一种用于冻存单个核细胞的冻存液的制作方法

本发明涉及一种用于冻存单个核细胞的冻存液，属于生物技术低温冻存领域。

背景技术：

人体内单个核细胞所具有的免疫活性与个人的年龄及身体是否健康有密切的关系。单个核细胞怎么样才能更长久的保存是一个问题，如果把细胞冻存起来，是否能够在细胞复苏后还能让它保持原有活性也是一个挑战。

单个核细胞深低温保存可保持其活力和功能，无论对后期细胞的诱导培养还是冻存细胞复苏后对患者的直接治疗都具有重要意义。冷冻保存单个核细胞不仅可以解决对患者多次采血和培养时对细胞多次诱导的问题，还可以把人体健康状态下战斗力最强的单个核细胞保存下来，复苏培养后用于肿瘤治疗或者抗衰老保健治疗。

影响单个核细胞冻存、复苏后细胞活性的主要因素包括单个核细胞冻存、复苏的方式及单个核细胞冻存液的配方，其中冻存液的因素占主要地位。如果要长期保存单个核细胞，那么为了避免细胞受到损伤，一定要把单个核细胞存放于液氮环境中。单个核细胞经过冻存和复苏后其细胞形态、表型的优劣主要取决于是否使用一种有效的冻存试剂和适当的降温、复温程序。二甲基亚砜是目前国内冻存配方中采用最多的最理想的细胞保护剂，细胞冷冻保护剂可以避免冷冻时细胞内冰晶的形成，保护细胞膜和细胞器免受损伤。胎牛血清也是细胞冻存配方中的常客，因为它是由血浆去除纤维蛋白后形成的一种很复杂的混合物，其中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质都有利于保护细胞。胎牛血清有优点也有缺点，它最大的缺点就是引入了动物蛋白，增加了被动物病原污染的可能性，会对人体过继免疫细胞治疗产生一定的影响。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明提供了一种用于冻存单个核细胞的冻存液。本发明有效解决了外周血单个核细胞提取后的直接冻存问题，能够有效的保护单个核细胞免受冷冻损伤，保持单个核细胞复苏后的生理功能和生物学特性，确保单个核细胞冻存后有细胞增殖和分化能力。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种用于冻存单个核细胞的冻存液，由胎牛血清、二甲基亚砜和右旋糖酐溶解液组成，其中，胎牛血清占45～95％，右旋糖酐溶解液占10～50％，二甲基亚砜占5～10％，按体积百分比计；

所述右旋糖酐溶解液是指右旋糖酐的pbs溶液，右旋糖酐的浓度为0.1～2g/ml。

优选的，胎牛血清占70％，右旋糖酐溶解液占20％，二甲基亚砜占10％。

所述右旋糖酐，是指低分子量右旋糖酐，其分子量为4万左右。

本发明采用右旋糖酐溶解液代替部分胎牛血清，减少了外源蛋白的引入量，降低了动物病原污染的可能性；引入右旋糖酐，能够很好的代替血浆的功能，并阻碍红细胞的聚集。

所述用于冻存单个核细胞的冻存液的制备方法为：用1×pbs缓冲液溶解右旋糖酐(固体颗粒状)，使其终浓度为0.1～2g/ml(优选0.1g/ml)，得右旋糖酐溶解液；然后，将胎牛血清、二甲基亚砜与右旋糖酐溶解液混合混匀，即得。

所述用于冻存单个核细胞的冻存液在冻存单个核细胞中的应用。

一种单个核细胞的冻存方法：将新鲜提取的单个核细胞使用上述冻存液进行重悬；重悬后的细胞使用程序降温盒(nalgene程序降温盒，货号：5100-0001)置于-80℃超低温冰箱内24小时，然后转移至液氮中冷冻保存。

进一步地，所述单个核细胞为脐血单个核细胞，更进一步地，为外周血单个核细胞。

本发明的冻存液能够有效的保留单个核细胞提取后直接冻存时的细胞活性。单个核细胞使用本发明的冻存液冻存处理后，隔段时间如若复苏培养，细胞复苏率能够保持在较高水准，且细胞的分化能力依然很强。

附图说明

图1：单个核细胞冻存液1-12号冻存细胞复苏后次日活率对比图。

图2：单个核细胞冻存液1-12号冻存细胞复苏后14天扩增倍数对比图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

市场所售即用型细胞冻存液，专用于无血清培养条件下细胞的长时间低温保存。为了使细胞复苏率更高，该冻存液系列建议使用指数生长期细胞。本发明的实验目的是使新鲜提取的单个核细胞冻存复苏后细胞死亡率更低，复苏后培养能够正常生长并且细胞表型与预期相吻合。所以本发明决定在试验中使用几种即用型细胞冻存液做一下比较。

另外，本发明的发明人常用的单个核细胞冻存液配方即按体积比90％fbs+10％dmso,该配方适用于单个核细胞提取后在体外扩增培养完成后的相关冻存。该配方对于单个核细胞提取后的直接冻存是否适合尚未得到实验验证。

查阅资料还发现海藻糖对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，它能在低温环境下在细胞表面形成独特的保护膜，有效的保护蛋白质分子不变性失活。所以本发明的对比筛选实验中把海藻糖也加入其中。

首先，在市场选购一批即用型细胞冻存液,对其编号为：1号达优无血清细胞冻存液(货号：dwk3cfm0100)，2号同丽海源无血清细胞冻存液(货号：tl-501)，3号友康(货号：nc1001)，4号livecyte(货号：lc-1601)，5号sciencecellcfm(货号：0133)，6号经典配方90％fbs+10％dmso，7号cryopreservationmediumkmbankerⅱ(货号：88-702-cb)。

其次，查文献后，发明人配置了8-12号5种可能更适合新鲜提取的单个核细胞冻存的配方。其中，8号配方为按体积比95％fbs+5％dmso，9号配方为按体积比40％fbs+10％dmso+50％培养基，10号配方按体积比为70％fbs+20％右旋糖酐溶解液+10％dmso，11号配方为按体积比70％fbs+20％海藻糖+10％dmso，12号配方为按体积比75％fbs+20％海藻糖+5％dmso。通过单个核细胞冻存复苏培养后细胞生长的各项指标(细胞复苏活率、细胞的增值倍数等)对他们使用对比、剔除等方法筛选出符合要求的冻存液试剂配方。通过实验结果(如图1、2)对比分析后发现，本发明的10号单个核细胞冻存液(按体积比为70％fbs+20％右旋糖酐溶解液+10％dmso)据有很大优越性。本配方使用过后，复苏的冻存细胞活率较高，诱导培养后的细胞表型相对最好，细胞增长速度快。

本发明所用细胞培养基为corning88-581-cm淋巴细胞无血清培养基。

实施例1：制备右旋糖酐溶解液试剂

用分析天平称量4万分子量的右旋糖酐2g，放于50ml离心管内，用移液器吸取20ml1×pbs滴入上述离心管内，混合均匀后放于4℃冰箱内备用。

实施例2：制备单个核细胞冻存液6号(胎牛血清、二甲基亚砜)

按体积百分比取90％胎牛血清然后缓慢滴加10％二甲基亚砜，最后摇匀制备单个核细胞冻存液。于4℃保存备用。

实施例3：制备单个核细胞冻存液9号(胎牛血清、二甲基亚砜、细胞培养基)

按体积百分比取40％胎牛血清然后缓慢滴加10％二甲基亚砜，最后加入50％细胞培养基摇匀后制备成单个核细胞冻存液。于4℃保存备用。

实施例4：制备单个核细胞冻存液10号(胎牛血清、二甲基亚砜、右旋糖酐)

按体积百分比将70％胎牛血清、20％右旋糖酐溶解液(按照实施例1方法配置后备用)混匀，然后缓慢滴加10％二甲基亚砜，最后摇匀制备单个核细胞冻存液。于4℃保存备用。

实施例5

采用申请人所在公司新鲜单个核提取sop流程对一份脐血提取出新鲜单个核后对细胞计数，按照培养需求量2*10^7/ml取出等量的细胞，其中一份细胞直接新鲜培养14天收集数据，另外的细胞使用不同种单个核细胞冻存液进行冻存并置于液氮环境下保存一段时间后复苏培养14天。所有冻存液配制操作以及细胞冻存操作均需保证在0度环境下进行。通过多次对复苏后次日细胞活率即细胞复苏率及14天后细胞的扩增倍数进行交叉对比，选出了本发明的10号冻存液。

筛选实验结束后对整个实验的数据进行整理，为了更直观的表明本发明即10号细胞冻存液(20％右旋糖酐溶解液+70％胎牛血清+10％二甲基亚砜)的优点，做了以下两图：图1、图2。

由上述结果可以看出，使用细胞冻存液1-12号分别来冻存细胞，多次实验后复苏次日的细胞活率。3号冻存液细胞无细胞存活，1号、2号、4号、5号冻存液冻存复苏的细胞复苏活率的平均值低于其他组，图1显示10号冻存液的细胞复苏活率平均值最高。图2复苏培养细胞14天扩增倍数平均值看10号细胞的扩增倍数高于其他组。

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给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。本说明书引述的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，如同这些出版物、专利和专利申请各自特别地和个别地表明通过引用并入本文。