待插入靶标系的转基因侧接的序列相同的基因组序列。在目标位点产生dsb之后，植物细胞可以经过hr以修复dsb。hilage系可提供dna模板-转基因，所述转基因侧接与靶位点侧接的内源dna序列同源的dna序列。当使用含有转基因的hilage系链修复靶向系的染色体断裂时，转基因在dsb处被有效插入靶向系的染色体。可根据本文提供的方法进行突变和/或遗传修饰然后双倍体化的植物可以是单子叶植物(例如，玉米，大麦，小麦，黑小麦，或燕麦)或双子叶植物(例如，拟南芥，马铃薯，番茄，大豆，青椒，或荠蓝)，如下面进一步描述。合适的单倍体诱导系可以从，例如，玉米，大麦，小麦，黑小麦，燕麦，高粱，马铃薯，类蜀黍和画眉草产生。可以容易地获得天然存在的玉米单倍体诱导系，因为它们在学术界和工业中使用。在一些实施方式中，本文提供的方法中使用的单倍体诱导系可以是玉米以外的物种。在一些情况下，可以如本文所述使用含有b染色体的单倍体诱导系，而在其他情况下，可以使用缺少b染色体的单倍体诱导系，如本文所述。大麦单倍体可以通过将栽培常规大麦(hordeumvulgare)与其野生祖先物种(hordeumbulbosum)杂交而产生。正在发育的大麦胚芽可以在组织培养(一种称为胚芽拯救的过程)中生长以生成完整植物。小麦，黑小麦和燕麦单倍体可以通过用来自相关物种，例如但不限于，玉米，高粱，大麦(球茎大麦(hbulbulosum)，和粟)的花粉对去雄小麦和黑小麦穗以及燕麦圆锥花序授粉来产生。与大麦一样，小麦，黑小麦和燕麦发育中的胚芽必须通过胚芽拯救来生成完整植物。使用转基因单倍体诱导系(ravi和chan，同上)，也可以在拟南芥中产生单倍体植物，并且可能在其他物种中产生单倍体植物。马铃薯中的单倍体可以通过将常规四倍体与二倍体马铃薯phureja克隆杂交来产生(peloquin，hougas和gabert，amjpotato37：289-297，1960；以及hermsen和verdenius，euphytica22(2)：244-259，1973)。表1总结了可以产生单倍体诱导系的几类杂交，包括上面讨论的那些：表1*可能如本文所用，“植物”和“植物部分”指保留亲本植物的区别特征的细胞、组织、器官、种子和切断的部分(如根、叶和花)。“种子”指在开花时的正常成熟时间点之后由植物胚珠的连续分化形成的任何植物结构，不考虑其在受精还是未受精的情况下形成，也不考虑种子结构是可育的还是不可育的。术语“等位基因”指特定基因座处基因的一种或多种可选形式中的任一种。在生物体的二倍体(或双二倍体)细胞中，给定基因的等位基因位于染色体上的特定位置或基因座。一个等位基因存在于同源染色体对的各条染色体上。“杂合”等位基因是位于特定基因座的两个不同的等位基因，其单独地位于相应同源染色体对上。“纯合”等位基因是位于特定基因座的两个相同的等位基因，其单独地位于细胞中相应同源染色体对上。“野生型”在本文中指植物或基因在自然中最常见的典型形式。“突变体”是指与野生型序列相比在其核酸序列中包含一个或多个变化(例如，核苷酸取代，缺失或添加)的植物或基因。在一些实施方式中，突变可导致植物或体内植物细胞中不可检测到量的功能性蛋白质，或可指所产生的蛋白质中的一个或多个氨基酸变化。在一些实施方式中，突变可以包括插入的转基因。“诱变”在本文中指将突变导入所选dna序列的过程。核酸内切酶诱导的突变通常获自双链断裂，其可引起插入或缺失(插入缺失标记“indel”)，可由测序分析检测。此类突变通常为数个碱基对的缺失，并且具有失活突变等位基因的效果。本文所用术语“稀切核酸内切酶”指天然或工程改造的蛋白，其针对含有长度为约12-40bp(如长度为14-40或15-30bp)的识别序列(目标序列)的核酸序列具有核酸内切酶活性。典型的稀切核酸内切酶在其识别位点内部产生切割，形成具有3′oh或5’oh突出端的4nt交错切口。这些稀有切割核酸内切酶可以是大范围核酸酶，如野生型寻靶核酸内切酶或其变体蛋白质，更具体地属于十二肽家族(laglidadg(seqidno：48)；参见wo2004/067736)或可以是来自关联dna结合结构域与具有切割活性的催化结构域的融合蛋白。tal效应物核酸内切酶和锌指核酸酶(zfn)是dna结合结构域与核酸内切酶foki的催化结构域融合的示例。自定义的tal效应物核酸内切酶可以商品名talentm(法国巴黎的赛勒柯蒂斯公司(cellectis))购得。关于稀切核酸内切酶的综述，参见baker，naturemethods9：23-26，2012。例如，在一些实施方式中，诱变可以通过双链dna断裂发生，所述双链dna断裂由靶向植物细胞中选定的dna序列的tal效应子核酸内切酶产生。这类诱变导致“tal效应物核酸内切酶诱导的突变”(例如，tal效应物核酸内切酶诱导的敲除)并降低靶基因的表达。可如他处所述进行用于选择内源性目标序列和生成靶向这类序列的tal效应物核酸内切酶的方法。参见例如，pct公开号wo2011/072246(其通过引用全文纳入本文)。tal效应子发现于黄单胞菌属(xanthomonas)中的植物病原性细菌中。这些蛋白质通过结合宿主dna并激活效应器特异性宿主基因在疾病或触发防卫方面起重要作用(参见例如，gu等，nature435：1122-1125，2005；yang等，proc.natl.acad.sci.usa103：10503-10508，2006；kay等，science318：648-651，2007；sugio等，proc.natl.acad.sci.usa104：10720-10725，2007；和等，science318：645-648，2007)。特异性取决于效应物-可变不完善数目(effector-variablenumberofimperfect)，通常是34个氨基酸重复(schornack等，j.plantphysiol.163：256-272，2006；和wo201i/072246)。多态性主要发生在重复位置12和13，本文将其称为重复可变双残基(rvd)。tal效应物的rvd以直接、线性形式对应于其靶位点的核苷酸，一种rvd对应于一种核苷酸，有一些简并性且没有明显的环境依赖性。该蛋白质-dna识别机制能针对新的靶标特异性tal效应物进行靶位点预测，以及靶位点选择和对与所选位点具有结合特异性的新tal效应物进行工程改造。tal效应物dna结合结构域可与其他序列(如核酸内切酶序列)融合，生成靶向特定、经选择的dna序列的嵌合核酸内切酶并导致在被靶向的序列处或附近的后续dna切割。dna中的这类切割(即双链断裂)可通过例如nhej或hr在野生型dna序列中诱导突变。在一些情况下，tal效应物核酸内切酶可用于促进复杂基因组中的定点诱变，高度准确且高效地敲除或改变基因功能。可使用一些核酸内切酶(如foki)以二聚物形式起作用的现象来提高tal效应物核酸内切酶的靶标特异性。例如，在一些情况中，可采用靶向至不同的dna序列的一对tal效应物核酸内切酶单体。当两个tal效应物核酸内切酶识别位点紧邻时，无活性的单体可聚集在一起以生成切割dna的功能性酶。通过需要dna结合来激活核酸酶，可产生高度位点特异性的限制性酶。在一些实施方式中，稀切核酸内切酶可以是crispr/cas基核酸酶。在其天然背景下，crispr/cas系统为细菌和古细菌提供对侵入外来核酸的免疫性(jinek等，science337：816-821，2012)。crispr/cas系统在功能上类似于真核rna干扰，使用rna碱基配对来引导dna或rna切割。该过程依赖于(a)与侵入核酸携带的序列碱基配对的小rna，和(b)特异性的一类cas核酸内切酶，其切割与小rna互补的核酸。可以重新编程crispr/cas系统以在高等真核基因组(包括动物和植物细胞)中产生靶向的双链dna断裂(mali等，science339：823-826，2013；和li等，naturebiotechnology31(8)：688-691，2013)。此外，通过修饰引起dna切割的cas蛋白中的特定氨基酸，crispr/cas系统可以作为dna切口酶(jinek等，同上)，或作为不具有核酸酶或切口酶活性，但能够干扰进入的蛋白质，包括rna聚合酶的dna结合蛋白(qi等，cell152：1173-1183，2013)。引导dnadsb，单链缺口或者将cas9蛋白质结合到特定序列需要crisprrna(crrna)以及示踪rna(tracrrna)序列，其协助引导cas9/rna复合物靶向dna序列(makarova等，natrevmicrobiol，9(6)：467-477，2011)。对于单一靶向rna的修饰可足以改变cas蛋白的核苷酸靶标。在某些情况下，无论是作为核酸酶，切口酶还是dna结合蛋白，crrna和tracrrna都可以作为单独的cr/tracrrna杂合体经工程改造以引导cas活性。在一些实施方式中，稀切核酸内切酶可以是znf，其是包含工程改造的锌指结构域与限制性内切酶如foki(porteus和carroll，naturebiotechnol23：967-973，2005)或化学核酸内切酶(eisenschmidt等，nuclacidsres33：7039-7047，2005；arimondo等，molcellbiol26：324-333，2006；和simon等，biochimie90：1109-1116，2008)的催化结构域的融合物。化学核酸内切酶中，化学或肽切割物与核酸的多聚物或识别特定靶序列的另一dna偶联，从而将切割活性靶向特定序列。化学核酸内切酶还包括合成的核酸酶，如邻二氮菲(一种dna切割分子)和已知结合特定dna序列的三链体形成寡核苷酸(tfo)的偶联物(kalish和glazer，annnyacadsci1058：151-161，2005)。所述化学核酸内切酶包括在本发明术语“核酸内切酶”内。所述核酸内切酶的示例包括i-scei、i-chui、i-crei、i-csmi、pi-scei、pi-tlii、pi-mtui、i-ceui、i-sceii、i-sceiii、ho、pi-civi、pi-ctri、pi-aaei、pi-bsui、pi-dhai、pi-drai、pi-mavi、pi-mchi、pi-mfui、pi-mfli、pi-mgai、pi-mgoi、pi-mini、pi-mkai、pi-mlei、pi-mmai、pi-mshi、pi-msmi、pi-mthi、pi-mtui、pi-mxei、pi-npui、pi-pfui、pi-rmai、pi-spbi、pi-sspi、pi-faci、pi-mjai、pi-phoi、pi-tagi、pi-thyi、pi-tkoi、pi-tspi、和i-msoi。本文所用术语“表达”指转录特定核酸序列以生成正义或反义mrna，和/或翻译正义mrna分子以生成多肽，伴随或不伴随后续的翻译后事件。在一些实施方式中，作为核酸内切酶切割的结果，可以降低靶向基因的表达。如本文所用，对于植物或植物细胞中的基因或多肽，“降低表达”包括抑制、中断、敲除或敲减基因或多肽，使得基因的转录和/或所编码多肽的翻译与相应野生型植物或植物细胞相比降低。可使用例如以下方法测量表达水平：反转录聚合酶链式反应(rt-pcr)、northern印迹、点印迹杂交、原位杂交、核连缀(nuclearrun-on)和/或核失控(nuclearrun-off)、rna酶保护或免疫和酶方法(如elisa、放射性免疫试验和western印迹)。可以将本文所述的多核苷酸，载体和多肽引入许多单子叶植物和双子叶植物和植物细胞系统，包括双子叶植物如拟南芥，马铃薯，番茄，大豆，青椒和荠蓝，以及单子叶植物如玉米，大麦，小麦，黑小麦和燕麦。本文所述方法可用于例如属于下述的双子叶植物：木兰目(magniolales)、八角目(illiciales)、樟目(laurales)、胡椒目(piperales)、马兜铃目(aristochiales)、睡莲目(nymphaeales)、毛茛目(ranunculales)、罂粟目(papeverales)、瓶子草科(sarraceniaceae)、昆栏树目(trochodendrales)、金缕梅目(hamamelidales)、杜仲目(eucomiales)、银毛木目(leitneriales)、杨梅目(myricales)、壳斗目(fagales)、木麻黄目(casuarinales)、石竹目(caryophyllales)、肉穗果目(batales)、蓼目(polygonales)、白花丹目(plumbaginales)、五桠果目(dilleniales)、山茶目(theales)、锦葵目(malvales)、荨麻目(urticales)、玉蕊目(lecythidales)、堇菜目(violales)、杨柳目(salicales)、白花菜目(capparales)、杜鹃花目(ericales)、(diapensales)、柿树目(ebenales)、报春花目(primulales)、蔷薇目(rosales)、豆目(fabales)、川苔草目(podostemales)、小二仙草目(haloragales)、桃金娘目(myrtales)、山茱萸目(cornales)、睡莲目(proteales)、檀香目(santales)、大花草目(rafflesiales)、卫矛目(celastrales)、大戟目(euphorbiales)、鼠李目(rhamnales)、无患子目(sapindales)、胡桃目(juglandales)、牻牛儿苗目(geraniales)、遠志目(polygalales)、伞形目(umbellales)、龙胆目(gentianales)、花葱目(polemoniales)、唇形目(lamiales)、车前目(plantaginales)、玄参目(scrophulariales)、桔梗目(campanulales)、茜草目(rubiales)、川续断目(dipsacales)、和菊目(asterales)。本方法在在广泛的植物物种中使用，包括来自双子叶属颠茄属(atropa)、油丹属(alseodaphne)、腰果属(anacardium)、落花生属(arachis)、琼楠属(beilschmiedia)、芸苔属(brassica)、红花属(carthamus)、木防己属(cocculus)、巴豆属(croton)、香瓜属(cucumis)、柑橘属(citrus)、西瓜属(citrullus)、辣椒属(capsicum)、长春花属(catharanthus)、椰子属(cocos)、咖啡属(coffea)、南瓜属(cucurbita)、胡萝卜属(daucus)、杜氏木属(duguetia)、花菱草属(eschscholzia)、榕属(ficus)、草莓属(fragaria)、海罂粟属(glaucium)、大豆属(glycine)、棉属(gossypium)、向日葵属(helianthus)、橡胶树属(hevea)、天仙子属(hyoscyamus)、(lactuca)、(landolphia)、(linum)、(litsea)、(lycopersicon)、羽扇豆属(lupinus)、木薯属(manihot)、马郁兰属(majorana)、苹果属(malus)、苜蓿属(medicago)、烟草属(nicotiana)、木犀榄属(olea)、银胶菊属(parthenium)、罂粟属(papaver)、鳄梨属(persea)、菜豆属(phaseolus)、黄连木属(pistacia)、豌豆属(pisum)、梨属(pyrus)、李属(prunus)、萝卜属(raphanus)、蓖麻属(ricinus)、千里光属(senecio)、风龙属(sinomenium)、千金藤属(stephania)、白芥属(sinapis)、茄属(solanum)、可可属(theobroma)、车轴草属(trifolium)、胡卢巴属(trigonella)、野豌豆属(vicia)、蔓长春花属(vinca)、葡萄属(vitis)、和(vigna)的物种。本文所述方法还用于例如属于下述的单子叶植物：泽泻目(alismatales)、水鳖目(hydrocharitales)、茨藻目(najadales)、霉草目(triuridales)、鸭跖草目(commelinales)、谷精草目(eriocaulales)、帚灯草目(restionales)、禾本目(poales)、灯心草目(juncales)、莎草目(cyperales)、香蒲目(typhales)、凤梨目(bromeliales)、姜目(zingiberales)、棕榈目(arecales)、巴拿马草目(cyclanthales)、露兜树目(pandanales)、天南星目(arales)、百合目(lilliales)、和兰目(orchidales)、或用于属于裸子植物门(gymnospermae)的植物例如松杉目(pinales)、银杏目(ginkgoales)、苏铁目(cycadales)和麻黄目(gnetales)。这些方法可用于单子叶植物属单子叶属(allium)、须芒草属(andropogon)、剪股颖属(aragrostis)、天门冬属(asparagus)、燕麦属(avena)、狗牙根属(cynodon)、油棕属(elaeis)、羊茅属(festuca)、羊茅黑麦草属(festulolium)、萱草属(heterocallis)、大麦属(hordeum)、青萍属(lemna)、黑麦草属(lolium)、芭蕉属(musa)、稻属(oryza)、黍属(panicum)、狼尾草属(pannesetum)、梯牧草属(phleum)、早熟禾属(poa)、黑麦属(secale)、高粱属(sorghum)、小麦属(triticum)、和玉蜀黍属(zea)；或裸子植物属冷杉属(abies)、杉木属(cunninghamia)、云杉属(picea)、松属(pinus)、和黄杉属(pseudotsuga)的物种。植物细胞，植物组织或完整植物可通过选择或筛选工程改造的细胞的特定性状或活性(例如，由标志物基因或抗生素抗性基因编码的那些)来鉴定和分离。这样的筛选和选择方法是本领域普通技术人员所熟知的。另外，可以使用物理和生物化学方法来鉴定转化体。这些包括用于检测多核苷酸的southern印迹分析或pcr扩增；用于检测rna转录物的northern印迹、s1rna酶保护、引物延伸、或rt-pcr扩增；用于检测多肽和多核苷酸的酶或核酶活性的酶学试验；和检测多肽的蛋白凝胶电泳、western印迹、免疫沉淀反应和酶联免疫分析。其他技术如原位杂交，酶染色和免疫染色也可用于检测多肽和/或多核苷酸的存在或表达。稳定纳入植物细胞的多核苷酸可用例如标准育种技术导入其他植物。以下实施例进一步描述了本发明，这些实施例并不限制权利要求书所述的本发明范围。实施例实施例1-hilage：拟南芥gmcrispr构建体组装：gmcrispr构建体由cas9核酸酶和引导rna(grna)组成。这两个基因组装在不同的载体中，然后合并成一个载体。cas9组装：对cas9核酸酶进行密码子优化以匹配大豆(glycinemax)的主要密码子使用。cas9核酸酶也可以被设计成与拟南芥或其他植物或动物物种的主要密码子使用相匹配。将基于sv40的拟南芥核定位信号(nls)(hicks等，plantphysiol107(4)：1055-1058，1995)添加到密码子优化的cas9蛋白的c末端。下文称为gmcas9的cas9-nls盒(seqidno：1，图4，编码seqidno：2，图5)由生命技术公司(lifetechnologies)(纽约)合成。asci和paci限制性位点分别存在于gmcas9盒的上游和下游。用asci和paci消化将合成的gmcas9克隆到pmdc32gateway载体中，然后连接，在pmdc32中取代ccdb基因。在paci限制性位点下游和ecori限制性位点上游的pmdc32质粒中存在nos终止子。通过用asci和ecori消化两个质粒，然后连接以取代ccdb基因，将gmcas9-nos片段从pmdc32转移到目的载体(pmdc123)。pmdc123目的载体含有卡那霉素抗性，而gateway载体pmdc32质粒含有潮霉素抗性，允许使用卡那霉素选择来回收目的载体。pmdc123质粒还含有bar基因针对由camv35s启动子驱动的对除草剂双丙氨膦(bialaphos)的抗性，使得在完整植物转化后进行除草剂选择成为可能。使用hindiii和asci消化然后连接，在gmcas9盒前加入侧接hindiii和asci限制性位点的花椰菜花叶病毒加倍35s(camvd35s)启动子。使用不同的驱动gmcas9的启动子创建了几个版本的pmdc123gmcas9盒。使用kod聚合酶(丹麦诺维泽姆公司(novozyme))从拟南芥基因组dna中pcr扩增这些启动子，并设计pcr引物以分别在正向和反向引物中含有hindiii和asci限制性位点。使用hindiii和asci限制性位点将pcr扩增子用hindiii和asci双重消化并克隆入pmdc123以取代d35s启动子。表2测试的启动子用于扩增启动子的pcr引物是：扩展蛋白样蛋白基因启动子：at3g45970f5′ccaagcttcccaactacacgatggactcac3′(seqidno：6)r5′ccggcgcgccatgtaaagagaagagaggacaaag3′(seqidno：7)60s酸性核糖体蛋白基因启动子at5g40040f5′ccaagcttcccaactacacgatggactcac3′(seqidno：8)r5′ccggcgcgccatgtaaagagaagagaggacaaag3′(seqidno：9)天然拟南芥无机磷酸盐转运体1-4(pht1；4)f5′cgaaaataaatgaaggcatcaataaaagcttacc3′(seqidno：10)r5′gtcagctcggcgcgcctcttcttctcctctgcaatttttcatcac3′(seqidno：11)pbsgrna盒和载体组装：设计拟南芥atu6启动子(at3g13855)以驱动grna的表达(图6)。由生命技术公司(lifetechnologies)(纽约)生成合成盒，其由atu6启动子和grna表达盒组成，随后是由八个胸腺嘧啶残基组成的终止子。盒的两端都含有ecori限制性位点。使用ecori消化将该表达盒克隆到pbs载体中，然后连接。使用具有20个碱基对(bp)的互补序列的一对24bppcr引物合成20bp靶序列片段。为了产生靶序列片段，将两种反向互补引物在1xpcr缓冲溶液中在对应于pcr引物的退火温度的退火温度下退火3小时。当结合时，这对引物在片段的每一端产生4bp5′突出端，其设计为与bbsi位点相容。为了将靶序列片段插入到grna中，在靶序列20bp间隔区内设计的两个bbsi位点处用bbsi消化载体。bbsi的消化除去了20bp间隔区以允许插入靶序列片段。消化后，用小牛肠磷酸酶(cip；新英格兰生物实验室公司(newenglandbiolabs)，马萨诸塞州)处理质粒。然后将靶序列片段在bbsi位点之间连接到grna载体中。靶寡核苷酸的序列如下(其中f1/r1用于靶1，f2/r2用于靶2)：gl1因基因(at3g27920.1)f15′gattgagaatcaagaatacaagaa3′(seqidno：12)r15′aaacttcttgtattcttgattctc3′(seqidno：13)f25′gattggaaaagttgtagactgaga3′(seqidno：14)r25′aaactctcagtctacaacttttcc3′(seqidno：15)下划线表示20bp靶序列。结合gmcas9和grna盒以形成crispr构建体：在ccdb位点被gmcas9盒取代的情况下，pmdc123中的ecori位点成为独特切割位点。用于将表达盒插入到pbs载体中的相同的ecori切割位点用于将grna克隆到gmcas9盒下游的pmdc123载体中。含有gmcas9盒的pmdc123载体用ecori消化并用cip处理。也用ecori消化pbs载体。然后将grna盒在ecori限制性位点之间连接到pmdc123质粒中。该构建体被称为gmcrispr构建体。gus构建体产生：创建几个gus表达构建体以测试所选启动子的功效(表2)。如前所述将启动子插入pmdc123质粒中。将gus报告基因在asci和paci位点之间插入到pmdc123中，以取代gmcas9片段而不破坏nos终止子片段。这些构建体在本文中被称为gus构建体。植物材料：哥伦比亚型(col)拟南芥种子，其针对cenh3gfp-ts-hfd单倍体诱导转基因(ravi和chan，同上)纯合并且就在cenh3(at1g01370)中的单核苷酸多态性(snp)(在本文中称为cenh3snp)分离，由lucacomai博士(加利福尼亚大学戴维斯分校(uc-davis))提供。根据ravi和chan(同上)概述的方法对cenh3snp的存在对后代进行基因分型，其观察到当与野生型拟南芥异交时，cenh3gfp-ts-hfd单倍体诱导转基因纯合以及突变体cenh3snp纯合的个体产生少量不含诱导系染色体的单倍体个体。对于突变体cenh3snp纯合的个体大多是雄性不育的，因此需要维持cenh3snp变异杂合的个体以产生具有纯合突变体cenh3snp的更多个体。具有卡那霉素抗性的ler植物从冷泉港的genetrap系获得。将植物材料在含有0.8％琼脂和1％蔗糖的1/2ms培养基中的盆栽混合物土壤或培养皿中的生长室中生长。生长条件是16小时的光照，白天和夜晚的温度分别为22℃和20℃。每隔一周在土壤中的植物受到半强度的hoglands溶液的施肥。植物转化：使用浸花法(clough和bent，plantj，16(6)：735-743，1998)转化拟南芥植物。将gmcrispr构建体转化到对于cenh3gfp-ts-hfd单倍体诱导转基因纯合的植物中，并且对于(at1g01370)中的snp变化基因分型为杂合的。拟南芥gl1/gl1植物用gus构建体通过浸花转化。拟南芥哥伦比亚型(col)植物也用gus构建体转化。筛选含有gmcrispr或gus构建体的植物的t1种子：浸花后，使植物成熟并结出种子。收获后将t1种子在室温下干燥7天。将t1种子放在盛有盆栽混合物的托盘中。平地的土壤被水淹没，平地盖上一个透明的盖子，以保持较高的水分含量。萌发十天后，将平地用0.01％basta除草剂(草丁磷)溶液喷雾以选择含有pmdc123构建体的个体。萌发十七(17)天后，再次进行basta喷雾以再次选择含有pmdc123构建体的个体。在两轮basta喷雾中存活的植物被移植到单个盆中并且分配了植物鉴定编号。该程序用于筛选含有gmcrispr构建体或gus构建体的植物。使用gus表达测定测试启动子：在basta除草剂喷雾中存活后，将含有gus构建体的t1植物生长至开花期。在开花期间，从植物切下处于各生长阶段的花并按照gus染色方案染色。解剖花，并在解剖显微镜下评估gus染色的存在。这些植物也生长至结出种子以延续种系。筛选t1crispr植物在gl1基因座处的突变(at3g27920)：在basta除草剂喷雾中存活之后，目测检查含有gmcrispr构建体的t1植物以鉴定没有毛状体或具有叶而不具有毛状体的切片的植物。这些植物针对crispr靶位点gl1基因座(at3g27920)处的突变的存在进行了基因分型(表3a和3b)。如别处所述(curtin等，plantphysiol156(2)：466-473，2011)使用caps分析进行突变植物基因型验证。简而言之，使用侧接靶位点的引物对靶标进行pcr扩增。接着，使用dde1限制酶消化该片段。将抗消化的pcr扩增子提交至明尼苏达大学基因分型中心(umgc)进行sanger测序以确认突变的存在。注意到t1植物的毛状体数目减少或毛状体完全不存在可由体细胞突变而不是种系突变产生，因此下一代需要进一步筛选gl1基因座的突变。表3a用于基因型筛选的方法和靶位点表3b用于扩增crispr靶位点的pcr引物筛选cenh3snp的t1植物：对于具有gmcrispr构建体且缺少毛状体或具有很少毛状体的个体针对cenh3snp进行基因分型。基于cenh3snp将个体分为三种基因型：纯合野生型，杂合突变体和纯合突变体。选择t1代gmcrispr植物进展：根据植物是否具有gmcrispr、缺少毛状体或具有很少的毛状体，并且对于cenh3snp杂合，选择待进展的t1植物。因此，基因分型为针对cenh3snp纯合野生型的t1植物不进展。针对cenh3snp杂合的t1植物被进展以保持系的种子。没有回收到具有gmcrispr、缺少毛状体并且对于突变体cenh3snp是纯合的t1植物。gmcrispr植物的t2，t3和更后代的选择和进展：将来自选择的t1个体的t2种子直接接种到土壤中，或者表面消毒，在含有1％蔗糖的1/2ms0.8％琼脂培养基的皮氏培养皿板上培养，然后移植到土壤中。移植到土壤后21天，如上所述，使用basta除草剂筛选植物的gmcrispr构建体的存在。接着，目视检查个体是否缺少毛状体。观察到分离比例为3∶1(毛状体：无毛状体)，表明gl1突变在种系细胞中并且该突变是可遗传的。在这个阶段，预期缺乏毛状体的植物是由遗传一对突变体gl1/gl1等位基因的植物产生的，而不是来自正在发生引起gl1/gl1表型的体细胞突变的植物。注意到gmcrispr也可能引起新的突变。针对cenh3snp对含有gmcrispr并缺乏毛状体的植物进行基因分型。对于野生型cenh3snp纯合的个体(表4a：类别4和5)没有进展。cenh3snp杂合的个体(表4a：类别6和7)进展以维持植物系。选择cenh3snp纯合的个体(表4a：类别8和9)用于初步杂交以测试单倍体诱导和靶向诱变系统。将来自选择的t2个体的t3代(和更后代)种子直接接种到土壤中，或者首先表面消毒，在含有1％蔗糖的1/2ms0.8％琼脂培养基的皮氏培养皿板上培养，然后移植到土壤中。移植到土壤后21天，使用basta除草剂喷雾筛选植物的gmcrispr构建体的存在。如果所有个体显示除草剂抗性(表4b：类别5，7和9)，则确定个体t2∶3家族对于gmcrispr构建体是纯合的。只有来自gmcrispr构建体纯合的家族的个体被进展。接下来，目视检查个体是否缺少毛状体以确认它们是gl1/gl1。针对cenh3snp对含有gmcrispr并缺乏毛状体的植物进行基因分型。对于野生型cenh3snp(表4b：类别4和5)鉴定为纯合的个体未进展，而对于cenh3snp(表4b：类别6和7)杂合的个体被进展以保持植物系。选择cenh3snp纯合的个体(表4b：类别9)用于杂交以测试单倍体诱导和靶向诱变系统。表4at2植物的预期基因型类别的列表表4bt3植物的预期基因型类别的列表从杂交型#l，#2和#3，核酸内切酶靶gl1的种子的表型筛选：进行杂交以测试将单倍体诱导物系统与crispr靶向诱变系统组合的有效性。ravi和chan(同上)发现使用单倍体诱导物作为杂交中的雌性而不是雄性，导致杂交产生的单倍体百分比更高。因此，对于杂交型#1和#2，在单倍体诱导物杂交中用作雌性的植物是col，(gl1/gl1)，对于突变体cenh3snp是纯合的，对于gmcrispr转基因是杂合的或纯合的，对于gfp-ts-hfd转基因是纯合的，并且缺乏卡那霉素(kan)抗性基因(表4a和4b，类别8和9)。gmcrispr杂合的个体产生的配子只有50％实际上含有gmcrispr，而gmcrispr纯合的个体产生的配子中100％含有gmcrispr构建体。因此，优选与gmcrispr纯合的个体杂交。对于用t2植物进行的杂交，gmcrispr的基因型不确定；这些杂交用杂合或纯合的gmcrispr植物进行。在杂交型#1(表5)中，缺乏卡那霉素抗性基因的lergl1/gl1植物用作雄性。在杂交型#2(表6)中，含有卡那霉素抗性基因的lergl1/gl1植物用作雄性。杂交#2中卡那霉素抗性基因的存在允许在含有卡那霉素的培养基上培育来自杂交的种子时去除任何自花授粉衍生的种子。为了测试单倍体诱导和靶向诱变是否可以使用单倍体诱导物作为杂交雄性，使用单倍体诱导物作为雄性和具有或不具有卡那霉素抗性的ler系作为雌性进行杂交型#3(表7)。应该注意的是，由于单倍体诱导系大多是雄性不育，将其作为雄性杂交可能困难并且导致低成功率。将由杂交产生的种子表面灭菌，然后在具有1％蔗糖的1/2ms0.8％琼脂培养基的皮氏培养皿板上生长。杂交型#1衍生的植物不含卡那霉素抗性，因此不能在含有卡那霉素的培养基上接种。相反，来自杂交型#2的有效杂交产生的所有种子确实含有卡那霉素抗性基因，并将其接种在含有50ng/ml卡那霉素的培养基上。由自花授粉产生的杂交型#2中的任何种子都不具有卡那霉素抗性基因，并且被培养基中的卡那霉素杀死。杂交型#3种子没有接种在含卡那霉素的培养基上。后代在发芽后14-21天经表型筛选毛状体的存在。预测在杂交类型#1，#2和#3(分别为表5，6和7)的后代中存在五种表型类别。对来自这些杂交的幼苗筛选gl1突变的存在和单倍体的存在。视觉筛选个体的毛状体的缺乏作为在gl1基因座(at3g27920)成功突变的初步筛选。为了初步筛选单倍体，视觉评估个体的生长和活力，因为二倍体个体比单倍体个体生长快得多且大得多(ravi和chan，同上)。一旦确定，没有毛状体的个体被移植到含有土壤的盆中并允许进一步发育。生长缓慢且体型较小的个体也被移植到土壤中进一步发育。进行筛选以鉴定没有毛状体并且体型较小并生长得更慢的个体，表明它们已经发生了突变并且是单倍体。突变体cenh3snp纯合的个体大多是雄性不育的(ravi和chan，同上)，因此预测自花授粉的发生是罕见事件。初步筛选还表明，从纯合突变体cenh3snp植物产生的少数种子具有低活力。在杂交类型#1中由自花授粉产生的任何个体都是gl1/gl1二倍体，并且与单倍体个体相比，可以通过其更有力的生长筛选出来。然而，由杂交类型2中的自花授粉产生的个体被培养基中的卡那霉素杀死。由杂交类型#3中的自花授粉产生的任何个体都是gl1/gl1，并且可以通过它们的毛状体存在筛选出来。记录分类为五个类别之一的个体的数量以及未发芽种子的数量，以确定hilage的百分比效力。表5来自杂交型#1的预期基因型类别：核酸内切酶靶标gl1(at3g27920)单倍体诱导物用作雌性植物。ler植物用作雄性。lerφ雄性植物不含kan抗性。杂交种子接种在不含卡那霉素的培养基上。φ其他野生型系可用作雄性，但是将需要开发不同的snp测试区分特定野生型系和col。*由于单倍体诱导物系大部分是雄性不育的，自花授粉是不可能事件。**与二倍体个体相比，单倍体个体通常较小并且生长较为缓慢(ravi和chan，同上)。***一些缓慢生长的植物可以是非整倍体而非完全是单倍体。可通过基因型分析将单倍体个体与非整倍体个体区分开。表6来自杂交型#2的预期基因型类别：核酸内切酶靶标gl1(at3g27920)单倍体诱导物用作雌性植物。ler植物用作雄性。ler雄性植物不含kan抗性。杂交种子接种在含卡那霉素的培养基上。*由于单倍体诱导物系大部分是雄性不育的，因此自花授粉是不可能事件。培养基中使用卡那霉素防止这类植物萌发。**与二倍体个体相比，单倍体个体通常较小并且生长较为缓慢(ravi和chan，同上)。***一些缓慢生长的植物可以是非整倍体而非完全是单倍体。可通过基因型分析将单倍体个体与非整倍体个体区分开。表7来自杂交型#3的预期基因型类别：核酸内切酶靶标gl1(at3g27920)let植物用作雌性植物。单倍体诱导植物用作雄性。lerφ雌性植物含有或不含kan抗性基因。种子接种在普通培养基上。φ其他野生型系可用作雄性，但是将需要开发不同的snp测试区分其他野生型系和col。*与二倍体个体相比，单倍体个体通常较小并且生长较为缓慢(ravi和chan，同上)。**一些缓慢生长的植物可以是非整倍体而非完全是单倍体。可通过基因型分析将单倍体个体与非整倍体个体区分开。来自杂交型#1，#2和#3，核酸内切酶靶gl1的种子的基因型筛选：表型筛选之后，对缺乏毛状体的杂交类型#1，#2和#3的个体进行基因型筛选以确认在gl1基因座(at3g27920)处存在突变，如前所述。对e类别(表5，6和7)中所有个体的gl1crispr靶位点以及c类别个体的子集进行测序以确认存在突变。对个体进行基因分型以确认单倍体化：使用定制snp芯片测定法对来自e类别(表5，6和7)的个体和一组ler和col二倍体对照植物进行基因分型以测试这些个体的单倍体，非整倍体或二倍体状态。snp测定被设计用于测试在拟南芥的五条染色体间的多个基因座处col和ler之间鉴定为多态性的snp。非整倍体个体在一个或多个snp位置处表现出对col和ler的基因型杂合，而f1植物在所有snp位置处表现出杂合，并且单倍体植物在所有位置都具有ler基因型。另外，利用全基因组测序来确认选择的突变单倍体个体的单倍体状态。流式细胞术以确认单倍体个体的出现：还进行流式细胞术以确认单倍体个体的存在。所有无毛状体和怀疑是单倍体的个体都用流式细胞仪进行检测。一些具有毛状体并怀疑是单倍体的个体以及一些已知的二倍体个体(作为对照)也使用流式细胞术进行测试。单倍体个体的生长和用秋水仙碱处理植物以达到双倍染色体数量：鉴定为纯合ler并且在靶基因座处也具有突变的单倍体个体是在抽薹之前使用秋水仙碱加倍染色体，遵循在别处描述的方法(ravi和chan，同上)。这些个体在其他地方描述的条件下长大，并收获种子。实施例2-hilage：玉米单倍体诱导物方法：玉米(zeamaize)hilage方法是采用标准玉米体内单倍体诱导使用与单倍体诱导物系杂交进行，单倍体鉴定技术和随后的染色体加倍技术，例如但不限于所述由prigge和melchinger(《分子生物学中玉米植物细胞培养方案，方法》中的“单倍体和加倍单倍体的产生”，卷877，第161-172页，2012)中所述的那些等。简而言之，玉米单倍体诱导的体内技术首先需要在要诱导的系和单倍体诱导系之间进行杂交。诱导物用作杂交的雄性或雌性。在基于hilage的方法中，单倍体诱导物很可能被用作雌性，但是可选地，使用单倍体诱导物作为雄性来进行基于hilage的方法。通常，单倍体诱导物具有用于帮助鉴定是单倍体的种子的显性紫色素基因(例如，r1-nj)。单倍体个体的种子具有紫色糊粉，但在胚乳(盾片)中缺少紫色色素，表明种系不含单倍体诱导染色体。有黄色的胚乳和紫色糊粉的种子种植出来，长大成苗。这些幼苗使用秋水仙碱或其他方法使其染色体数目加倍。染色体加倍的单倍体在温室中生长，或移植到田间，并且染色体加倍的植物自花授粉产生加倍单倍体种子。核酸内切酶转基因和转基因构建体：玉米hilage将定向诱变组分添加到体内单倍体诱导系统，因此需要核酸内切酶。有用的核酸内切酶的示例包括但不限于大范围核酸酶，zfn，tale核酸酶和crispr/cas基核酸酶。核酸内切酶被设计为靶向bm3，但是核酸内切酶可以被设计成靶向几乎任何序列。使用诸如但不限于sander等(naturemet8(1)：67-69，2011)，cermak等(nuclacidsres39(17)：7879，2011；在nuclacidsres39：e82.doi：10.1093/nar/gkr218，2011处校正)，和liang等(jgenetgenom41(2)：63-68，2014)所述的那些方法构建核酸内切酶。adh1内含子1或hsp70内含子包含在核酸内切酶基因的非翻译前导序列(美国专利号5,593,874)中以增加基因表达。用于驱动核酸内切酶表达的启动子在胚发育早期表达，并且可以是内源性或外源性的。示例示于表8。表8：启动子的示例35s(camvd35s)或衍生物(例如，双35s)zmub1(玉米)apx(稻)oscc1(稻)eif5(稻)r1g1b(稻)pgd1(稻)act1(稻)scp1(稻)用于测试驱动核酸内切酶表达的潜在启动子的方法包括以下步骤：1.开发靶向制造花色素苷/紫色素所需基因(例如，r1-nj基因)的核酸内切酶。2.在核酸内切酶编码序列前测试不同的启动子，并产生含有与各种启动子连接的核酸内切酶编码序列的转基因植物。3.用具有紫色素基因的植物(显性天然性状；不使用单倍体诱导物进行该测试)授粉含转基因核酸内切酶的植物。4.确定不同的启动子-核酸内切酶组合是否导致更少或更多的不发育紫色胚乳的种子。5.在几个转基因事件中复制相同的启动子以控制转基因在基因组中的位置效应。6.选择导致缺少紫色胚乳的f1内核比例高的启动子，这意味着突变在所有发育中的胚乳细胞的胚乳发育早期发生。7.或者，可以使用不含紫色素基因但含有核酸内切酶的单倍体诱导物进行测试。将单倍体诱导物与具有由核酸内切酶靶向的紫色素基因的系杂交。确定是否有任何种子具有紫色糊粉(表明杂交，而不是自花授粉)和缺乏紫色胚乳。移植有紫色糊粉并缺乏紫色胚乳的种子，并确定任何这些个体是否是单倍体。核酸内切酶构建体可包括选择性标记物(例如，除草剂抗性)以帮助在整个植物转化期间回收转基因，并随后进行回交，尽管基于hilage的方法不需要选择性标记物。在一些情况下，将一种或多种(例如，两种或更多种，或三种或更多种)核酸内切酶和/或crispr引导rna组合到单一构建体中以靶向一个或多个dna序列。核酸内切酶转基因向单倍体诱导物的基因渗入：基于玉米hilage的方法中的下一步是向玉米单倍体诱导系添加转基因核酸内切酶基因。使用，例如，通过基于农杆菌的方法(例如ishida等，naturebiotechnol14(6)：745-750，1996所述的方法)或粒子轰击(如gordon-kamm等，plantcellonline2(7)：603-618，1990所述的方法)的直接转化将核酸内切酶转基因加入单倍体诱导系。或者，首先用核酸内切酶转基因转化适于转化的系，然后将所得的系与单倍体诱导系杂交。从该杂交中筛选出f1二倍体后代，并且这些个体可能回交至单倍体诱导系。这个回交过程重复数次以回收大部分单倍体诱导物的遗传学，并加入核酸内切酶转基因。在完成足够数量(例如2，3或4次)的回交后，将所得回交植物(例如，bc3f1)植物自花授粉以产生bc3f2个体。筛选这些个体以发现在遗传上与单倍体诱导系非常相似并且对于核酸内切酶转基因纯合的个体。在第二种方法中，可以使用分子标记物来选择含有转基因和高百分比的单倍体诱导物基因组的回交个体。选择的个体可以用于下一轮回交，以通过添加核酸内切酶转基因更快地恢复单倍体诱导物的基因组。作为单倍体诱导系并且含有核酸内切酶转基因的所得系是单倍体诱导贮存系。测试核酸内切酶转基因的表达：在直接转化或用另一系转化之后进行回交，对单倍体诱导物贮存系中的核酸内切酶的表达进行若干测试。或者，在回交之前或同时进行表达测试以选择高表达的转基因事件。具体而言，进行从核酸内切酶转基因表达的rna和蛋白质的表达测定以确保转基因正确表达。基于hilage的方法需要具有更高表达的转化事件。转基因转化事件的功效可以另外通过确定是否在所述系的靶位点中检测到突变来评估。如上所述对拟南芥评估突变的存在。具有高基因表达和靶位点中存在突变的事件可以与靶向的系异交，以确定是否产生了具有突变的单倍体后代。期望的单倍体诱导物-转基因事件组合产生高频率和数量的具有靶向突变的单倍体后代。玉米hilage的利用：将单倍体诱导物与(作为雄性或雌性)靶向系杂交以产生单倍体后代。然而，应当注意的是，如果核酸内切酶构建体中使用的启动子在受精前(以及在第一对细胞分裂期间)导致核酸内切酶表达，则将单倍体诱导贮存系用作雌性。通过使用单倍体诱导物作为雌性，如果核酸内切酶在授粉前和在细胞发育的第一阶段期间在卵中表达，核酸内切酶可以在授粉后立即开始使目标序列突变，并在细胞丢失单倍体诱导基因组之前继续突变目标序列。在有丝分裂的第一阶段，在单倍体诱导基因组被消除之前，靶向的核酸内切酶在来自玉米品系的dna中诱导靶向的dna双链断裂。其中一些双链断裂被错误地修复，并导致突变。在后代筛选突变之前或之后，将单倍体后代基因组加倍。一旦这些单倍体个体的基因组加倍，则个体长成并自花授粉产生加倍的单倍体种子。可能产生不同的突变，并且需要评估每个突变事件以确定所获得的突变是否具有期望的结果。产生所需表型的突变在本文中被称为“有效突变”(em)。只有符合em的系才能进展。基于hilage的方法可以在育种者计划用作育种亲本的全部(或许多)玉米品系上进行。如果育种者使用在所有目标位点都具有em的品系开发种群，则种群不会分离em。因此，通过不必选择em的存在来简化育种工作。如果使用单倍体诱导贮存系作为雌性，则所得到的单倍体和加倍的单倍体将继承来自单倍体诱导贮存系的细胞质。如果需要单倍体诱导贮存系的细胞质，则所得到的近交将继承所需的细胞质。然而，如果需要该系自身的细胞质，并且如果将单倍体诱导物用作基于hilage的方法中的雌性，那么具有靶向的突变的所得加倍的单倍体可以作为雄性回交到原始系以恢复原始细胞质。杂交的f2后代具有相同的细胞质和背景遗传学，但在一个或多个靶向的突变基因座上有所不同。可以在bc1f2个体中进行选择以鉴定在期望的靶基因座处纯合的个体。在表9a和10a中提供了用于玉米基因型筛选的示例性靶位点和方法，而表9b和10b中提供了用于扩增靶位点的示例性引物。表11和表12中显示了来自两个目标杂交的预期基因型。基于玉米hilage的方法的优势可以包括：1.该方法在不到1年的时间内(使用冬季苗圃)产生具有靶向的突变的加倍单倍体个体，而不需要在期望的靶向的突变中回交成目标细胞系。2.将核酸内切酶转基因置于单倍体诱导系中需要回交，但是不需要后续的回交步骤来将突变诱导至数十，数百甚至数千的原种系(假定诱导贮存系被用作雄性或假定诱导贮存系的细胞质是可以接受的)。3.如果需要两个或更多个靶向的突变，则可以将多个核酸内切酶转基因置于诱导系中。4.如果需要多个突变，则恢复的加倍的单倍体个体可能不具有所有期望的突变。可将具有单一突变的加倍单倍体后代一起杂交，并且可以针对所有期望的突变纯合的个体筛选f2后代。5.如果诱导物用作雄性，则恢复的后代将具有靶向系的细胞质。如果需要诱导物的细胞质(例如，以获得雄性不育细胞质)，则可以使用单倍体诱导物作为雌性。如果需要靶向的系的细胞质，可以在靶向的系的非突变型(作为雌性)和靶向的系的突变型(作为雄性)之间进行杂交。6.如上所述，有丝分裂第一阶段(在去除单倍体基因组之前)中的细胞可以尝试用单倍体诱导贮存系的染色体作为模板dna链通过hr修复靶向的系的染色体中的dsb。然而，单倍体诱导物的基因可能已经被核酸内切酶突变了。因此，如果发生hr，细胞将通过使用突变的诱导贮存系的dna作为模板来错误地“修复”断裂，并且在靶向的系的dna中会出现突变。如果hr以这种方式出现，潜在地，可以在靶向的系中诱导特定突变。7.基于hilage的方法可用于无回交的转基因插入。如果所提供的模板含有侧翼为与dsb任一侧上的序列同源的序列的转基因，则可将转基因导入dsb中(参见shukla等，nature459：437-441，2009)。在基于hilage的方法中，由usda批准的转基因事件(例如，插入除草剂基因)回交到单倍体诱导系中。核酸内切酶基因用于靶向非转基因系中转基因的相对位置。(在除草剂基因纯合的系中，核酸内切酶将无效)。待插入的转基因事件需要在两侧由与靶位点侧翼的dna同源的dna序列侧接。当单倍体诱导物与没有除草剂基因(因此具有靶位点)的靶向系杂交时，核酸内切酶将在靶位点处产生双链断裂。如果使用单倍体诱导贮存系的dna(和转基因)作为模板通过hr修复靶向系的dna，则靶向系dna通过将转基因序列置于双链断裂位点中来“修复”双链断裂。因此，基于hilage的方法可用于将转基因置于靶向系中而不必回交。假设围绕转基因的序列与由usda证实的转基因事件周围的序列完全相同，这两个事件可以说是基本相当的。玉米的靶基因-bm3zeammb73_595664：靶寡核苷酸的序列如下(其中f1/r1为靶1，f2/r2为靶2)：玉米bm3基因(zeammb73_595664)f15′gattgggctccaccgccggcgacg3′(seqidno：19)r15′aaaccgtcgccggcggtggagccc3′(seqidno：20)f25′gattgaaccaggacaaggtcctca3′(seqidno：21)r25′aaactgaggaccttgtcctggttc3′(seqidno：22)下划线表示20bp靶序列。表9a用于基因型筛选的方法和靶位点，靶1表9b用于扩增crispr靶位点的pcr引物，靶1基因靶玉米bm3正向引物5′-cacggtgcttgaattagtgcg-3′(seqidno：24)反向引物5′-ggtcctccatctggcaccg-3′(seqidno：25)表10a用于基因型筛选的方法和靶位点，靶2表10b用于扩增crispr靶位点的pcr引物，靶2基因靶玉米bm3正向引物5′-ggtggtggacgaggaggc-3′(seqidno：27)反向引物5′-gtagcaccaatgatgagcgag-3′(seqidno：28)表11来自杂交的预期基因型类别：bm3核酸内切酶靶标(zeammb73_595664)单倍体诱导贮存系是雌性并具有紫色素性状(r1-nj)，并且与没有紫色素性状的系杂交(参见brink和williams，genet73(2)：273-296，1973)。单倍体种子由颜色性状鉴定；不是单倍体的种子容易通过视觉识别丢弃。只有d和e类的种子被种植出来。*单倍体个体的种子具有紫色糊粉，但在胚乳(盾片)中缺少紫色色素，表明种系不含单倍体诱导染色体。表12来自杂交的预期基因型类别：bm3核酸内切酶靶标(zeammb73_595664)单倍体诱导贮存系是雄性并具有紫色素性状(r1-nj)，并且与没有紫色素性状的系杂交(brink和williams，同上)。通过颜色鉴定单倍体种子；只有d和e类的种子被种植出来。*单倍体个体的种子具有紫色糊粉，但在胚乳(盾片)中缺少紫色色素，表明种系不含单倍体诱导染色体。染色体4上玉米bm3和周围序列(外显子用下划线和大写字母表示)：gtcatggatggagccagtgaactgatgattttttccccaccccgcacgcaacagcatgggtgacaacaaccactcccgctgcggttgggcgagcacatctctacgcacttgacactcacgcaaacctaacgcatactagattaatcatcgccaccaactatcggcgacagaaacgatgggccccgcttctcttaatcacggtgcttgaattagtgcgcgcatagtagtgaaaaataatagtgaaaaataagcagtgcgtgttttggtgtggtggttggtgagccgtccggcccaataaaaacccctcgcaccacctcgtccctcttcgtcgcatcgcacgccatcagcagctagcgcgctcctcgagcccagcagagaaaggccggcctacccactctctctctctctctctccagtctccaccggcagcgctaatcgtaatagccatgggctccaccgccggcgacgtggccgcggtggtggacgaggaggcgtgcatgtacgcgatgcagctggcgtcgtcgtccatcctgcccatgacgctgaagaacgccatcgagctgggcctgctggaggtgctgcagaaggaggccggcggcggcaaggcggcgctggcgcccgaggaggtggtggcgcggatgcccgcggcgcccggcgaccccgccgccgcggcggccatggtggaccgcatgctccgcctgctcgcctcctacgacgtcgtccggtgccagatggaggaccgggacggccggtacgagcgccgctactccgccgcgcccgtctgcaagtggctcacccccaacgaggacggcgtgtccatggccgccctcgcgctcatgaaccaggacaaggtcctcatggagagctggtgagtagtagccgcatcgcatcaaccaccttctacctatctatatccatcacttgttgctgctggcgtgcgcggcatgcatgatgacgagctcgctcatcattggtgctactagtgatttatttcgtccagtaaaattaattaaggtgcgctgctactctactggctgcggctagcacaaggctggaaatagttgttacttgttatacacgatataatatttctctagaacaaaaaagattttttttttataaaaagcaagcaagaaagaaagtgagtgacttcatgtttttcctaaaaaaaagttaggagtgggatggaaaagtcagcaaggaccacttgtttgttgtccactatccatccagtgggtgagacttttttgcgagacggagcactatattattggccgagtcctttttctgtatccgcaaaacggcagccgtcgatcgccggacggatcgacggctcacatgagtgtcgagtccaattccaaccacgagggcggcaaggaaaaccatccgtgctggtctggactttttgccaaactccattcagccattcgccgactgaaggtgaatcttcagacagccagattgtttggtgtctagtgtgtgcgaagatggcgtagaaaagactgagagacagttggctcacacagacaagtgacaactgactatagtatctgcctgcctggctgatgctgatagagatggggactcttgtcctgtctgtttcttgtatgcgctgatctgattctgatcactgccactctgccaggtactatctcaaggacgcggtgctggacggcggcatcccgttcaacaaggcgtacgggatgacggcgttcgagtaccacggcacggactcgcgcttcaaccgcgtgttcaacgagggcatgaagaaccactcggtgatcatcaccaagaagctgctggacttctacacgggcttcgagggcgtgtcgacgctggtggacgtgggcggcggcgtgggcgccacgctgcacgccatcacgtcccgccacccgcacatctccggggtcaacttcgacctgccgcacgtcatctccgaggcgccgccgttccccggcgtgcgccacgtgggcggggacatgttcgcgtccgtgcccgccggcgacgccatcctcatgaagtggatcctccacgactggagcgacgcgcactgcgccacgctgctcaagaactgctacgacgcgctgccggaaaatggcaaggtcatcgtcgtcgagtgcgtgctgccggtcaacacggaggccacccccaaggcgcagggcgtcttccacgtcgacatgatcatgctcgcgcacaaccccggcggcaaggagcggtacgagcgcgagttccgcgagctcgcaaagggcgccggcttctccgggttcaaggccacctacatctacgccaacgcctgggccatcgagttcatcaagtgaaccaccgtcgccgcgatgagatggcatggctgccacatgctttgcttgcttggtcctcgtatcgtacgtcgccgtcgtcgtcttcttctggttattgcgctgctacctcgctgctctcgcgtatgcatgtacttttgcttaattttctttcttcatatcatgcactctggctggcctagac(seqidno：29)实施例3-hilage：小麦单倍体诱导物方法：基于小麦(普通小麦或硬粒小麦)hilage的方法如下进行：使用标准小麦体内单倍体诱导，与玉米花粉杂交以对去雄小麦穗进行授粉，组织培养中拯救胚以及随后的染色体加倍技术，例如但不限于由knox等(plantbreeding119：289-298，2000)和inagaki(“通过宽杂交在小麦中产生加倍单倍体(doublehaploidproductioninwheatthroughwidehybridization)”，于《作物中产生加倍单倍体：手册》(doublehaploidproductionincropplants：amanual)，maluszynski，kasha，forster和szarejko(编)，第53-58页，kluwer学术出版公司，荷兰多德雷赫特，2003)描述的那些。简而言之，小麦单倍体诱导的体内技术首先需要去雄小麦穗。第二天，去雄小麦穗用玉米花粉授粉。在去雄后的第3天和第4天，用2，4-二硝基苯腙或麦草畏(3，6-二氯-2-甲氧基苯甲酸)(knox等，同上)处理该穗。然后在授粉后约16-19天，将发育中的小麦胚从穗上去除并转移至组织培养。发育中的胚在组织培养中生长成苗。最终将植物移植到温室中，用秋水仙碱处理以使染色体数量加倍，并收获加倍的单倍体种子。或者，小麦单倍体诱导可以使用高粱，粟，大麦(球茎大麦(hbulbosum))或者类蜀黍花粉来诱导。以下程序将描述玉米作为单倍体诱导物的用途，但玉米可另外被高粱，粟，大麦(球茎大麦(h.bulbosum))或者类蜀黍替代。核酸内切酶转基因和转基因构建体：基于小麦hilage的方法将定向诱变组分添加到体内单倍体诱导系统，因此需要核酸内切酶。在小麦hilage中，一个或多个玉米染色体携带能够在小麦基因组中引起靶向的双链断裂的核酸内切酶转基因。有用的核酸内切酶包括但不限于大范围核酸酶，zfn，tale核酸酶和crispr/cas基核酸内切酶。核酸内切酶被设计为靶向tsn1，但是核酸内切酶可以被设计成靶向几乎任何序列。核酸内切酶是使用诸如但不限于sander等(同上)，cermak等(同上)和liang等(同上)所述的那些方法构建的。用于驱动核酸内切酶表达的启动子可以是内源的或外源的。在去除携带核酸内切酶转基因的玉米染色体之前，核酸内切酶的高表达对于增加靶向的突变成功的机会是必不可少的。合适的启动子在胚发育早期表达，并且可以是内源的或外源的。示例示于表8。核酸内切酶构建体可以包括选择标记，例如除草剂抗性基因，以在整个植物转化和随后的回交过程中协助转基因的回收。当包括时，除草剂抗性选择标记与玉米和/或小麦中强表达的启动子操作性地连接。在一些情况下，含有核酸内切酶的转基因构建体或组合成相同玉米品系的第二构建体含有一个或多个dna序列拷贝，其与位于靶位点及其侧翼的dna具有同源性。该dna序列可以含有核苷酸变化，如一个或多个碱基对取代和/或缺失和/或添加。或者，该序列可含有基因，启动子，调控序列和/或转基因。测试转基因小麦中的核酸内切酶：虽然基于hilage的方法不使用转基因小麦品系来产生具有靶向的突变的加倍单倍体小麦的最终产物，但是在转基因小麦品系中测试靶向的核酸内切酶构建体的功效可能是有益的，虽然不是必需的。小麦转化可以按照诸如但不限于由weeks等(plantphysiol102(4)：1077-1084，1993)和cheng等(plantphysiol115(3)：971-980，1997)描述的那些技术进行。使用类似于拟南芥部分所述的方法，可检测具有推定突变的转基因小麦的靶向的突变。具有引起双链断裂功效的核酸内切酶应当用于基于小麦hilage的方法。产生用于小麦hilage的玉米品系：基于小麦hilage的方法与小麦中正常加倍单倍体产生之间的一个主要差异是转基因玉米品系而不是常规玉米品系用于单倍体诱导。如此，用核酸内切酶构建体转化玉米品系。可以使用几种方法将核酸内切酶转基因加入单倍体诱导物中，所述方法例如但不限于：农杆菌方法(如由ishida等，同上描述的那些方法)或通过粒子轰击(例如gordon-kamm等，同上描述的那些方法)。由于用于玉米转化的品系可能不是多产的单倍体诱导物，尽管不是必要的，将核酸内切酶转基因回交到在小麦单倍体诱导中显示出高效力的遗传背景中可能是有益的。可以在分子标记的辅助下进行转基因回交进入更合适的玉米品系以选择核酸内切酶转基因的存在以及选择轮回亲本的遗传背景(合适的玉米品系)和对抗供体亲本(最初转化的玉米品系)。根据选择用于驱动核酸内切酶的启动子，核酸内切酶可能在玉米品系中表现出不同于玉米-小麦杂交后代中的表达。如果基因预期在玉米中表达，则评估核酸内切酶的rna和蛋白质表达以证实核酸内切酶有功能可能是有益的。突变的小麦植物的基因分型：在移植到土壤之前或之后，将幼苗基因分型以鉴定(1)是否发生期望的靶向的突变，(2)小麦植物是否不再含有玉米染色体，以及(3)转基因是否不再存在。此外，可能需要对潜在的不同分蘖进行基因分型，因为该植物可能针对一种或多种靶向突变是嵌合的。检查目标位点的突变可以按照之前在拟南芥部分所述进行。玉米染色体的存在可以通过几种方法中的一种或多种来评估。可以设计引物以扩增用于单倍体诱导的玉米品系中的10个玉米染色体中的每一个上的特定序列，并且这些引物可以用于确定玉米染色体是否仍然存在。或者，可以设计定制的snp芯片，其可以用于对小麦品系和玉米dna进行基因分型。在已经丢失玉米染色体的小麦植物中，小麦snp能够被基因分型，但是玉米snp不能被基因分型。或者或另外地，可以利用低覆盖度全基因组测序方法或rna测序方法来确定玉米染色体是否存在和/或玉米基因是否正在表达。如果玉米染色体已经从小麦植物中除去，转基因很可能已被除去。然而，为了提高hilage的产业和消费者的接受度，对小麦品系中转基因的缺失进行检测可能是有益的。在一种方法中，可以设计扩增部分或全部转基因构建体的引物，并用于测试构建体的任何部分是否在产生的小麦品系中。或者，如果所述数据可用，则可以在全基因组序列或rna序列数据中搜索转基因的序列。小麦hilage的利用：含有一种或多种核酸内切酶和/或crispr引导rna的玉米品系正在(作为花粉供体)与小麦品系杂交以产生单倍体后代。在玉米染色体被消除之前，靶向的核酸内切酶在来自小麦品系的dna中诱导靶向的dna双链断裂。其中一些双链断裂将被错误地修复，并导致突变。在后代筛选突变之前或之后，可将单倍体后代基因组加倍。一旦这些单倍体个体的基因组加倍，则个体可长成并自花授粉产生加倍的单倍体种子。可能产生不同的突变，并且需要评估每个突变事件以确定其是否具有期望的结果。只有具有产生所需表型的em的品系(例如，引起移码并消除适当的基因功能的突变)被进展。在一些情况下，基于hilage的方法在所有(或许多)用作育种亲本的小麦品系上进行。如果使用在所有目标位点都具有em的品系开发种群，则种群不会分离em。因此，通过不必选择em的存在来简化育种工作。hilage在小麦中的优势：hilage可在小麦中产生靶向的突变中起到关键作用。全球范围内，小麦中利用转基因仍存在阻力。hilage可以提供在小麦中诱导靶向的突变的方法，而释放的小麦品系技术上没有与放入小麦染色体中的转基因接触。基于hilage的方法在小麦中可能比在玉米中更有效，因为玉米染色体在玉米-小麦胚中的持续时间可能比单倍体诱导物玉米染色体在玉米单倍体诱导物-常规玉米品系胚中的持续时间更长。玉米染色体存在于小麦胚中的额外时间越长，越有可能发生靶向的突变。在表13a中提供了用于小麦基因型筛选的示例性靶位点和方法，而表13b中提供了用于扩增靶位点的示例性引物。来自杂交的预期基因型分类显示在表14中。小麦的靶基因-tsn1：靶寡核苷酸的序列如下(其中f1/r1用于靶1，f2/r2用于靶2)。tsn1基因f15′gattgccgctagggcatcttagat3′(seqidno：30)r15′aaacatctaagatgccctagcggc3′(seqidno：31)下划线表示20bp靶序列。表13a用于基因型筛选的方法和靶位点，靶1*faris等，proc.natl.acad.sci.usa107(30)：13544-13549，2010.表13b用于扩增crispr靶位点的pcr引物，靶1表14来自杂交的预期基因型类别：tsn1核酸内切酶靶由于小麦穗与玉米花粉杂交形成的小麦单倍化方法，几种植物结果是不可能的。如果小麦被正确去雄，则不应发生自花授粉。如果在去雄过程中出现错误，小麦种子可以自花授粉，那么该种子将比小麦x玉米杂交生长得更有活力，并且种子可以很容易地筛选出来。由于小麦和玉米染色体不能配对以及玉米染色体不能被遗传，所以b和c类是不可能的。因此只能生产d和e类。小麦tsn1和周围序列(登录号gu259618)atgactacaccaatgagtataccgttcgcaactttggaaaagattacaaatgggttctcaaacgatttaataattggaaggggtgggtatggaaacgtttacaaggtatggcttaatacttgatatttccttttttcagcaaatgttcaggctataaacaaataatttaagtgcaataattatgtcaagcaggcagtttacaaaggggaagtgattgctgtgaagttgcttcatgatgatctggtgcaattacttgatgacagacaatttaaaaatgaactttttaaccttttgagggttgagcatccgaatattgtttgcttacgtggttattgttatgaaacacggtataaaattgttaagcacaatggtgagacagtctttggtaaacatatacacagagttctctgctttgaatacttggagggtggaagcctagacaatcatcttcatggtacgatggaacttcaaaatacagttattttgttttacgtttaaaggaaactgatttctcatttacatacatactctttgttaacttgcgtagcaccatctttgccacctaactggaccacacgttacaataccataaaggggatttgtgaaggcttaaatttccttcacggatgtcaaccaccaattttgcatcttgatctgaagcctgccaatatattagtagacagttccatggtgcctaaactggcggattttggattgtcaaagctcttccatggatcacatactcatgtgacaaaacaaatcataggaacccagtaagcggaagcgacccgtggattgtctcgttctgaattttctttcttttgtgatcaaataaatagtatgtacagttctgtactaactgtgtctttgtatcacgcaggaagtacatgccaccggaattcatcaaagatggcaagatctcggttaaaaatgatgtctttagtttgggtattgtgatcatagaaataatggcaggacctatgggttattcagaattttcagaaatgggcagcggtgcacaatttgtgaaggaggtaataaaaaaaactcaagtttgacacccgagttcgtataaataacaaactaccacaccaagaatttgatgtctaatgtgtgagccattataatcgttgaactgagtttatgacaggaccggcagtaataaaaaatatagcaacactcccccacacaatatattgagcatagaagatacaacttatctagctataacaaaataataatccagaaaagtagccatttttttttccggacaggattgaggtccaccagtccaataactatgaagcagctcgctgatagaaaattccaaggtacaattatttttgtaagtttctccttatcacgtgtgaaacaccaatgtaataaagctgataaaccaaacgtacccactatgagaactgcatacactgagactcgaagaaaagaacaaatgcatatctagaaccttgctccatgggatatctagaaccttgctccatgggatctagcaccatctccattttggagcaagcacgaggtgcgtatcgtaatctttttctgctagatgcagacttagacacccagtattctctaggtaaattatttatctggaaagtcgtaggtaacacttgtgaacaaggatatagcgtacatatatatgggagcatttgtgttatgtgacacttttgacttaattgcaaatattatgttatgtgaagactcaagagtgtttttgaacaagtatcgtacatattgtaccgaaaaaggctttcgccccgctttatattataaagcacatgcccaagccaacaaaccacacaggttcacaaacacacgcagacccacacacaccaagttcacacacagacaagatccacaagggttaatgctgagggcacagcttaacaagccctagaacaaaaaggaaagacaccatctagtcgggctccggggggggggggggggggggcggcggaagtggaggcgccaggcggaaggcgagcgatcgaaggtcggcgaggagggtgttgatgatgtcccgatcctgagggcggctaagcggccgccaaagctgcaagtacccacacattttaaaaatggcgtcagtagcgcgtcgtagagggactttttggatgacaagcttattgcggacggtccacagcgtccagccgagaaccccaacgcataaccaacggatatgtcggtggcgtggggggggaggcgtggatttccgcgaggaggtcggggaagttggagttgcaccactatccgccaaccgtctcacggaaactggaccaaagaaactggccgcagggcacgtgaagaagatgtggttagcatcctccgcagtgccgcacaaggggcaaagcccatccccgggtccgttgcgcttgaggacttcgacaccggaggggaggcggccacgaatccactgccaaaggaagatcctaatcttcagaggtaagcgaatgtcccagatcagagcaaagggctcgggcgcgggcgaaggcgcaatagccgcgtacatgacctagtagagaaacgaccggaggactctaggcgccacgagatggcgtccggggcgtcggtgacgctcatcggaagaagggcgatgtcctggaggagggaatcccaggcggccacttcggggggaccgaaaggacgacgaaacgcgaggcgccctaagtcaataagggccgtctcgacagagacccgagggtcaaccgcaatggtgaagagatcgggaaagcgggcggccagaggggtgtcaccgagccaccgatcaaaccagaacagggtcgcggacccagtaccaatcgaaatggacgtgccgatacgaagcacaggaagcagccgcacgacggcctgccaaaactgtgatccgcccgaacgctgacagaaagccagaggctggccacggaggtatttgttgcggataatggtgagccacaaccctccgtcaccattggcaatacgccacaaccaccgggtcaggagggcgatgttcattcggcgggaggacagaatctcaagacccccctggtctttaggtttacaaatgtccggccaagtcaccatgtggtacttctgtttgtcatcgtcgccagcccaatagaacctggattggtacttggcaatttccgtgtgcagcgtttcatggaggctataaaagctcatgaggaaccaaaggagactggcgagtgaggagttgatgaggatcacccgcgccgcctttgatagccaacgccctttccaaggttcgacgcggtgttgcatacgggtcaccgtagggtggaggtccgccacggtgaggcgcgagtcactaacggggatccccaggtaggtcgtggggaaggaccctagccgacagttcaggcgatcagcaatatcctgagcctcctccggagggtatccaaggaccatcacctcgctcttatcaaagttaatcgtaaggcccgacatctgctggaagcacaggaggaggaacttcaggttagcaacatcctgatttgaaccttccaccattattatggtgtcgttcgcgtattgcaggagggagacccctccccctccaactaggtgagggacaatgccgtggatatggccagcacccttagccttatccaggatggcggccagagcatcgaccaccatgttgaacaggaacggcgagaatgggtctcctgacagaccccacagagggtggggaagtatggcccaatctcgccgttaatgttcaccgccgtctttccacatgaaactgattgcatcacgcgggtcacccagcggtcatcaaagcccttacgcagcagtacttcccgaaggaagggccagtgaacagtatcataggctttatggaagtcaagcttcaggaacacagcacgaagatgcttcacccggacctcgtgaaggacttcatggaataccaacacgccatcaagaataaaccggccttggatgaaggccgattggttcgggtgagtgatcgaatcagccagcagggtcaccctattggcgtaccctttggccaggatccgaaaaatcacgttaatcaccgtgatggggcggaactggcgaatatcagaggcacccggaacctttgggatgagggtaatgatcccatagttgaggcgtcccaggtccatcgaacccgaatagaactcctcgaacaaagccatgacctccggtttgaccgcctgccagaatgttttaaagaaagcaacaggcaggccatccgggcctggggccgaggcggggttcatgcctttaatggccgcgagcacctcgtcctcggcgaagggagcaaccagggccgcattggcctcgccgggaaccaactgcgcccccgtccaagtatcgggggcatcgtacatattgttatatgctccatctctaattgtatctctatatttcggttttgtaggtacttaccaattggagtactatcattaaagctacatcagagtatccagcagaggaactacatcaagtgaatttgtgcatcgacatagcaatgctttgtgtggattctgaaagagtcaatagacccaccatagctggtatcctagatgcattgaataggacaaaaactcatatgccctcctctacgaaaaaaactcatattccctggggacaggtatgatttgcatacttgcaaacaaaatgaaatctcgagtatatatttgcaatctgtagaagacagttgcttggatatatggaccactaagtagttatagagtttgcagctccccgtctcccactcattttattctcaatcaagtagttctttaatagtcaggaacttgcttactgcatccttttgactccctgctctataatccatgtagaagaaccttcattttagttccggctaattccaggaatagaaaactagagagggcctattcgtaatcgtgccttccggagtgacaggctaagtgaagggcagggggatgctgccctcgacaaccgtggctgtgattggcactgtcgtgctcatacgaggtaccagacggtgtagaagttaacctagttgattaatcttaggtgtggtcatgctagatagctatatgaaagagccatacatgtagttcaagtagtgcatgcaagattccaacattcaaaatcgtgccttgtactatggaaggggaaagggaggggtaacacgtaatgagtgccctataagccttacacaatagctttatcagaccactgtggcgccctaactgacgccaacagaggtagctgcaatggttcgatgagatagcggtgagagagaaggggcagggggacattggtggcaggtgtaagggaaaaagggagaggagtgaagccggctgggtaccttggtgggggagaggaaagggtggaggaagaacaaagaggtgaggcgcctgctagtgattgcactgtaagcctaccgcgcgacattgctccaaagctacgctctcccaataaaggagaacttctagagagttgatatgaattaaagagattaccacagactcacatagtgcctgaggtattagccacatttcctttcatgcccttgccgaggggctttcctcggcgcctctcactttgggctttgcttcttcaaaggtggtgtttaggccgcaaagagtacaaccagtgtgttatgtgtgtgcactttcggtgtgttacaatttgccattattgcttgatgctttattactattcaaaatagtttctctttttccaagttgtcattttaacatagcattatagattttgtccttccgatttgcatgttttgatcgtctataacttagtttacataatggaagcacatcccagagagtaaattgatcatgagatcttgaccatgatgattctcctgtttttttccttgtacttacacataaaagttgtttcagttggaagatgtgcccctgtgttcgacaattggtcccaaaagtacgagtaaaaggtcgaacccagttcccacaaaggaaaataaaaggttgaagatgatgacaactgaagtggacaatatcgcgaacaaacaccaacagtttaattgcatgccaggagatagctctaaaactattgttcagcaagttccagacagggaaacatcatcagatgtggaaccgacattaatcattggaagggatgaagaaaaacataaaatattgtccattttatctgagagcaacgcagaagagatgaccatccttccaatatatggcatcggaggaattggcaagacaaccttggcacaattggtgttcaatgacatacagttccgggactactatcgggtgtgggtatatgtttctcagaagtttgacttaaagaaaattggcaactttataatatcacagttaacaaaagagaccagcgatatagatgaccagcagacacttcataatcgccttagacagctatttgctggtaagagtatccttattgttttagatgacctgtgggaggagaaacaacatgagttagagaaattgaaggctatgctaaggcttggcataggaaacaaggttgtcatagtaactacacgtgatgaagccattgcaaggaaaatcaacaggactgttatgccatacaagctagagattttaacagatgatatgtgctggtctataataaaacaaaaaagtttctttgaagatcgatgtgacaaagaacaattggggcagatcggaatggacattgcaatcaagtgtggaggtgtggctttggcggctcaatcacttgggtacatgttgagggagatggagtctgaccaatgggagtcagtgagggacagttatatctggaatctatctactatggaagatccatcattaagaaatcatgaagtgcttctgtccttgctgttaagctattcccatatgcatgaattcttgcagttatgcttttcctattgtgcattctttccaaaaggtcaaaatatagtgaagtatgatctaattcaccagtggatagctcttggattcaccggtccatctggaatatttgattctattcagctctgtgagaaatatattacacggcttttggggatgtcattccttcaatattcaaagacacgttcggtgagttactacatactctcgatgtcccaaaagatagctatgggtagtttcttcatgtcaaagagtccccttccagtactgctaggtgtcaggtttctagaaggccgctagggcatcttagatagggtcatagttatacactactcatcctcaaatgcatatgcctgtgcaattttcttttctagatgaccttctcgacaagctcgttgacatttatcctttttctttttcttttctttcccttgttttcaaccttacctttcaaatttccttttccaagaatgacattcaagtccataacctgatcgtggatatgggtcctactaaagccctttggagctcaatatttttcaactatttcattaaaatgaattcacatctataatcatcatttcttttgttatgtatgtatataaaacaatactaattattgttgaactaataaacacatcgttgattacctctaaacaaatttgaatgtcattaaatttgtcttcatattttttagtgggataagaccccaatccaacaggcgcccaaacaaatggacctatgtactgaaacgttgctgttgctggtgcatttgtagtgctgggtattaattttagcaggtttaagatgaaaaccactgcagatatttatcccaggcattatttcatttgatataagctttgaagtttacagatccatagtgtaatctactctggtgtaatttaaatatactgatccgttgcccattatcgagaaaacatacagctacggttacactcttttatagtgatacaaaagtatttctgttgataaaatatactactataaaacaaaataaattcaatattctaacaacattacgtggttttgctgcagagtgatgaacggcaggacaaagatgttaaaatgtttgtaatgcatgacctagtgcacgatcttgcaagagcaatattggctgataaagttaataaagagggtgatgctgtgggaagcagttgtcactatgcattgctcacagattgtagcaagccattgcagttgtctgttagttcaactgaatatagccggttcaatttttttcttagcctgtttaaaaagaagagttcacatgaaaatataaaggcgttacgttttctgaactgtggcaaagtactacttcgcggtgatgcattttcacctgccaagttcctccttgtcttagatctaagtgaatgctttattcagaagctctcacttgattcgattggacaactgaggcacttgagatatctttgtgctccacgggtcaacgattacacgattcccaactgtatcaccaagctctcagaattaacttacctcaaccttagaggctcttgtcgtatctcagcattgccagagtcaattggcgatatgaaaagtctgatgcatcttgatttatcaggctgctgtgacataattgaactcccagtatcatttgcgaagctgaaacagttggtgcatctagatttatcacactgtcacgtgtctgtatcagaagattttggtggctttaccaaacttcaatatttgaatttatcagttttgtttagttcttccaaggggcataggagaggactgctagaggtcattggcaatttaaagaaactcaggtatctaaatctatctcggtgcatggaggacatagccacatcagaaaaccaaattggcagtttgcttgactctatcagtaccctttccaaccttgagcatctggacttgtctgagaataaacagctttccagtataccagaaagtatgggcaacctcaggaagcttcatacattggacctcttaggctgctatcaactagagaagcttcctgatagtatgattaatatggttagcctgaaggttctaaatgtgggtaatttggttacactggatgaatctgtgctctctttgttaaatattgcctccttgccacactttgtggtgcatgcttcaagtggtaaatgtagcagcaatatcacccgtcttcaggctacaaatcctgatagactgattatagatagacttgaaaatgtcaaatctgcagaagaggcacataacataaaactgatagagaaacagaaaattgaaaccctacaatttgaatggactgtggctgctaggaggtttgtggatgacaaagaggtgttggaaaaactagtgccgccaagcagtgtcgacagtttgtgtataattggttatagaagtgtcagcattcctgattggcttctgggtattagtcagtatctccctaatcttgcgattataagtctggttaatttttctaagtgcaagaacctaccaccactcggtcaactaccaaacttacaatggctgactctcagcagtatggatggtttggaggagtggaacacgacatatactactggagagcaaggtagaaacgaactcttgttccctaagcttgagagattaaacatacatgactgtgccaagttgaggatagaaccatgtctgcctagagctttgtatttgcgcatacgagatagtaataatgtgctatcctcactcaatacaagagagcaagctgagagcacgctgccctcggacatagcacattgtgataatatgatatcagcatgcggaaagagttcgtcatacagcggtgcttcctcttcttctccaataactgatctgtttgtagaggaaagcaaactacccttgcatcagtggaggttgcttcaccaactccccgcgctccgtggtttacggatcaaacattgcagtgatctgaccacctcacttgctgttatccaaaaactctcctccctccaaaatttgagcctggagctcaacgaccatgaactgccgagttggttgattcagctgacagatctacaggaattaaagcttatgcattgcaatagcattacatcactaccacagtggtttggagaacttgcatctctcaagagaattgagatcaagtactgcaaggggatcagctctttgccggagagcatacaacaactgactaagcttgaatttctaagcattcatggctgtcctgtattagaggagtggtgtgaatcagaggagaacaagatgaagctcactcacatcaaagttgaggtatgtgcgtgcaagttatctgttgtattgcttttattctcgtgctggtagtgacttaatactcttttcttaaatggcaagtatacacatgccatgagtatctttacataatcatggtaagtgttgaattaggtgtatgtattttgtctattagatgcttcatgtgtctagattacttgacaaaaatatgtgacgactgcattaataattcgcctaagaagaaaagcattccagttgtgattgtgctatatcatgcacctatacatgcattgttctgattatatatcccgtttgcattgttcagatcgctggacgggattcggtaggctttgaggattcgaaggttcagattgtcaaaccaatgccagcacaaatggttcgccaatcagcatttgctactacagaacgaagatag(seqidno：35)实施例4-hilage.：燕麦单倍体诱导物方法：基于燕麦(avenasativa)hilage的方法如下进行：用标准的燕麦体内单倍体诱导进行的，使用与玉米花粉杂交来授粉去雄燕麦穗，组织培养中的胚拯救，以及随后的染色体加倍技术(例如参见rines，“来自宽杂交的燕麦单倍体(oathaploidsfromwidehybridization)”，于《作物中产生加倍单倍体：手册》(doublehaploidproductionincropplants：amanual)，maluszynski，kasha，forster和szarejko(编)，第155-159页，kluwer学术出版公司，荷兰多德雷赫特，2003)。简而言之，燕麦单倍体诱导的体内技术首先需要用玉米花粉授粉去雄燕麦穗，并在授粉后2天用2，4-d和50mg/l赤霉酸(ga3)处理。然后在授粉后14天，将发育中的燕麦胚从穗上去除并转移至组织培养。正在发育的胚按照rines(同上)描述的方法在组织培养中生长成幼苗。然后将幼苗进行染色体加倍并移植到土壤中以产生加倍的单倍体种子。核酸内切酶转基因和转基因构建体：基于燕麦hilage的方法将定向诱变组分添加到体内单倍体诱导系统，因此需要核酸内切酶。在燕麦hilage中，一个或多个玉米染色体携带能够在小麦基因组中引起靶向的双链断裂的核酸内切酶转基因。有用的核酸内切酶包括，例如，大范围核酸酶，zfn，tale核酸酶和crispr/cas基核酸内切酶系。核酸内切酶被设计为靶向asfad2a和asfad2b，但是核酸内切酶可以被设计成靶向几乎任何序列。核酸内切酶是使用诸如但不限于sander等(同上)，cermak等(同上)和liang等(同上)所述的那些方法构建的。用于驱动核酸内切酶表达的启动子是内源的或外源的。在去除携带核酸内切酶转基因的玉米染色体之前，核酸内切酶的高表达对于增加靶向的突变成功的机会是必不可少的。合适的启动子在胚发育早期表达，并且可以是内源的或外源的。示例示于表8。核酸内切酶构建体也可以包括可选择标记，例如赋予除草剂抗性的基因，以在整个植物转化和随后的回交过程中协助转基因的回收。当包括时，除草剂抗性选择标记由玉米和/或小麦中强表达的启动子驱动。在另一个实施方式，含有核酸内切酶的转基因构建体或组合成相同玉米品系的第二构建体含有一个或多个dna序列拷贝，其与位于靶位点或其侧翼的dna具有同源性。该dna序列可以含有核苷酸变化，如一个或多个碱基对取代，缺失和/或添加。或者，该序列可含有基因，启动子，调控序列和/或转基因。测试转基因燕麦中的核酸内切酶：虽然基于hilage的方法不使用转基因燕麦品系来产生具有靶向的突变的加倍单倍体燕麦的最终产物，但是在转基因燕麦品系中测试靶向的核酸内切酶构建体的功效可能是有益的，虽然不是必需的。燕麦转化可以按照诸如但不限于由zhang等(j.plantphysiol.148(6)：667-671，1996；和plantcellreports，18(12)：959-966，1999)描述的那些技术进行。使用类似于针对拟南芥所述的方法，可检测具有推定突变的转基因燕麦的靶向的突变。显示出引起双链断裂功效的核酸内切酶被用于基于燕麦hilage的方法。生成用于燕麦hilage的玉米品系：基于燕麦hilage的方法与燕麦中正常加倍单倍体产生之间的一个主要差异是转基因玉米品系而不是常规玉米品系用于单倍体诱导。如此，用核酸内切酶构建体转化玉米品系。可以使用几种方法将核酸内切酶转基因加入到单倍体诱导物中，所述方法例如但不限于：农杆菌方法(gasparis等，plantcellreports27(11)：1721-1729，2008)或通过粒子轰击(somers等，naturebiotechnol10(12)：1589-1594，1992)。由于用于玉米转化的品系可能不是多产的单倍体诱导物，尽管不是必要的，将核酸内切酶转基因回交到在燕麦单倍体诱导中显示出有效和高效率的遗传背景中可能是有益的。可以在分子标记的辅助下进行核酸内切酶转基因回交进入更合适的玉米品系以选择该转基因的存在以及选择轮回亲本的遗传背景(合适的玉米品系)和对抗供体亲本(最初转化的玉米品系)。根据选择用于驱动核酸内切酶的启动子，核酸内切酶可能在玉米品系中表现出不同于玉米-燕麦杂交后代中的表达。如果基因预期在玉米中表达，则评估核酸内切酶的rna和蛋白质表达以证实核酸内切酶有功能可能是有益的。突变的燕麦植物的基因分型：在移植到土壤之前或之后，将幼苗基因分型以鉴定(1)是否发生期望的靶向的突变，(2)燕麦植物是否不再含有玉米染色体(燕麦中的必要测试)，以及(3)转基因是否不再存在。如果除去玉米染色体，则不需要进行第三次测试，但由于当前市场对转基因燕麦具有显着阻力，所以确保去除转基因仍然可能是良好标准操作程序。此外，可能需要对潜在的不同分蘖进行基因分型，因为该植物可能针对一种或多种靶向突变或针对玉米染色体的存在是嵌合的。检查目标位点的突变可以按照之前针对拟南芥所述进行。玉米染色体的存在通过几种方法中的一种或多种来评估。例如，可以设计引物以扩增用于单倍体诱导的玉米品系中的10个玉米染色体中的每一个上的特定序列，并且这些引物可以用于确定玉米染色体是否仍然存在。或者，可以设计定制的snp芯片，其可以用于对燕麦品系和玉米dna进行基因分型。在已经丢失玉米染色体的燕麦植物中，燕麦snp能够被基因分型，但是玉米snp不能被基因分型。或者或另外地，可以利用低覆盖度全基因组测序方法或rna测序方法来确定玉米染色体是否存在和/或玉米基因是否正在表达。如果玉米染色体已经从燕麦植物中除去，转基因很可能已被除去。然而，为了提高基于hilage的方法的产业和消费者的接受度，对燕麦品系中转基因的缺失进行检测可能是有益的。在一种方法中，可以设计扩增部分或全部转基因构建体的引物，并用于测试构建体的任何部分是否在产生的燕麦品系中。或者，如果所述数据可用，则可以在全基因组序列或rna序列数据中搜索转基因的序列。燕麦hilage的利用：含有一种或多种核酸内切酶和/或crispr引导rna的玉米品系正在(作为花粉供体)与燕麦品系杂交以产生单倍体后代。在玉米染色体被消除之前，靶向的核酸内切酶在来自燕麦品系的dna中诱导靶向的dna双链断裂。其中一些双链断裂将被错误地修复，并导致突变。在后代筛选突变之前或之后，可将单倍体后代基因组加倍。一旦这些单倍体个体的基因组加倍，则个体可长成并自花授粉产生加倍的单倍体种子。可能产生不同的突变，并且评估每个突变事件以确定其是否具有期望的结果。只有符合em的系才能进展。在一些情况下，基于hilage的方法在所有(或许多)可用作育种亲本的燕麦品系上进行。如果使用在所有目标位点都具有em的品系开发种群，则种群不会分离em。因此，通过不必选择em的存在来简化育种工作。基于hilage的方法在燕麦中的优势：hilage的使用可在燕麦中产生靶向的突变中起到关键作用。全球范围内，燕麦中利用转基因仍存在阻力。基于hilage的方法可在燕麦中诱导靶向的突变，而释放的燕麦品系技术上没有与放入燕麦染色体中的转基因接触。另外，基于hilage的方法在燕麦中可能比在玉米中更有效，因为玉米染色体在玉米-燕麦胚中的持续时间可能比单倍体诱导物玉米染色体在玉米单倍体诱导物-常规玉米品系胚中的持续时间更长。玉米染色体存在于燕麦胚中的额外时间越长，越有可能发生靶向的突变。在表15a中提供了用于燕麦基因型筛选的示例性靶位点和方法，而表15b中提供了用于扩增靶位点的示例性引物。来自杂交的预期基因型分类显示在表16中。燕麦的靶基因-asfad2：靶寡核苷酸的序列如下(其中f1/r1用于靶1，f2/r2用于靶2)。asfad2f15′gattgggtgccggtggcaggatga3′(seqidno：36)r15′aaactcatcctgccaccggcaccc3′(seqidno：37)下划线表示20bp靶序列。表15a用于基因型筛选的方法和靶位点，靶1表15b用于扩增crispr靶位点的pcr引物，靶1和2：asfad2a和asfad2b基因靶asfad2正向引物5′-ttcgtcccgtcaacaagagg-3′(seqidno：39)反向引物5′-gtccgtcggcgagcgctgg-3′(seqidno：40)表16来自杂交的预期基因型类别由于由去雄燕麦与玉米花粉杂交形成燕麦单倍化的方法，不易出现自花授粉结果类别。如果燕麦被正确去雄，则不应发生自花授粉。如果在去雄过程中出现错误，燕麦种子可以自花授粉，那么该种子将比燕麦x玉米杂交生长得更有活力，并且种子可以很容易地筛选出来。由于燕麦和玉米染色体能够配对以及玉米染色体不能被遗传，b和c类是可能的，并且需要进行表型分型和基因分型以除去这些类别。asfad2(和周围序列)的推定共同序列(该序列通过比对推定编码fad2的燕麦毗连群来鉴定。燕麦毗连群通过在燕麦core数据库中搜索与大麦，水稻和玉米fad2(5′utr+编码)具有高度序列相似性的比对而发现。)atg起始加粗并带下划线。推定的fad2基因带下划线。实施例5-hilage：大麦，使用与球茎大麦(hordeumbulbosum)或玉米(zeamaize)的杂交单倍体诱导物方法：基于常规大麦(hordeumvulgare)hilage的方法如下进行：采用标准大麦体内单倍体诱导，使用与球茎大麦(hordeumbulbosum)或玉米系的杂交，胚拯救技术和随后的染色体加倍技术，例如但不限于那些由kasha和kao(nature225：874-876，1970)，chen和hayes(theor.appl.genet.77：701-704，1989)，chen等(genome34：603-605，1991)，laurie和bennett(“小麦x玉米，小麦x高粱和大麦x玉米杂交中的染色体表现(chromosomebehaviorinwheatxmaize，wheatxsorghumandbarleyxmaizecrosses)”，于《kew染色体会议论文集iii》(kewchromosomeconferenceproceedingsiii)，brandham(编)，英国诺里奇：thestationeryofficebooks，第167-177页，1988)等描述的那些。简而言之，大麦单倍体诱导的体内技术首先需要在常规大麦(hordeumvulgare)和单倍体诱导系，球茎大麦(hordeumbulbosum)或玉米之间进行杂交。在基于hilage的方法中，单倍体诱导贮存系可能被用作雄性，因为对于大麦单倍体诱导方法，使用球茎大麦(hordeumbulbosum)或玉米作为花粉供体，而雌性是常规大麦(hordeumvulgare)。大麦单倍体诱导的体内技术首先需要将常规大麦(hordeumvulgare)植物去雄，然后通过球茎大麦(hordeumbulbosum)或玉米(单倍体诱导物系)授粉。正在发育中的大麦胚从穗上去除并转移到组织培养中。发育中的胚在组织培养中生长成幼苗，染色体加倍，并且生长成熟以产生加倍的单倍体种子，按照例如kasha和kao(同上)描述的方法。核酸内切酶转基因和转基因构建体：基于大麦hilage的方法将定向诱变组分添加到体内单倍体诱导系统，因此需要核酸内切酶。核酸内切酶是使用诸如sander等(同上)，cermak等(同上)和liang等(同上)所述的那些方法构建的。合适的核酸内切酶的示例包括但不限于大范围核酸酶，zfn，tale核酸酶和crispr/cas基核酸酶。核酸内切酶被设计为靶向vrs1，但是核酸内切酶可以被设计成靶向几乎任何序列。用于驱动核酸内切酶表达的启动子是内源的或外源的。核酸内切酶的高表达在发育中的胚的有丝分裂的最初几个阶段是必需的。合适的启动子在胚发育早期表达，并且可以是内源的或外源的。示例示于表8。核酸内切酶构建体还可以包括可选择标记，例如除草剂抗性，以在整个植物转化和随后的回交过程中协助转基因的回收。基于hilage的方法不需要选择标记，因此，在另一个实施方式中，核酸内切酶构建体在转化期间不具有用于回收的选择标记。在另一个实施方式，含有核酸内切酶的转基因构建体或组合成相同大麦品系的第二构建体含有一个或多个dna序列拷贝，其与位于靶位点或其侧翼的dna具有同源性。该dna序列可以含有核苷酸变化，如一个或多个碱基对取代，缺失和/或添加。或者，该序列可含有基因，启动子，调控序列和/或转基因。测试转基因大麦中的核酸内切酶：虽然不是必需的，但是测试转基因大麦系中靶向的核酸内切酶构建体的功效可能是有益的。大麦转化根据例如但不限于tingay等(plantj.，11(6)：1369-1376，1997)和travella等(plantcellreports，23(12)：780-789，2005)描述的那些技术进行。使用类似于本文针对拟南芥所述的方法，也可检测具有推定突变的转基因大麦的靶向的突变。显示出引起双链断裂功效的核酸内切酶被用于基于大麦hilage的方法。核酸内切酶转基因向单倍体诱导物的基因渗入：基于大麦hilage的方法中的下一步是向球茎大麦(hordeumbulbosum)或玉米单倍体诱导系添加转基因核酸内切酶基因。可以使用几种方法将核酸内切酶转基因加入到单倍体诱导物中。一种方法涉及单倍体诱导物的直接转化以添加转基因，例如使用tingay等(同上)，travella等(同上)和ishida等(如上)所述的农杆菌方法，或travella等(同上)和gordon-kamm等(同上)所述的粒子轰击。或者，可首先用核酸内切酶转基因转化适于转化的系，然后将该系和核酸内切酶转基因可与单倍体诱导系杂交。从该杂交中筛选出f1二倍体后代，并且这些个体可能回交至单倍体诱导系。这个回交过程可重复数次以回收大部分单倍体诱导物的遗传学，并加入核酸内切酶转基因。在完成足够数量(例如2，3或4次)的回交后，可将所得回交植物(3次回交后的bc3f1)自花授粉以产生bc3f2个体。可筛选bc3f2个体以发现在遗传上与单倍体诱导系非常相似并且对于核酸内切酶转基因纯合的个体。在第二种方法中，可以使用分子标记物来选择含有转基因并含有高百分比的单倍体诱导物基因组的回交个体。这些选择的个体可以用于下一轮回交，以通过添加核酸内切酶转基因更快地恢复单倍体诱导物的基因组。作为单倍体诱导系并且含有核酸内切酶转基因的所得系被称为单倍体诱导贮存系。测试核酸内切酶转基因的表达：在直接转化或用另一系转化之后进行回交，进行若干测试以评价单倍体诱导物贮存系中的核酸内切酶表达。或者，在回交之前或同时进行表达测试以选择高表达的转基因事件。具体而言，进行从核酸内切酶转基因表达的rna和蛋白质的表达测定以确保转基因正确表达。基于hilage的方法需要具有更高表达的转化事件。转基因和转化事件的功效可以另外通过确定是否在所述系的靶位点中检测到突变来评估。可如本文所述对拟南芥评估突变的存在。具有高基因表达和靶位点中存在突变的事件可以与靶向的系异交，以确定是否产生了具有突变的单倍体后代。期望的单倍体诱导物-转基因事件组合产生高频率和数量的具有靶向突变的单倍体后代。大麦hilage的利用：球茎大麦(hordeumbulbosum)或玉米单倍体诱导物作为雄性与常规大麦(hordeumvulgare)杂交以产生单倍体后代。在后代筛选突变之前或之后，可将单倍体后代基因组加倍。一旦这些单倍体个体的基因组加倍，则个体可长成并自花授粉产生加倍的单倍体种子。由于植物可能对于一个或多个靶向的突变是嵌合的，所以可能有必要对每个植物的多个分蘖进行基因型分型。可能产生不同的突变，并且需要评估每个突变事件以确定所获得的突变是否具有期望的结果。产生期望表型的em(例如，引起移码并消除适当的基因功能的突变)被进展。在一些实施方式中，基于hilage的方法在所有(或许多)可用作育种亲本的大麦品系上进行。如果使用在所有目标位点都具有em的品系开发种群，则种群不会分离em。因此，通过不必选择em的存在来简化育种工作。在表17a中提供了用于燕麦基因型筛选的示例性靶位点和方法，而表17b中提供了用于扩增靶位点的示例性引物。来自与球茎大麦(hordeumbulbosum)杂交的预期基因型类别示于表18a中，并且来自与玉米杂交的预期基因型类别示于表18b中。大麦的靶基因-vrs1(baf43315.1)：靶寡核苷酸的序列如下(其中f1/r1用于靶1，f2/r2用于靶2)。大麦vsr1基因f15′gattggcggaggggatggtgacgg3′(seqidno：42)r15′aaacccgtcaccatcccctccgcc3′(seqidno：43)下划线表示20bp靶序列。表17a用于基因型筛选的方法和靶位点，靶1表17b用于扩增crispr靶位点的pcr引物，靶1基因靶：大麦vrs1正向引物5′-tccaacgtggacacgacttt-3′(seqidno：45)反向引物5′-gaggtggcatttgtggagga-3′(seqidno：46)表18a：来自杂交的预期基因型类别：vrs1核酸内切酶靶(球茎大麦(hordeumbulbosum)单倍体诱导物)单倍体诱导贮存系是雄性。来自组织培养的大多数再生植物是单倍体(＞95％)，种间杂合(来自常规大麦(hordeumvulgare)和球茎大麦(hordeumbulbosum)杂交的二倍体植物)可以通过它们的异常生长习性和叶鞘上存在的短柔毛(来自球茎大麦(hordeumbulbosum)亲本的特征)来识别(devaux，“球茎大麦(l.)方法(thehordeumbulbosum(l.)method)”，于《作物中产生双倍体：手册》(doublehaploidproductionincropplants：amanual)，maluszynski，kasha，forster和szarejko(编)，第15-19页，荷兰多德雷赫特：kluwer学术出版公司)。表18b：来自杂交的预期基因型类别：vrs1核酸内切酶靶(玉米单倍体诱导物)单倍体诱导贮存系是雄性。来自组织培养的大多数再生植物是单倍体(＞90％)(chen等，同上)常规大麦亚种vulgarevrs1基因亮氨酸拉链蛋白vrs1，完整的cds，等位基因：vrs1.b.genbank：ab259782.1。翻译起始位点加下划线，外显子序列加粗。实施例6-hilage：黑小麦单倍体诱导物方法：基于黑小麦(×黑小麦(triticosecalewittm))hilage的方法如下进行：利用与玉米花粉杂交的黑小麦体内单倍体诱导，以对去雄黑小麦授粉，组织培养中的胚拯救以及随后的染色体加倍技术，例如但不限于由wedzony等(“影响通过与玉米杂交的方式产生黑小麦加倍单倍体的因素(factorsinfluencingtriticaledoubledhaploidproductionbymeansofcrosseswithmaize)”于《第四届国际黑小麦研讨会论文集》(proceedingsofthe4thinternationaltriticalesymposium)，加拿大红鹿，卷1.juskiw(编)国际黑小麦协会，加拿大阿尔伯塔，第45-52页，1998；和plantbreed.117：211-215，1998)，wedzony(“通过与玉米杂交在六倍体黑小麦中产生加倍单倍体的方案(protocolfordoubledhaploidproductioninhexaploidtriticale(xtriticosecalewittm.)bycrosseswithmaize)”于《作物中产生加倍单倍体：手册》(doublehaploidproductionincropplants：amanual)，maluszynski，kasha，forster，和szarejko(编)，第135-140页，kluwer学术出版公司，荷兰多德雷赫特，2003)等所述的那些。简而言之，黑小麦单倍体诱导的体内技术首先需要用玉米花粉授粉去雄黑小麦穗，并在授粉后1-2天用麦草畏(3，6-二氯-2-甲氧基苯甲酸)处理。然后(在授粉后18-21天)，将发育中的黑小麦胚从穗上去除并转移至组织培养。最终将植物移植到温室中，并用秋水仙碱处理以使染色体数量加倍，并收获加倍的单倍体种子。核酸内切酶转基因和转基因构建体：基于黑小麦hilage的方法将定向诱变组分添加到体内单倍体诱导系统，因此需要核酸内切酶。合适的核酸内切酶的示例包括但不限于大范围核酸酶，zfn，tale核酸酶和crispr/cas基核酸酶。核酸内切酶被设计为靶向tsn1，但是核酸内切酶可以被设计成靶向几乎任何序列。tsn1基因在小麦5bl染色体上被引入黑小麦。因此，下文所述的tsn1crispr/cas靶位点，引物等的描述与用于如本文所述的小麦中靶向tsn1的描述相同。核酸内切酶是使用诸如但不限于sander等(同上)，cermak等(同上)和liang等(同上)所述的那些方法构建的。用于驱动核酸内切酶表达的启动子是内源的或外源的。在去除携带核酸内切酶转基因的玉米染色体之前，核酸内切酶的高表达对于增加靶向的突变成功的机会是必不可少的。合适的启动子在胚发育早期表达，并且可以是内源的或外源的。示例示于表8。核酸内切酶构建体还可以包括可选择标记，例如除草剂抗性，以在整个植物转化和随后的回交过程中协助转基因的回收。当存在时，除草剂抗性选择标记由玉米和/或黑小麦中强表达的启动子驱动。然而，基于hilage的方法不需要选择标记。在一些实施方式中，含有核酸内切酶的转基因构建体或组合成相同玉米品系的第二构建体含有一个或多个dna序列拷贝，其与位于靶位点或其侧翼的dna具有同源性。该dna序列可以含有核苷酸变化，如一个或多个碱基对取代，缺失和/或添加。或者，该序列可含有基因，启动子，调控序列和/或转基因。测试转基因黑小麦中的核酸内切酶：虽然基于hilage的方法不使用转基因黑小麦品系来产生具有靶向的突变的加倍单倍体黑小麦的最终产物，但是在转基因黑小麦或转基因小麦品系中测试靶向的核酸内切酶构建体的功效可能是有益的，虽然不是必需的。黑小麦转化按照如下技术进行，例如但不限于zimny等(molecularbreeding，1(2)：155-164，1995)所述的那些。小麦转化是根据如weeks等所述的技术进行的(plantphysiol.102(4)：1077-1084，1993)。使用类似于本文针对拟南芥所述的那些方法，可检测具有推定突变的转基因黑小麦的靶向的突变。显示出引起双链断裂功效的核酸内切酶被用于基于黑小麦hilage的方法。产生用于黑小麦hilage的玉米品系：基于黑小麦hilage的方法与黑小麦中正常加倍单倍体产生之间的一个主要差异是转基因玉米品系而不是常规玉米品系用于单倍体诱导。如此，用核酸内切酶构建体转化玉米品系。使用几种方法将核酸内切酶转基因加入单倍体诱导物中，所述方法包括基于农杆菌的方法(如由ishida等，同上描述的那些方法)或通过粒子轰击(例如gordon-kamm等，同上描述的那些方法)。由于用于玉米转化的品系可能不是多产的单倍体诱导物，尽管不是必要的，将核酸内切酶转基因回交到先前在黑小麦单倍体诱导中显示出高效力的遗传背景中可能是有益的。可以在分子标记的辅助下进行转基因回交进入更合适的玉米品系以选择核酸内切酶转基因的存在以及选择轮回亲本的遗传背景(合适的玉米品系)和对抗供体亲本(最初转化的玉米品系)。根据选择用于驱动核酸内切酶的启动子，核酸内切酶可能在玉米品系中表现出不同于玉米-黑小麦杂交后代中的表达。如果基因预期在玉米中表达，则评估核酸内切酶的rna和蛋白质表达以证实核酸内切酶有功能可能是有益的。推定的突变的黑小麦植物的基因分型：在移植到土壤之前或之后，将幼苗基因分型以鉴定(1)是否发生期望的靶向的突变，(2)黑小麦植物是否不再含有玉米染色体，以及(3)转基因是否不再存在。此外，可能需要对潜在的不同分蘖进行基因分型，因为该植物可能针对一种或多种靶向突变是嵌合的。评价目标位点的突变存在的试验可以按照在本文的拟南芥部分所述进行。玉米染色体的存在可以通过几种方法中的一种或多种来评估。可以设计引物以扩增用于单倍体诱导的玉米品系中的10个玉米染色体中的每一个上的特定序列，并且这些引物可以用于确定玉米染色体是否仍然存在。或者，可以设计定制的snp芯片，其可以用于对黑小麦品系和玉米dna进行基因分型。在已经丢失玉米染色体的黑小麦植物中，黑小麦snp能够被基因分型，但是玉米snp不能被基因分型。或者或另外地，可以利用低覆盖度全基因组测序方法或rna测序方法来确定玉米染色体是否存在和/或玉米基因是否正在表达。如果玉米染色体已经从黑小麦植物中除去，转基因很可能已被除去。然而，为了提高基于hilage的方法的产业和消费者的接受度，对黑小麦品系中转基因的缺失进行检测可能是有益的。在一种方法中，可以设计扩增部分或全部转基因构建体的引物，并用于测试构建体的任何部分是否在产生的黑小麦品系中。或者，如果所述数据可用，则可以在全基因组序列或rna序列数据中搜索转基因的序列。黑小麦hilage的利用：含有一种或多种核酸内切酶和/或crispr引导rna的玉米品系正在(作为花粉供体)与黑小麦品系杂交以产生单倍体后代。在玉米染色体被消除之前，靶向的核酸内切酶在来自黑小麦品系的dna中诱导靶向的dna双链断裂。其中一些双链断裂将被错误地修复，并导致突变。在后代筛选突变之前或之后，可将单倍体后代基因组加倍。一旦这些单倍体个体的基因组加倍，则个体可长成并自花授粉产生加倍的单倍体种子。可能产生不同的突变，并且需要评估每个突变事件以确定所获得的突变是否具有期望的结果。只有产生所需表型的em才被进展。在一些实施方式中，基于hilage的方法在所有(或许多)可用作育种亲本的黑小麦品系上进行。如果使用在所有目标位点都具有em的品系开发种群，则种群不会分离em。因此，通过不必选择em的存在来简化育种工作。hilage在黑小麦中的优势：hilage可在黑小麦中产生靶向的突变中起到关键作用。全球范围内，黑小麦中利用转基因仍存在阻力。基于hilage的方法可在黑小麦中诱导靶向的突变，而释放的黑小麦品系技术上没有与放入黑小麦染色体中的转基因接触。另外，基于hilage的方法在黑小麦中可能比在玉米中更有效，因为玉米染色体在玉米-黑小麦胚中的持续时间可能比单倍体诱导物玉米染色体在玉米单倍体诱导物-常规玉米品系胚中的持续时间更长。玉米染色体存在于黑小麦胚中的额外时间越长，越有机会发生靶向的突变。在表19a中提供了用于燕麦基因型筛选的示例性靶位点和方法，而表19b中提供了用于扩增靶位点的示例性引物。来自杂交的预期基因型分类显示在表20中。黑小麦(小麦)的靶基因-tsnl：靶寡核苷酸的序列如下(其中f1/r1用于靶1，f2/r2用于靶2)：tsn1基因f15′gattgccgctagggcatcttagat3′(seqidno：30)r15′aaacatctaagatgccctagcggc3′(seqidno：31)下划线表示20bp靶序列。表19a用于基因型筛选的方法和靶位点，靶1*faris等，proc.natl.acad.sci.usa107(30)：13544-13549，2010.表19b用于扩增crispr靶位点的pcr引物，靶1表20来自杂交的预期基因型类别：靶向tsn1的核酸内切酶由于去雄黑小麦穗与玉米花粉杂交形成的黑小麦单倍化方法，几种植物结果是不可能的。如果黑小麦被正确去雄，则不应发生自花授粉。如果在去雄过程中出现错误，并且黑小麦种子可以自花授粉，那么该种子将比黑小麦x玉米杂交生长得更有活力，并且种子可以很容易地筛选出来。由于黑小麦和玉米染色体不能配对以及玉米染色体不能被遗传，所以b和c类是不可能的。因此，预期只能产生d和e类。黑小麦(小麦)tsn1和周围序列(登录号gu259618)atgactacaccaatgagtataccgttcgcaactttggaaaagattacaaatgggttctcaaacgatttaataattggaaggggtgggtatggaaacgtttacaaggtatggcttaatacttgatatttccttttttcagcaaatgttcaggctataaacaaataatttaagtgcaataattatgtcaagcaggcagtttacaaaggggaagtgattgctgtgaagttgcttcatgatgatctggtgcaattacttgatgacagacaatttaaaaatgaactttttaaccttttgagggttgagcatccgaatattgtttgcttacgtggttattgttatgaaacacggtataaaattgttaagcacaatggtgagacagtctttggtaaacatatacacagagttctctgctttgaatacttggagggtggaagcctagacaatcatcttcatggtacgatggaacttcaaaatacagttattttgttttacgtttaaaggaaactgatttctcatttacatacatactctttgttaacttgcgtagcaccatctttgccacctaactggaccacacgttacaataccataaaggggatttgtgaaggcttaaatttccttcacggatgtcaaccaccaattttgcatcttgatctgaagcctgccaatatattagtagacagttccatggtgcctaaactggcggattttggattgtcaaagctcttccatggatcacatactcatgtgacaaaacaaatcataggaacccagtaagcggaagcgacccgtggattgtctcgttctgaattttctttcttttgtgatcaaataaatagtatgtacagttctgtactaactgtgtctttgtatcacgcaggaagtacatgccaccggaattcatcaaagatggcaagatctcggttaaaaatgatgtctttagtttgggtattgtgatcatagaaataatggcaggacctatgggttattcagaattttcagaaatgggcagcggtgcacaatttgtgaaggaggtaataaaaaaaactcaagtttgacacccgagttcgtataaataacaaactaccacaccaagaatttgatgtctaatgtgtgagccattataatcgttgaactgagtttatgacaggaccggcagtaataaaaaatatagcaacactcccccacacaatatattgagcatagaagatacaacttatctagctataacaaaataataatccagaaaagtagccatttttttttccggacaggattgaggtccaccagtccaataactatgaagcagctcgctgatagaaaattccaaggtacaattatttttgtaagtttctccttatcacgtgtgaaacaccaatgtaataaagctgataaaccaaacgtacccactatgagaactgcatacactgagactcgaagaaaagaacaaatgcatatctagaaccttgctccatgggatatctagaaccttgctccatgggatctagcaccatctccattttggagcaagcacgaggtgcgtatcgtaatctttttctgctagatgcagacttagacacccagtattctctaggtaaattatttatctggaaagtcgtaggtaacacttgtgaacaaggatatagcgtacatatatatgggagcatttgtgttatgtgacacttttgacttaattgcaaatattatgttatgtgaagactcaagagtgtttttgaacaagtatcgtacatattgtaccgaaaaaggctttcgccccgctttatattataaagcacatgcccaagccaacaaaccacacaggttcacaaacacacgcagacccacacacaccaagttcacacacagacaagatccacaagggttaatgctgagggcacagcttaacaagccctagaacaaaaaggaaagacaccatctagtcgggctccggggggggggggggggggggcggcggaagtggaggcgccaggcggaaggcgagcgatcgaaggtcggcgaggagggtgttgatgatgtcccgatcctgagggcggctaagcggccgccaaagctgcaagtacccacacattttaaaaatggcgtcagtagcgcgtcgtagagggactttttggatgacaagcttattgcggacggtccacagcgtccagccgagaaccccaacgcataaccaacggatatgtcggtggcgtggggggggaggcgtggatttccgcgaggaggtcggggaagttggagttgcaccactatccgccaaccgtctcacggaaactggaccaaagaaactggccgcagggcacgtgaagaagatgtggttagcatcctccgcagtgccgcacaaggggcaaagcccatccccgggtccgttgcgcttgaggacttcgacaccggaggggaggcggccacgaatccactgccaaaggaagatcctaatcttcagaggtaagcgaatgtcccagatcagagcaaagggctcgggcgcgggcgaaggcgcaatagccgcgtacatgacctagtagagaaacgaccggaggactctaggcgccacgagatggcgtccggggcgtcggtgacgctcatcggaagaagggcgatgtcctggaggagggaatcccaggcggccacttcggggggaccgaaaggacgacgaaacgcgaggcgccctaagtcaataagggccgtctcgacagagacccgagggtcaaccgcaatggtgaagagatcgggaaagcgggcggccagaggggtgtcaccgagccaccgatcaaaccagaacagggtcgcggacccagtaccaatcgaaatggacgtgccgatacgaagcacaggaagcagccgcacgacggcctgccaaaactgtgatccgcccgaacgctgacagaaagccagaggctggccacggaggtatttgttgcggataatggtgagccacaaccctccgtcaccattggcaatacgccacaaccaccgggtcaggagggcgatgttcattcggcgggaggacagaatctcaagacccccctggtctttaggtttacaaatgtccggccaagtcaccatgtggtacttctgtttgtcatcgtcgccagcccaatagaacctggattggtacttggcaatttccgtgtgcagcgtttcatggaggctataaaagctcatgaggaaccaaaggagactggcgagtgaggagttgatgaggatcacccgcgccgcctttgatagccaacgccctttccaaggttcgacgcggtgttgcatacgggtcaccgtagggtggaggtccgccacggtgaggcgcgagtcactaacggggatccccaggtaggtcgtggggaaggaccctagccgacagttcaggcgatcagcaatatcctgagcctcctccggagggtatccaaggaccatcacctcgctcttatcaaagttaatcgtaaggcccgacatctgctggaagcacaggaggaggaacttcaggttagcaacatcctgatttgaaccttccaccattattatggtgtcgttcgcgtattgcaggagggagacccctccccctccaactaggtgagggacaatgccgtggatatggccagcacccttagccttatccaggatggcggccagagcatcgaccaccatgttgaacaggaacggcgagaatgggtctcctgacagaccccacagagggtggggaagtatggcccaatctcgccgttaatgttcaccgccgtctttccacatgaaactgattgcatcacgcgggtcacccagcggtcatcaaagcccttacgcagcagtacttcccgaaggaagggccagtgaacagtatcataggctttatggaagtcaagcttcaggaacacagcacgaagatgcttcacccggacctcgtgaaggacttcatggaataccaacacgccatcaagaataaaccggccttggatgaaggccgattggttcgggtgagtgatcgaatcagccagcagggtcaccctattggcgtaccctttggccaggatccgaaaaatcacgttaatcaccgtgatggggcggaactggcgaatatcagaggcacccggaacctttgggatgagggtaatgatcccatagttgaggcgtcccaggtccatcgaacccgaatagaactcctcgaacaaagccatgacctccggtttgaccgcctgccagaatgttttaaagaaagcaacaggcaggccatccgggcctggggccgaggcggggttcatgcctttaatggccgcgagcacctcgtcctcggcgaagggagcaaccagggccgcattggcctcgccgggaaccaactgcgcccccgtccaagtatcgggggcatcgtacatattgttatatgctccatctctaattgtatctctatatttcggttttgtaggtacttaccaattggagtactatcattaaagctacatcagagtatccagcagaggaactacatcaagtgaatttgtgcatcgacatagcaatgctttgtgtggattctgaaagagtcaatagacccaccatagctggtatcctagatgcattgaataggacaaaaactcatatgccctcctctacgaaaaaaactcatattccctggggacaggtatgatttgcatacttgcaaacaaaatgaaatctcgagtatatatttgcaatctgtagaagacagttgcttggatatatggaccactaagtagttatagagtttgcagctccccgtctcccactcattttattctcaatcaagtagttctttaatagtcaggaacttgcttactgcatccttttgactccctgctctataatccatgtagaagaaccttcattttagttccggctaattccaggaatagaaaactagagagggcctattcgtaatcgtgccttccggagtgacaggctaagtgaagggcagggggatgctgccctcgacaaccgtggctgtgattggcactgtcgtgctcatacgaggtaccagacggtgtagaagttaacctagttgattaatcttaggtgtggtcatgctagatagctatatgaaagagccatacatgtagttcaagtagtgcatgcaagattccaacattcaaaatcgtgccttgtactatggaaggggaaagggaggggtaacacgtaatgagtgccctataagccttacacaatagctttatcagaccactgtggcgccctaactgacgccaacagaggtagctgcaatggttcgatgagatagcggtgagagagaaggggcagggggacattggtggcaggtgtaagggaaaaagggagaggagtgaagccggctgggtaccttggtgggggagaggaaagggtggaggaagaacaaagaggtgaggcgcctgctagtgattgcactgtaagcctaccgcgcgacattgctccaaagctacgctctcccaataaaggagaacttctagagagttgatatgaattaaagagattaccacagactcacatagtgcctgaggtattagccacatttcctttcatgcccttgccgaggggctttcctcggcgcctctcactttgggctttgcttcttcaaaggtggtgtttaggccgcaaagagtacaaccagtgtgttatgtgtgtgcactttcggtgtgttacaatttgccattattgcttgatgctttattactattcaaaatagtttctctttttccaagttgtcattttaacatagcattatagattttgtccttccgatttgcatgttttgatcgtctataacttagtttacataatggaagcacatcccagagagtaaattgatcatgagatcttgaccatgatgattctcctgtttttttccttgtacttacacataaaagttgtttcagttggaagatgtgcccctgtgttcgacaattggtcccaaaagtacgagtaaaaggtcgaacccagttcccacaaaggaaaataaaaggttgaagatgatgacaactgaagtggacaatatcgcgaacaaacaccaacagtttaattgcatgccaggagatagctctaaaactattgttcagcaagttccagacagggaaacatcatcagatgtggaaccgacattaatcattggaagggatgaagaaaaacataaaatattgtccattttatctgagagcaacgcagaagagatgaccatccttccaatatatggcatcggaggaattggcaagacaaccttggcacaattggtgttcaatgacatacagttccgggactactatcgggtgtgggtatatgtttctcagaagtttgacttaaagaaaattggcaactttataatatcacagttaacaaaagagaccagcgatatagatgaccagcagacacttcataatcgccttagacagctatttgctggtaagagtatccttattgttttagatgacctgtgggaggagaaacaacatgagttagagaaattgaaggctatgctaaggcttggcataggaaacaaggttgtcatagtaactacacgtgatgaagccattgcaaggaaaatcaacaggactgttatgccatacaagctagagattttaacagatgatatgtgctggtctataataaaacaaaaaagtttctttgaagatcgatgtgacaaagaacaattggggcagatcggaatggacattgcaatcaagtgtggaggtgtggctttggcggctcaatcacttgggtacatgttgagggagatggagtctgaccaatgggagtcagtgagggacagttatatctggaatctatctactatggaagatccatcattaagaaatcatgaagtgcttctgtccttgctgttaagctattcccatatgcatgaattcttgcagttatgcttttcctattgtgcattctttccaaaaggtcaaaatatagtgaagtatgatctaattcaccagtggatagctcttggattcaccggtccatctggaatatttgattctattcagctctgtgagaaatatattacacggcttttggggatgtcattccttcaatattcaaagacacgttcggtgagttactacatactctcgatgtcccaaaagatagctatgggtagtttcttcatgtcaaagagtccccttccagtactgctaggtgtcaggtttctagaaggccgctagggcatcttagatagggtcatagttatacactactcatcctcaaatgcatatgcctgtgcaattttcttttctagatgaccttctcgacaagctcgttgacatttatcctttttctttttcttttctttcccttgttttcaaccttacctttcaaatttccttttccaagaatgacattcaagtccataacctgatcgtggatatgggtcctactaaagccctttggagctcaatatttttcaactatttcattaaaatgaattcacatctataatcatcatttcttttgttatgtatgtatataaaacaatactaattattgttgaactaataaacacatcgttgattacctctaaacaaatttgaatgtcattaaatttgtcttcatattttttagtgggataagaccccaatccaacaggcgcccaaacaaatggacctatgtactgaaacgttgctgttgctggtgcatttgtagtgctgggtattaattttagcaggtttaagatgaaaaccactgcagatatttatcccaggcattatttcatttgatataagctttgaagtttacagatccatagtgtaatctactctggtgtaatttaaatatactgatccgttgcccattatcgagaaaacatacagctacggttacactcttttatagtgatacaaaagtatttctgttgataaaatatactactataaaacaaaataaattcaatattctaacaacattacgtggttttgctgcagagtgatgaacggcaggacaaagatgttaaaatgtttgtaatgcatgacctagtgcacgatcttgcaagagcaatattggctgataaagttaataaagagggtgatgctgtgggaagcagttgtcactatgcattgctcacagattgtagcaagccattgcagttgtctgttagttcaactgaatatagccggttcaatttttttcttagcctgtttaaaaagaagagttcacatgaaaatataaaggcgttacgttttctgaactgtggcaaagtactacttcgcggtgatgcattttcacctgccaagttcctccttgtcttagatctaagtgaatgctttattcagaagctctcacttgattcgattggacaactgaggcacttgagatatctttgtgctccacgggtcaacgattacacgattcccaactgtatcaccaagctctcagaattaacttacctcaaccttagaggctcttgtcgtatctcagcattgccagagtcaattggcgatatgaaaagtctgatgcatcttgatttatcaggctgctgtgacataattgaactcccagtatcatttgcgaagctgaaacagttggtgcatctagatttatcacactgtcacgtgtctgtatcagaagattttggtggctttaccaaacttcaatatttgaatttatcagttttgtttagttcttccaaggggcataggagaggactgctagaggtcattggcaatttaaagaaactcaggtatctaaatctatctcggtgcatggaggacatagccacatcagaaaaccaaattggcagtttgcttgactctatcagtaccctttccaaccttgagcatctggacttgtctgagaataaacagctttccagtataccagaaagtatgggcaacctcaggaagcttcatacattggacctcttaggctgctatcaactagagaagcttcctgatagtatgattaatatggttagcctgaaggttctaaatgtgggtaatttggttacactggatgaatctgtgctctctttgttaaatattgcctccttgccacactttgtggtgcatgcttcaagtggtaaatgtagcagcaatatcacccgtcttcaggctacaaatcctgatagactgattatagatagacttgaaaatgtcaaatctgcagaagaggcacataacataaaactgatagagaaacagaaaattgaaaccctacaatttgaatggactgtggctgctaggaggtttgtggatgacaaagaggtgttggaaaaactagtgccgccaagcagtgtcgacagtttgtgtataattggttatagaagtgtcagcattcctgattggcttctgggtattagtcagtatctccctaatcttgcgattataagtctggttaatttttctaagtgcaagaacctaccaccactcggtcaactaccaaacttacaatggctgactctcagcagtatggatggtttggaggagtggaacacgacatatactactggagagcaaggtagaaacgaactcttgttccctaagcttgagagattaaacatacatgactgtgccaagttgaggatagaaccatgtctgcctagagctttgtatttgcgcatacgagatagtaataatgtgctatcctcactcaatacaagagagcaagctgagagcacgctgccctcggacatagcacattgtgataatatgatatcagcatgcggaaagagttcgtcatacagcggtgcttcctcttcttctccaataactgatctgtttgtagaggaaagcaaactacccttgcatcagtggaggttgcttcaccaactccccgcgctccgtggtttacggatcaaacattgcagtgatctgaccacctcacttgctgttatccaaaaactctcctccctccaaaatttgagcctggagctcaacgaccatgaactgccgagttggttgattcagctgacagatctacaggaattaaagcttatgcattgcaatagcattacatcactaccacagtggtttggagaacttgcatctctcaagagaattgagatcaagtactgcaaggggatcagctctttgccggagagcatacaacaactgactaagcttgaatttctaagcattcatggctgtcctgtattagaggagtggtgtgaatcagaggagaacaagatgaagctcactcacatcaaagttgaggtatgtgcgtgcaagttatctgttgtattgcttttattctcgtgctggtagtgacttaatactcttttcttaaatggcaagtatacacatgccatgagtatctttacataatcatggtaagtgttgaattaggtgtatgtattttgtctattagatgcttcatgtgtctagattacttgacaaaaatatgtgacgactgcattaataattcgcctaagaagaaaagcattccagttgtgattgtgctatatcatgcacctatacatgcattgttctgattatatatcccgtttgcattgttcagatcgctggacgggattcggtaggctttgaggattcgaaggttcagattgtcaaaccaatgccagcacaaatggttcgccaatcagcatttgctactacagaacgaagatag(seqidno：35)实施例7-hilage-hr为了进行hilage-hr，产生核酸内切酶以在特定序列中产生双链断裂。最初的研究利用靶向玉米bm3zeammb73_595664的核酸内切酶，使用与上述相同的crispr靶序列：f15′gattgggctccaccgccggcgacg3′(seqidno：19)r15′aaaccgtcgccggcggtggagccc3′(seqidno：20)下划线表示20bp靶序列。供体模板由三个dna片段组成，依次合成单个片段。第一个片段是与靶位点上游序列同源的dna序列，其大小范围可以从10个核苷酸到1，000个或更多个核苷酸。第二个片段是序列gggcccggcgacg(seqidno：49)，其含有相对于野生型的7bp缺失并引起移码突变。第三个片段是与靶位点下游dna序列同源的dna序列，其大小范围可以从10个核苷酸到1,000个或更多个核苷酸。通过用序列直接转化诱导系或者首先将序列转化到不同的玉米品系中并回交序列到诱导系中将核酸内切酶的一个或多个拷贝和供体模板的一个或多个拷贝置于玉米单倍体诱导系的基因组中。具有核酸内切酶和供体模板系的单倍体诱导系被称为hilage-hr系。hilage-hr系与具有与核酸内切酶靶序列匹配或紧密匹配的序列的原种系杂交。基于hilage的过程如本文所述进行，修改是在一些个体中使用供体模板序列修复dsb。使用诸如pcr和测序的方法来检测使用供体模板修复由dsb产生的特定dna修饰。对染色体加倍的植物进行筛选以鉴定含有所需插入且不含来自单倍体诱导系的染色体的植物。其他实施方式应理解虽然本发明已结合其详述进行描述，但以上描述意在说明而不是限制本发明的范围，该范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优势和修改在以下权利要求的范围内。序列表<110>明尼苏达大学董事会（regentsoftheuniversityofminnesota）<120>用于加速基因组编辑的单倍体诱导系<130>09531-0352wo1<150>62/186,913<151>2015-06-30<150>62/318,913<151>2016-04-06<160>49<170>fastseqforwindowsversion4.0<210>1<211>4140<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>1atggataagaagtactccatcggactggatatcggaactaactccgtgggatgggctgtg60atcactgatgagtacaaggtgccatccaagaagttcaaggtgctgggaaacactgataga120cactccatcaagaagaacctgatcggagctctgctgttcgattccggagagactgctgag180gctactagactgaagagaactgctagaagaagatacactagaagaaagaacagaatctgc240tacctgcaagagatcttctccaacgagatggctaaggtggatgattccttcttccacaga300ctggaggagtccttcctggtggaggaggataagaagcacgagagacacccaatcttcgga360aacatcgtggatgaggtggcttaccacgagaagtacccaactatctaccacctgagaaag420aagctggtggattccactgataaggctgatctgagactgatctacctggctctggctcac480atgatcaagttcagaggacacttcctgatcgagggagatctgaacccagataactccgat540gtggataagctgttcatccaactggtgcaaacttacaaccaactgttcgaggagaaccca600atcaacgcttccggagtggatgctaaggctatcctgtccgctagactgtccaagtccaga660agactggagaacctgatcgctcaactgccaggagagaagaagaacggactgttcggaaac720ctgatcgctctgtccctgggactgactccaaacttcaagtccaacttcgatctggctgag780gatgctaagctgcaactgtccaaggatacttacgatgatgatctggataacctgctggct840caaatcggagatcaatacgctgatctgttcctggctgctaagaacctgtccgatgctatc900ctgctgtccgatatcctgagagtgaacactgagatcactaaggctccactgtccgcttcc960atgatcaagagatacgatgagcaccaccaagatctgactctgctgaaggctctggtgaga1020caacaactgccagagaagtacaaggagatcttcttcgatcaatccaagaacggatacgct1080ggatacatcgatggaggagcttcccaagaggagttctacaagttcatcaagccaatcctg1140gagaagatggatggaactgaggagctgctggtgaagctgaacagagaggatctgctgaga1200aagcaaagaactttcgataacggatccatcccacaccaaatccacctgggagagctgcac1260gctatcctgagaagacaagaggatttctacccattcctgaaggataacagagagaagatc1320gagaagatcctgactttcagaatcccatactacgtgggaccactggctagaggaaactcc1380agattcgcttggatgactagaaagtccgaggagactatcactccatggaacttcgaggag1440gtggtggataagggagcttccgctcaatccttcatcgagagaatgactaacttcgataag1500aacctgccaaacgagaaggtgctgccaaagcactccctgctgtacgagtacttcactgtg1560tacaacgagctgactaaggtgaagtacgtgactgagggaatgagaaagccagctttcctg1620tccggagagcaaaagaaggctatcgtggatctgctgttcaagactaacagaaaggtgact1680gtgaagcaactgaaggaggattacttcaagaagatcgagtgcttcgattccgtggagatc1740tccggagtggaggatagattcaacgcttccctgggaacttaccacgatctgctgaagatc1800atcaaggataaggatttcctggataacgaggagaacgaggatatcctggaggatatcgtg1860ctgactctgactctgttcgaggatagagagatgatcgaggagagactgaagacttacgct1920cacctgttcgatgataaggtgatgaagcaactgaagagaagaagatacactggatgggga1980agactgtccagaaagctgatcaacggaatcagagataagcaatccggaaagactatcctg2040gatttcctgaagtccgatggattcgctaacagaaacttcatgcaactgatccacgatgat2100tccctgactttcaaggaggatatccaaaaggctcaagtgtccggacaaggagattccctg2160cacgagcacatcgctaacctggctggatccccagctatcaagaagggaatcctgcaaact2220gtgaaggtggtggatgagctggtgaaggtgatgggaagacacaagccagagaacatcgtg2280atcgagatggctagagagaaccaaactactcaaaagggacaaaagaactccagagagaga2340atgaagagaatcgaggagggaatcaaggagctgggatcccaaatcctgaaggagcaccca2400gtggagaacactcaactgcaaaacgagaagctgtacctgtactacctgcaaaacggaaga2460gatatgtacgtggatcaagagctggatatcaacagactgtccgattacgatgtggatcac2520atcgtgccacaatccttcctgaaggatgattccatcgataacaaggtgctgactagatcc2580gataagaacagaggaaagtccgataacgtgccatccgaggaggtggtgaagaagatgaag2640aactactggagacaactgctgaacgctaagctgatcactcaaagaaagttcgataacctg2700actaaggctgagagaggaggactgtccgagctggataaggctggattcatcaagagacaa2760ctggtggagactagacaaatcactaagcacgtggctcaaatcctggattccagaatgaac2820actaagtacgatgagaacgataagctgatcagagaggtgaaggtgatcactctgaagtcc2880aagctggtgtccgatttcagaaaggatttccaattctacaaggtgagagagatcaacaac2940taccaccacgctcacgatgcttacctgaacgctgtggtgggaactgctctgatcaagaag3000tacccaaagctggagtccgagttcgtgtacggagattacaaggtgtacgatgtgagaaag3060atgatcgctaagtccgagcaagagatcggaaaggctactgctaagtacttcttctactcc3120aacatcatgaacttcttcaagactgagatcactctggctaacggagagatcagaaagaga3180ccactgatcgagactaacggagagactggagagatcgtgtgggataagggaagagatttc3240gctactgtgagaaaggtgctgtccatgccacaagtgaacatcgtgaagaagactgaggtg3300caaactggaggattctccaaggagtccatcctgccaaagagaaactccgataagctgatc3360gctagaaagaaggattgggatccaaagaagtacggaggattcgattccccaactgtggct3420tactccgtgctggtggtggctaaggtggagaagggaaagtccaagaagctgaagtccgtg3480aaggagctgctgggaatcactatcatggagagatcctccttcgagaagaacccaatcgat3540ttcctggaggctaagggatacaaggaggtgaagaaggatctgatcatcaagctgccaaag3600tactccctgttcgagctggagaacggaagaaagagaatgctggcttccgctggagagctg3660caaaagggaaacgagctggctctgccatccaagtacgtgaacttcctgtacctggcttcc3720cactacgagaagctgaagggatccccagaggataacgagcaaaagcaactgttcgtggag3780caacacaagcactacctggatgagatcatcgagcaaatctccgagttctccaagagagtg3840atcctggctgatgctaacctggataaggtgctgtccgcttacaacaagcacagagataag3900ccaatcagagagcaagctgagaacatcatccacctgttcactctgactaacctgggagct3960ccagctgctttcaagtacttcgatactactatcgatagaaagagatacacttccactaag4020gaggtgctggatgctactctgatccaccaatccatcactggactgtacgagactagaatc4080gatctgtcccaactgggaggagatctgcaaccaaagaagaagagaaaggtgggaggatga4140<210>2<211>1379<212>prt<213>人工序列<220><223>合成<400>2metasplyslystyrserileglyleuaspileglythrasnserval151015glytrpalavalilethraspglutyrlysvalproserlyslysphe202530lysvalleuglyasnthrasparghisserilelyslysasnleuile354045glyalaleuleupheaspserglygluthralaglualathrargleu505560lysargthralaargargargtyrthrargarglysasnargilecys65707580tyrleuglngluilepheserasnglumetalalysvalaspaspser859095phephehisargleuglugluserpheleuvalglugluasplyslys100105110hisgluarghisproilepheglyasnilevalaspgluvalalatyr115120125hisglulystyrprothriletyrhisleuarglyslysleuvalasp130135140serthrasplysalaaspleuargleuiletyrleualaleualahis145150155160metilelyspheargglyhispheleuilegluglyaspleuasnpro165170175aspasnseraspvalasplysleupheileglnleuvalglnthrtyr180185190asnglnleupheglugluasnproileasnalaserglyvalaspala195200205lysalaileleuseralaargleuserlysserargargleugluasn210215220leuilealaglnleuproglyglulyslysasnglyleupheglyasn225230235240leuilealaleuserleuglyleuthrproasnphelysserasnphe245250255aspleualagluaspalalysleuglnleuserlysaspthrtyrasp260265270aspaspleuaspasnleuleualaglnileglyaspglntyralaasp275280285leupheleualaalalysasnleuseraspalaileleuleuserasp290295300ileleuargvalasnthrgluilethrlysalaproleuseralaser305310315320metilelysargtyraspgluhishisglnaspleuthrleuleulys325330335alaleuvalargglnglnleuproglulystyrlysgluilephephe340345350aspglnserlysasnglytyralaglytyrileaspglyglyalaser355360365glnglugluphetyrlyspheilelysproileleuglulysmetasp370375380glythrglugluleuleuvallysleuasnarggluaspleuleuarg385390395400lysglnargthrpheaspasnglyserileprohisglnilehisleu405410415glygluleuhisalaileleuargargglngluaspphetyrprophe420425430leulysaspasnargglulysileglulysileleuthrpheargile435440445protyrtyrvalglyproleualaargglyasnserargphealatrp450455460metthrarglysserglugluthrilethrprotrpasnphegluglu465470475480valvalasplysglyalaseralaglnserpheilegluargmetthr485490495asnpheasplysasnleuproasnglulysvalleuprolyshisser500505510leuleutyrglutyrphethrvaltyrasngluleuthrlysvallys515520525tyrvalthrgluglymetarglysproalapheleuserglyglugln530535540lyslysalailevalaspleuleuphelysthrasnarglysvalthr545550555560vallysglnleulysgluasptyrphelyslysileglucyspheasp565570575servalgluileserglyvalgluaspargpheasnalaserleugly580585590thrtyrhisaspleuleulysileilelysasplysasppheleuasp595600605asnglugluasngluaspileleugluaspilevalleuthrleuthr610615620leuphegluaspargglumetileglugluargleulysthrtyrala625630635640hisleupheaspasplysvalmetlysglnleulysargargargtyr645650655thrglytrpglyargleuserarglysleuileasnglyileargasp660665670lysglnserglylysthrileleuasppheleulysseraspglyphe675680685alaasnargasnphemetglnleuilehisaspaspserleuthrphe690695700lysgluaspileglnlysalaglnvalserglyglnglyaspserleu705710715720hisgluhisilealaasnleualaglyserproalailelyslysgly725730735ileleuglnthrvallysvalvalaspgluleuvallysvalmetgly740745750arghislysprogluasnilevalileglumetalaarggluasngln755760765thrthrglnlysglyglnlysasnserarggluargmetlysargile770775780glugluglyilelysgluleuglyserglnileleulysgluhispro785790795800valgluasnthrglnleuglnasnglulysleutyrleutyrtyrleu805810815glnasnglyargaspmettyrvalaspglngluleuaspileasnarg820825830leuserasptyraspvalasphisilevalproglnserpheleulys835840845aspaspserileaspasnlysvalleuthrargserasplysasnarg850855860glylysseraspasnvalproserglugluvalvallyslysmetlys865870875880asntyrtrpargglnleuleuasnalalysleuilethrglnarglys885890895pheaspasnleuthrlysalagluargglyglyleusergluleuasp900905910lysalaglypheilelysargglnleuvalgluthrargglnilethr915920925lyshisvalalaglnileleuaspserargmetasnthrlystyrasp930935940gluasnasplysleuilearggluvallysvalilethrleulysser945950955960lysleuvalseraspphearglysasppheglnphetyrlysvalarg965970975gluileasnasntyrhishisalahisaspalatyrleuasnalaval980985990valglythralaleuilelyslystyrprolysleuglusergluphe99510001005valtyrglyasptyrlysvaltyraspvalarglysmetilealalys101010151020sergluglngluileglylysalathralalystyrphephetyrser1025103010351040asnilemetasnphephelysthrgluilethrleualaasnglyglu104510501055ilearglysargproleuilegluthrasnglygluthrglygluile106010651070valtrpasplysglyargaspphealathrvalarglysvalleuser107510801085metproglnvalasnilevallyslysthrgluvalglnthrglygly109010951100pheserlysgluserileleuprolysargasnserasplysleuile1105111011151120alaarglyslysasptrpaspprolyslystyrglyglypheaspser112511301135prothrvalalatyrservalleuvalvalalalysvalglulysgly114011451150lysserlyslysleulysservallysgluleuleuglyilethrile115511601165metgluargserserpheglulysasnproileasppheleugluala117011751180lysglytyrlysgluvallyslysaspleuileilelysleuprolys1185119011951200tyrserleuphegluleugluasnglyarglysargmetleualaser120512101215alaglygluleuglnlysglyasngluleualaleuproserlystyr122012251230valasnpheleutyrleualaserhistyrglulysleulysglyser123512401245progluaspasngluglnlysglnleuphevalgluglnhislyshis125012551260tyrleuaspgluileilegluglnileserglupheserlysargval1265127012751280ileleualaaspalaasnleuasplysvalleuseralatyrasnlys128512901295hisargasplysproilearggluglnalagluasnileilehisleu130013051310phethrleuthrasnleuglyalaproalaalaphelystyrpheasp131513201325thrthrileasparglysargtyrthrserthrlysgluvalleuasp133013351340alathrleuilehisglnserilethrglyleutyrgluthrargile1345135013551360aspleuserglnleuglyglyaspleuglnprolyslyslysarglys136513701375valglygly<210>3<211>36<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>3ctgcaaccaaagaagaagagaaaggtgggaggatga36<210>4<211>11<212>prt<213>人工序列<220><223>合成<400>4leuglnprolyslyslysarglysvalglygly1510<210>5<211>571<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>5cggtgaattcaagctttcgttgaacaacggaaactcgacttgccttccgcacaatacatc60atttcttcttagctttttttcttcttcttcgttcatacagtttttttttgtttatcagct120tacattttcttgaaccgtagctttcgttttcttctttttaactttccattcggagttttt180gtatcttgtttcatagtttgtcccaggattagaatgattaggcatcgaaccttcaagaat240ttgattgaataaaacatcttcattcttaagatatgaagataatcttcaaaaggcccctgg300gaatctgaaagaagagaagcaggcccatttatatgggaaagaacaatagtatttcttata360taggcccatttaagttgaaaacaatcttcaaaagtcccacatcgcttagataagaaaacg420aagctgagtttatatacagctagagtcgaagtagtgattgggtcttcgagaagacctgtt480ttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggc540accgagtcggtgcttttttttgaattcagcc571<210>6<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>6ccaagcttcccaactacacgatggactcac30<210>7<211>34<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>7ccggcgcgccatgtaaagagaagagaggacaaag34<210>8<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>8ccaagcttcccaactacacgatggactcac30<210>9<211>34<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>9ccggcgcgccatgtaaagagaagagaggacaaag34<210>10<211>34<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>10cgaaaataaatgaaggcatcaataaaagcttacc34<210>11<211>45<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>11gtcagctcggcgcgcctcttcttctcctctgcaatttttcatcac45<210>12<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>12gattgagaatcaagaatacaagaa24<210>13<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>13aaacttcttgtattcttgattctc24<210>14<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>14gattggaaaagttgtagactgaga24<210>15<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>15aaactctcagtctacaacttttcc24<210>16<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>16ggaaaagttgtagactgagatgg23<210>17<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>17gcacgtgtcacgaaaacccatc22<210>18<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>18attgtagtaacataaagttatgta24<210>19<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>19gattgggctccaccgccggcgacg24<210>20<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>20aaaccgtcgccggcggtggagccc24<210>21<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>21gattgaaccaggacaaggtcctca24<210>22<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>22aaactgaggaccttgtcctggttc24<210>23<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>23gggctccaccgccggcgacgtgg23<210>24<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>24cacggtgcttgaattagtgcg21<210>25<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>25ggtcctccatctggcaccg19<210>26<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>26gaaccaggacaaggtcctcatgg23<210>27<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>27ggtggtggacgaggaggc18<210>28<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>28gtagcaccaatgatgagcgag21<210>29<211>2499<212>dna<213>玉米（zeamaize）<400>29gtcatggatggagccagtgaactgatgattttttccccaccccgcacgcaacagcatggg60tgacaacaaccactcccgctgcggttgggcgagcacatctctacgcacttgacactcacg120caaacctaacgcatactagattaatcatcgccaccaactatcggcgacagaaacgatggg180ccccgcttctcttaatcacggtgcttgaattagtgcgcgcatagtagtgaaaaataatag240tgaaaaataagcagtgcgtgttttggtgtggtggttggtgagccgtccggcccaataaaa300acccctcgcaccacctcgtccctcttcgtcgcatcgcacgccatcagcagctagcgcgct360cctcgagcccagcagagaaaggccggcctacccactctctctctctctctctccagtctc420caccggcagcgctaatcgtaatagccatgggctccaccgccggcgacgtggccgcggtgg480tggacgaggaggcgtgcatgtacgcgatgcagctggcgtcgtcgtccatcctgcccatga540cgctgaagaacgccatcgagctgggcctgctggaggtgctgcagaaggaggccggcggcg600gcaaggcggcgctggcgcccgaggaggtggtggcgcggatgcccgcggcgcccggcgacc660ccgccgccgcggcggccatggtggaccgcatgctccgcctgctcgcctcctacgacgtcg720tccggtgccagatggaggaccgggacggccggtacgagcgccgctactccgccgcgcccg780tctgcaagtggctcacccccaacgaggacggcgtgtccatggccgccctcgcgctcatga840accaggacaaggtcctcatggagagctggtgagtagtagccgcatcgcatcaaccacctt900ctacctatctatatccatcacttgttgctgctggcgtgcgcggcatgcatgatgacgagc960tcgctcatcattggtgctactagtgatttatttcgtccagtaaaattaattaaggtgcgc1020tgctactctactggctgcggctagcacaaggctggaaatagttgttacttgttatacacg1080atataatatttctctagaacaaaaaagattttttttttataaaaagcaagcaagaaagaa1140agtgagtgacttcatgtttttcctaaaaaaaagttaggagtgggatggaaaagtcagcaa1200ggaccacttgtttgttgtccactatccatccagtgggtgagacttttttgcgagacggag1260cactatattattggccgagtcctttttctgtatccgcaaaacggcagccgtcgatcgccg1320gacggatcgacggctcacatgagtgtcgagtccaattccaaccacgagggcggcaaggaa1380aaccatccgtgctggtctggactttttgccaaactccattcagccattcgccgactgaag1440gtgaatcttcagacagccagattgtttggtgtctagtgtgtgcgaagatggcgtagaaaa1500gactgagagacagttggctcacacagacaagtgacaactgactatagtatctgcctgcct1560ggctgatgctgatagagatggggactcttgtcctgtctgtttcttgtatgcgctgatctg1620attctgatcactgccactctgccaggtactatctcaaggacgcggtgctggacggcggca1680tcccgttcaacaaggcgtacgggatgacggcgttcgagtaccacggcacggactcgcgct1740tcaaccgcgtgttcaacgagggcatgaagaaccactcggtgatcatcaccaagaagctgc1800tggacttctacacgggcttcgagggcgtgtcgacgctggtggacgtgggcggcggcgtgg1860gcgccacgctgcacgccatcacgtcccgccacccgcacatctccggggtcaacttcgacc1920tgccgcacgtcatctccgaggcgccgccgttccccggcgtgcgccacgtgggcggggaca1980tgttcgcgtccgtgcccgccggcgacgccatcctcatgaagtggatcctccacgactgga2040gcgacgcgcactgcgccacgctgctcaagaactgctacgacgcgctgccggaaaatggca2100aggtcatcgtcgtcgagtgcgtgctgccggtcaacacggaggccacccccaaggcgcagg2160gcgtcttccacgtcgacatgatcatgctcgcgcacaaccccggcggcaaggagcggtacg2220agcgcgagttccgcgagctcgcaaagggcgccggcttctccgggttcaaggccacctaca2280tctacgccaacgcctgggccatcgagttcatcaagtgaaccaccgtcgccgcgatgagat2340ggcatggctgccacatgctttgcttgcttggtcctcgtatcgtacgtcgccgtcgtcgtc2400ttcttctggttattgcgctgctacctcgctgctctcgcgtatgcatgtacttttgcttaa2460ttttctttcttcatatcatgcactctggctggcctagac2499<210>30<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>30gattgccgctagggcatcttagat24<210>31<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>31aaacatctaagatgccctagcggc24<210>32<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>32gccgctagggcatcttagatagg23<210>33<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>33tgtgcattctttccaaaaggtca23<210>34<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>34gctccaaagggctttagtagga22<210>35<211>10581<212>dna<213>圆锥小麦（triticumturgidum）<400>35atgactacaccaatgagtataccgttcgcaactttggaaaagattacaaatgggttctca60aacgatttaataattggaaggggtgggtatggaaacgtttacaaggtatggcttaatact120tgatatttccttttttcagcaaatgttcaggctataaacaaataatttaagtgcaataat180tatgtcaagcaggcagtttacaaaggggaagtgattgctgtgaagttgcttcatgatgat240ctggtgcaattacttgatgacagacaatttaaaaatgaactttttaaccttttgagggtt300gagcatccgaatattgtttgcttacgtggttattgttatgaaacacggtataaaattgtt360aagcacaatggtgagacagtctttggtaaacatatacacagagttctctgctttgaatac420ttggagggtggaagcctagacaatcatcttcatggtacgatggaacttcaaaatacagtt480attttgttttacgtttaaaggaaactgatttctcatttacatacatactctttgttaact540tgcgtagcaccatctttgccacctaactggaccacacgttacaataccataaaggggatt600tgtgaaggcttaaatttccttcacggatgtcaaccaccaattttgcatcttgatctgaag660cctgccaatatattagtagacagttccatggtgcctaaactggcggattttggattgtca720aagctcttccatggatcacatactcatgtgacaaaacaaatcataggaacccagtaagcg780gaagcgacccgtggattgtctcgttctgaattttctttcttttgtgatcaaataaatagt840atgtacagttctgtactaactgtgtctttgtatcacgcaggaagtacatgccaccggaat900tcatcaaagatggcaagatctcggttaaaaatgatgtctttagtttgggtattgtgatca960tagaaataatggcaggacctatgggttattcagaattttcagaaatgggcagcggtgcac1020aatttgtgaaggaggtaataaaaaaaactcaagtttgacacccgagttcgtataaataac1080aaactaccacaccaagaatttgatgtctaatgtgtgagccattataatcgttgaactgag1140tttatgacaggaccggcagtaataaaaaatatagcaacactcccccacacaatatattga1200gcatagaagatacaacttatctagctataacaaaataataatccagaaaagtagccattt1260ttttttccggacaggattgaggtccaccagtccaataactatgaagcagctcgctgatag1320aaaattccaaggtacaattatttttgtaagtttctccttatcacgtgtgaaacaccaatg1380taataaagctgataaaccaaacgtacccactatgagaactgcatacactgagactcgaag1440aaaagaacaaatgcatatctagaaccttgctccatgggatatctagaaccttgctccatg1500ggatctagcaccatctccattttggagcaagcacgaggtgcgtatcgtaatctttttctg1560ctagatgcagacttagacacccagtattctctaggtaaattatttatctggaaagtcgta1620ggtaacacttgtgaacaaggatatagcgtacatatatatgggagcatttgtgttatgtga1680cacttttgacttaattgcaaatattatgttatgtgaagactcaagagtgtttttgaacaa1740gtatcgtacatattgtaccgaaaaaggctttcgccccgctttatattataaagcacatgc1800ccaagccaacaaaccacacaggttcacaaacacacgcagacccacacacaccaagttcac1860acacagacaagatccacaagggttaatgctgagggcacagcttaacaagccctagaacaa1920aaaggaaagacaccatctagtcgggctccggggggggggggggggggggcggcggaagtg1980gaggcgccaggcggaaggcgagcgatcgaaggtcggcgaggagggtgttgatgatgtccc2040gatcctgagggcggctaagcggccgccaaagctgcaagtacccacacattttaaaaatgg2100cgtcagtagcgcgtcgtagagggactttttggatgacaagcttattgcggacggtccaca2160gcgtccagccgagaaccccaacgcataaccaacggatatgtcggtggcgtggggggggag2220gcgtggatttccgcgaggaggtcggggaagttggagttgcaccactatccgccaaccgtc2280tcacggaaactggaccaaagaaactggccgcagggcacgtgaagaagatgtggttagcat2340cctccgcagtgccgcacaaggggcaaagcccatccccgggtccgttgcgcttgaggactt2400cgacaccggaggggaggcggccacgaatccactgccaaaggaagatcctaatcttcagag2460gtaagcgaatgtcccagatcagagcaaagggctcgggcgcgggcgaaggcgcaatagccg2520cgtacatgacctagtagagaaacgaccggaggactctaggcgccacgagatggcgtccgg2580ggcgtcggtgacgctcatcggaagaagggcgatgtcctggaggagggaatcccaggcggc2640cacttcggggggaccgaaaggacgacgaaacgcgaggcgccctaagtcaataagggccgt2700ctcgacagagacccgagggtcaaccgcaatggtgaagagatcgggaaagcgggcggccag2760aggggtgtcaccgagccaccgatcaaaccagaacagggtcgcggacccagtaccaatcga2820aatggacgtgccgatacgaagcacaggaagcagccgcacgacggcctgccaaaactgtga2880tccgcccgaacgctgacagaaagccagaggctggccacggaggtatttgttgcggataat2940ggtgagccacaaccctccgtcaccattggcaatacgccacaaccaccgggtcaggagggc3000gatgttcattcggcgggaggacagaatctcaagacccccctggtctttaggtttacaaat3060gtccggccaagtcaccatgtggtacttctgtttgtcatcgtcgccagcccaatagaacct3120ggattggtacttggcaatttccgtgtgcagcgtttcatggaggctataaaagctcatgag3180gaaccaaaggagactggcgagtgaggagttgatgaggatcacccgcgccgcctttgatag3240ccaacgccctttccaaggttcgacgcggtgttgcatacgggtcaccgtagggtggaggtc3300cgccacggtgaggcgcgagtcactaacggggatccccaggtaggtcgtggggaaggaccc3360tagccgacagttcaggcgatcagcaatatcctgagcctcctccggagggtatccaaggac3420catcacctcgctcttatcaaagttaatcgtaaggcccgacatctgctggaagcacaggag3480gaggaacttcaggttagcaacatcctgatttgaaccttccaccattattatggtgtcgtt3540cgcgtattgcaggagggagacccctccccctccaactaggtgagggacaatgccgtggat3600atggccagcacccttagccttatccaggatggcggccagagcatcgaccaccatgttgaa3660caggaacggcgagaatgggtctcctgacagaccccacagagggtggggaagtatggccca3720atctcgccgttaatgttcaccgccgtctttccacatgaaactgattgcatcacgcgggtc3780acccagcggtcatcaaagcccttacgcagcagtacttcccgaaggaagggccagtgaaca3840gtatcataggctttatggaagtcaagcttcaggaacacagcacgaagatgcttcacccgg3900acctcgtgaaggacttcatggaataccaacacgccatcaagaataaaccggccttggatg3960aaggccgattggttcgggtgagtgatcgaatcagccagcagggtcaccctattggcgtac4020cctttggccaggatccgaaaaatcacgttaatcaccgtgatggggcggaactggcgaata4080tcagaggcacccggaacctttgggatgagggtaatgatcccatagttgaggcgtcccagg4140tccatcgaacccgaatagaactcctcgaacaaagccatgacctccggtttgaccgcctgc4200cagaatgttttaaagaaagcaacaggcaggccatccgggcctggggccgaggcggggttc4260atgcctttaatggccgcgagcacctcgtcctcggcgaagggagcaaccagggccgcattg4320gcctcgccgggaaccaactgcgcccccgtccaagtatcgggggcatcgtacatattgtta4380tatgctccatctctaattgtatctctatatttcggttttgtaggtacttaccaattggag4440tactatcattaaagctacatcagagtatccagcagaggaactacatcaagtgaatttgtg4500catcgacatagcaatgctttgtgtggattctgaaagagtcaatagacccaccatagctgg4560tatcctagatgcattgaataggacaaaaactcatatgccctcctctacgaaaaaaactca4620tattccctggggacaggtatgatttgcatacttgcaaacaaaatgaaatctcgagtatat4680atttgcaatctgtagaagacagttgcttggatatatggaccactaagtagttatagagtt4740tgcagctccccgtctcccactcattttattctcaatcaagtagttctttaatagtcagga4800acttgcttactgcatccttttgactccctgctctataatccatgtagaagaaccttcatt4860ttagttccggctaattccaggaatagaaaactagagagggcctattcgtaatcgtgcctt4920ccggagtgacaggctaagtgaagggcagggggatgctgccctcgacaaccgtggctgtga4980ttggcactgtcgtgctcatacgaggtaccagacggtgtagaagttaacctagttgattaa5040tcttaggtgtggtcatgctagatagctatatgaaagagccatacatgtagttcaagtagt5100gcatgcaagattccaacattcaaaatcgtgccttgtactatggaaggggaaagggagggg5160taacacgtaatgagtgccctataagccttacacaatagctttatcagaccactgtggcgc5220cctaactgacgccaacagaggtagctgcaatggttcgatgagatagcggtgagagagaag5280gggcagggggacattggtggcaggtgtaagggaaaaagggagaggagtgaagccggctgg5340gtaccttggtgggggagaggaaagggtggaggaagaacaaagaggtgaggcgcctgctag5400tgattgcactgtaagcctaccgcgcgacattgctccaaagctacgctctcccaataaagg5460agaacttctagagagttgatatgaattaaagagattaccacagactcacatagtgcctga5520ggtattagccacatttcctttcatgcccttgccgaggggctttcctcggcgcctctcact5580ttgggctttgcttcttcaaaggtggtgtttaggccgcaaagagtacaaccagtgtgttat5640gtgtgtgcactttcggtgtgttacaatttgccattattgcttgatgctttattactattc5700aaaatagtttctctttttccaagttgtcattttaacatagcattatagattttgtccttc5760cgatttgcatgttttgatcgtctataacttagtttacataatggaagcacatcccagaga5820gtaaattgatcatgagatcttgaccatgatgattctcctgtttttttccttgtacttaca5880cataaaagttgtttcagttggaagatgtgcccctgtgttcgacaattggtcccaaaagta5940cgagtaaaaggtcgaacccagttcccacaaaggaaaataaaaggttgaagatgatgacaa6000ctgaagtggacaatatcgcgaacaaacaccaacagtttaattgcatgccaggagatagct6060ctaaaactattgttcagcaagttccagacagggaaacatcatcagatgtggaaccgacat6120taatcattggaagggatgaagaaaaacataaaatattgtccattttatctgagagcaacg6180cagaagagatgaccatccttccaatatatggcatcggaggaattggcaagacaaccttgg6240cacaattggtgttcaatgacatacagttccgggactactatcgggtgtgggtatatgttt6300ctcagaagtttgacttaaagaaaattggcaactttataatatcacagttaacaaaagaga6360ccagcgatatagatgaccagcagacacttcataatcgccttagacagctatttgctggta6420agagtatccttattgttttagatgacctgtgggaggagaaacaacatgagttagagaaat6480tgaaggctatgctaaggcttggcataggaaacaaggttgtcatagtaactacacgtgatg6540aagccattgcaaggaaaatcaacaggactgttatgccatacaagctagagattttaacag6600atgatatgtgctggtctataataaaacaaaaaagtttctttgaagatcgatgtgacaaag6660aacaattggggcagatcggaatggacattgcaatcaagtgtggaggtgtggctttggcgg6720ctcaatcacttgggtacatgttgagggagatggagtctgaccaatgggagtcagtgaggg6780acagttatatctggaatctatctactatggaagatccatcattaagaaatcatgaagtgc6840ttctgtccttgctgttaagctattcccatatgcatgaattcttgcagttatgcttttcct6900attgtgcattctttccaaaaggtcaaaatatagtgaagtatgatctaattcaccagtgga6960tagctcttggattcaccggtccatctggaatatttgattctattcagctctgtgagaaat7020atattacacggcttttggggatgtcattccttcaatattcaaagacacgttcggtgagtt7080actacatactctcgatgtcccaaaagatagctatgggtagtttcttcatgtcaaagagtc7140cccttccagtactgctaggtgtcaggtttctagaaggccgctagggcatcttagataggg7200tcatagttatacactactcatcctcaaatgcatatgcctgtgcaattttcttttctagat7260gaccttctcgacaagctcgttgacatttatcctttttctttttcttttctttcccttgtt7320ttcaaccttacctttcaaatttccttttccaagaatgacattcaagtccataacctgatc7380gtggatatgggtcctactaaagccctttggagctcaatatttttcaactatttcattaaa7440atgaattcacatctataatcatcatttcttttgttatgtatgtatataaaacaatactaa7500ttattgttgaactaataaacacatcgttgattacctctaaacaaatttgaatgtcattaa7560atttgtcttcatattttttagtgggataagaccccaatccaacaggcgcccaaacaaatg7620gacctatgtactgaaacgttgctgttgctggtgcatttgtagtgctgggtattaatttta7680gcaggtttaagatgaaaaccactgcagatatttatcccaggcattatttcatttgatata7740agctttgaagtttacagatccatagtgtaatctactctggtgtaatttaaatatactgat7800ccgttgcccattatcgagaaaacatacagctacggttacactcttttatagtgatacaaa7860agtatttctgttgataaaatatactactataaaacaaaataaattcaatattctaacaac7920attacgtggttttgctgcagagtgatgaacggcaggacaaagatgttaaaatgtttgtaa7980tgcatgacctagtgcacgatcttgcaagagcaatattggctgataaagttaataaagagg8040gtgatgctgtgggaagcagttgtcactatgcattgctcacagattgtagcaagccattgc8100agttgtctgttagttcaactgaatatagccggttcaatttttttcttagcctgtttaaaa8160agaagagttcacatgaaaatataaaggcgttacgttttctgaactgtggcaaagtactac8220ttcgcggtgatgcattttcacctgccaagttcctccttgtcttagatctaagtgaatgct8280ttattcagaagctctcacttgattcgattggacaactgaggcacttgagatatctttgtg8340ctccacgggtcaacgattacacgattcccaactgtatcaccaagctctcagaattaactt8400acctcaaccttagaggctcttgtcgtatctcagcattgccagagtcaattggcgatatga8460aaagtctgatgcatcttgatttatcaggctgctgtgacataattgaactcccagtatcat8520ttgcgaagctgaaacagttggtgcatctagatttatcacactgtcacgtgtctgtatcag8580aagattttggtggctttaccaaacttcaatatttgaatttatcagttttgtttagttctt8640ccaaggggcataggagaggactgctagaggtcattggcaatttaaagaaactcaggtatc8700taaatctatctcggtgcatggaggacatagccacatcagaaaaccaaattggcagtttgc8760ttgactctatcagtaccctttccaaccttgagcatctggacttgtctgagaataaacagc8820tttccagtataccagaaagtatgggcaacctcaggaagcttcatacattggacctcttag8880gctgctatcaactagagaagcttcctgatagtatgattaatatggttagcctgaaggttc8940taaatgtgggtaatttggttacactggatgaatctgtgctctctttgttaaatattgcct9000ccttgccacactttgtggtgcatgcttcaagtggtaaatgtagcagcaatatcacccgtc9060ttcaggctacaaatcctgatagactgattatagatagacttgaaaatgtcaaatctgcag9120aagaggcacataacataaaactgatagagaaacagaaaattgaaaccctacaatttgaat9180ggactgtggctgctaggaggtttgtggatgacaaagaggtgttggaaaaactagtgccgc9240caagcagtgtcgacagtttgtgtataattggttatagaagtgtcagcattcctgattggc9300ttctgggtattagtcagtatctccctaatcttgcgattataagtctggttaatttttcta9360agtgcaagaacctaccaccactcggtcaactaccaaacttacaatggctgactctcagca9420gtatggatggtttggaggagtggaacacgacatatactactggagagcaaggtagaaacg9480aactcttgttccctaagcttgagagattaaacatacatgactgtgccaagttgaggatag9540aaccatgtctgcctagagctttgtatttgcgcatacgagatagtaataatgtgctatcct9600cactcaatacaagagagcaagctgagagcacgctgccctcggacatagcacattgtgata9660atatgatatcagcatgcggaaagagttcgtcatacagcggtgcttcctcttcttctccaa9720taactgatctgtttgtagaggaaagcaaactacccttgcatcagtggaggttgcttcacc9780aactccccgcgctccgtggtttacggatcaaacattgcagtgatctgaccacctcacttg9840ctgttatccaaaaactctcctccctccaaaatttgagcctggagctcaacgaccatgaac9900tgccgagttggttgattcagctgacagatctacaggaattaaagcttatgcattgcaata9960gcattacatcactaccacagtggtttggagaacttgcatctctcaagagaattgagatca10020agtactgcaaggggatcagctctttgccggagagcatacaacaactgactaagcttgaat10080ttctaagcattcatggctgtcctgtattagaggagtggtgtgaatcagaggagaacaaga10140tgaagctcactcacatcaaagttgaggtatgtgcgtgcaagttatctgttgtattgcttt10200tattctcgtgctggtagtgacttaatactcttttcttaaatggcaagtatacacatgcca10260tgagtatctttacataatcatggtaagtgttgaattaggtgtatgtattttgtctattag10320atgcttcatgtgtctagattacttgacaaaaatatgtgacgactgcattaataattcgcc10380taagaagaaaagcattccagttgtgattgtgctatatcatgcacctatacatgcattgtt10440ctgattatatatcccgtttgcattgttcagatcgctggacgggattcggtaggctttgag10500gattcgaaggttcagattgtcaaaccaatgccagcacaaatggttcgccaatcagcattt10560gctactacagaacgaagatag10581<210>36<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>36gattgggtgccggtggcaggatga24<210>37<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>37aaactcatcctgccaccggcaccc24<210>38<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>38gggtgccggtggcaggatgacgg23<210>39<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>39ttcgtcccgtcaacaagagg20<210>40<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>40gtccgtcggcgagcgctgg19<210>41<211>1553<212>dna<213>燕麦（avenasativa）<400>41cataaaccactcgttcgtcccgtcaacaagaggagcagaggcgagggactcgcgctcgcg60tgtgtggtgtccttccctcgatctgcccctctccggccagttctatcacctcctatcagc120aacatgggtgccggtggcaggatgacggagaaggagagggagaagcaggagcagctcggc180cgcgccgacgtcggtgcgaccctccagcgctcgccgacggacaagccgccgttcacactg240gggcagatcaagaaggcgatcccaccccactgcttccagcgctcggtgatcaagtcattc300tcctacgtggtccatgacctcgtcatcgtggctgctctcctgtacgccgcgctggtctgg360atccccaccctcccgagcgtgctgcagctgggcgcctggccgctctactggatcgtgcag420ggctgcgtcatgaccggcgtctgggtcatcgcgcacgagtgcggccaccacgccttctcc480gactactcgctcctcgacgacatcgtcggcctggtgctccactcgtggctgctggtcccg540tacttctcgtggaagtacagccaccgtcgccaccactccaacaccggctccatggagcgt600gacgaggtgttcgtccccaagcagaaggacgcgctggcctggtacaccccatacatctac660aacaaccccatcggccgtctggtgcacatcgtggtgcagctcaccctcgggtggccgctg720tacctgtcgatgaacgcctcgggccgcccgtacgcgcgcttcgcctgccacttcgacccc780tacggccccatctacaacgaccgggagcgcgtccagatcttcatttcggacgtcggtgtg840gtggccacggcgttcaccctcttcaagcttgcttcggcgttcgggttctggtgggtggtg900cgcatctacggtgtgccgctgctgatcgtgaacgcgtggctggtcctgatcacctacctg960cagcacacccacccggcgctgccgcactacgactccaccgagtgggactggctgcggggg1020gcgctggccaccatggaccgggactacggcatcctcaaccgcgtgttccacaacatcacg1080gacacgcacgtggcgcaccacctcttctccaccatgccgcactaccatgccatggaggcc1140accaaggcgatcaagccaatcctgggcgagtactaccagttcgaccccacccccgtggcc1200aaggcaacatggcgcgaggccaaggagtgcatctacgtcgcgcccaccgaggaccgcaag1260ggcgtcttctggtacagcaacaagttctagattcgtcatggggacctgctgtgctgctgg1320aatgtgaggaggaagaagtcagtaatacaccaagtatccatccatctacctacatatggt1380tgggggttagtagtctttagatagaagagagcgttgtttgggcacaaggaaaagactatg1440accaccgtgccaatgctagaagagtcgaagcaggtgcaacgaggagtagcgtgtcgggtg1500tccgtggctttggtcagttccgtcctgtgtctttacttcctagtcgccggttt1553<210>42<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>42gattggcggaggggatggtgacgg24<210>43<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>43aaacccgtcaccatcccctccgcc24<210>44<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>44ggcggaggggatggtgacggtgg23<210>45<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>45tccaacgtggacacgacttt20<210>46<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>合成<400>46gaggtggcatttgtggagga20<210>47<211>2147<212>dna<213>常规大麦（hordeumvulgare）<400>47gtcataactcggcaaacatagattagacagaattttctgagttcttatctagaggaactc60gatgaacttgaggcattgtcgaggttcttcctttcaccgagtacttttttgcgtgtacta120ggcaaatatatgaagtttgtgagtttcggatcaccaccgagtgcaagtttggaccaaact180tgacaaatacataagtttggcgagctccgaatgaaatgaactctgcaaaagaatagaact240cggcgcaaaaccagattctaatagtgtgtgaatttttgggctgttttgtataaatatgat300gaaacttagtaaaatttcactcaggtcaatgctaatgtggagagtaaataaaaaatgaag360ggagtacttggctgcatcatatgtttgcccccgatcaccttcacatctccccgtccggac420ggcctggatcggaaagcactcagccggagccccgccggcgcttgccgttgggtacctctg480ccacctatttatattacccctaggtctctccctggagacacgcactcccctccttcaact540agtgctttgcggcccgtggtcctcctctcgatccagttcctgagcacaccaacaggcaac600agaacaacctaccgtgtctcccctccaatctcctcacgatcccttctttccctcagatcc660gaaccgaaagcatggacaagcatcagctctttgattcatccaacgtggacacgactttct720tcgcggccaatggtacacacgacgccgcgcgcgcccggtctttgcgcatgcgatgatgca780gctgcagtagcttcagtttcaccggccaggacacgcatgtgatgacgttttttccattct840gtgtttgtatgtgcaggcacggcgcagggggataccagcaagcagagggcgcggcgcagg900cggcggaggtcggcgaggtgcggcggaggggatggtgacggtggggagatggacggagga960ggggaccccaagaagcggcggctcaccgacgagcaggccgagattctggagctgagcttc1020cgggaggaccgcaagctggagacagcccgcaaggtgtatctggccgccgagctcgggctg1080gaccccaagcaggtcgccgtgtggttccagaaccgccgcgcgcgccacaagaacaagacg1140ctcgaggaggagttcgcgaggctcaagcacgcccacgacgccgccatcctccacaaatgc1200cacctcgagaacgaggtatgcttgctcgcatacactcacactggcttacatatggcgctg1260cacatctgcagttcctctccgttcttgaacatgcttactgacaaacatatggccagctgc1320tgaggctgaaggagagactgggagcgactgagcaggaggtgcggcgcctcaggtcggcag1380ctgggagccacggggcatctgtggatggcggacacgccgctggcgccgttggcgtgtgcg1440gcgggagcccgagctcgtccttctcgacgggaacctgccagcagcagccgggtttcagcg1500gggcagacgtgctggggcgggacgatgacctgatgatgtgcgtccccgagtggtttttag1560catgaattagagtttatgctggctaagccgatagcagcgtggtcgagtgttttttagcat1620gaaatcagatctccatctcccataaaatagccgagatagctgctgccgccgccaaatcct1680ctatagggcttcaagatcggcagaaacctctagaaatcatctcccccctccggaaaagtc1740gcctctatttgtctccattgcccgcgatgcagcatccggtatagctgctaagacaggccg1800cccctaaatcgtttctccagcgattttaatctttggtttttagcctgtatatatgggctg1860tgatttgaagttgagacgagctggacatcaactgcacgctgatcgattactattctagtt1920tggcatagtgttaattaagtttggatgatctctaggcgtgcgttaagtatgtagatagtg1980ttgattaatggcaaaagcttgcaagttaagtgtagtattggcagctctcttgaagatcaa2040atatgatgtgtgttatcatttgatgatatatattttacttcagccgtaaatagtcttctt2100agggaagcactgtccatgtatgtgctggtagttggcattcatctttc2147<210>48<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>共有<400>48leualaglyleuileaspalaaspgly15<210>49<211>13<212>prt<213>人工序列<220><223>突变体<400>49glyglyglycyscyscysglyglycysglyalacysgly1510当前第1页12