本发明属于细胞免疫领域，涉及一种降低-80℃冻存对cik细胞杀伤肿瘤活性的方法。
背景技术：
-80℃冻存常用于对cik细胞进行6个月内的短期保存。研究表明，-80℃冻存3个月可以基本保持cik细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，但是从第4个月开始，复苏后的cik细胞对肿瘤细胞的杀伤力显著降低(参考文献：不同冻存时间对cik细胞免疫表型及杀伤活性的影响，现代肿瘤医学，2016年05月第24卷第10期)。
上述缺陷影响了-80℃冻存对cik细胞6个月短期保存的效果。
技术实现要素：
本发明旨在克服现有技术不足，提供降低-80℃冻存对cik细胞杀伤肿瘤活性的方法。
本发明技术方案如下：
一种降低-80℃冻存对cik细胞杀伤肿瘤活性的方法，冻存前先用hsa-mir-543抑制剂预处理，所述hsa-mir-543抑制剂为蔓荆子二萜c。
一种-80℃冻存cik细胞的方法：取培养中的cik细胞，于冻存前一定时间在培养基中添加有效浓度的hsa-mir-543抑制剂蔓荆子二萜c，培养一定时间后，离心弃上清液，加入冻存液，调整细胞浓度至合适浓度，梯度降温至-80℃冻存。
优选地，于冻存前8h在培养基中添加有效浓度的hsa-mir-543抑制剂蔓荆子二萜c，培养8h后，离心弃上清液。
优选地，蔓荆子二萜c浓度为10μm。
优选地，冻存液由rpmi1640培养基、自体血浆和二甲基亚砜按体积比5:4:1混合而成。
优选地，调整细胞浓度至2×107/ml。
优选地，梯度降温方法为：首先于4℃冰箱中放置1h，然后-20℃冰箱中放置2h，转至-80℃低温冰箱放置。
一种降低-80℃冻存对cik细胞杀伤肿瘤活性的方法，冻存前先用hsa-mir-543抑制剂预处理，所述hsa-mir-543抑制剂为蔓荆子二萜d或蔓荆子二萜e。
一种-80℃冻存cik细胞的方法：取培养中的cik细胞，于冻存前一定时间在培养基中添加有效浓度的hsa-mir-543抑制剂蔓荆子二萜d或蔓荆子二萜e，培养一定时间后，离心弃上清液，加入冻存液，调整细胞浓度至合适浓度，梯度降温至-80℃冻存。
优选地，于冻存前8h在培养基中添加有效浓度的hsa-mir-543抑制剂蔓荆子二萜d或蔓荆子二萜e，培养8h后，离心弃上清液。
优选地，蔓荆子二萜d或蔓荆子二萜e浓度为10μm。
优选地，冻存液由rpmi1640培养基、自体血浆和二甲基亚砜按体积比5:4:1混合而成。
优选地，调整细胞浓度至2×107/ml。
优选地，梯度降温方法为：首先于4℃冰箱中放置1h，然后-20℃冰箱中放置2h，转至-80℃低温冰箱放置。
一种降低-80℃冻存对cik细胞杀伤肿瘤活性的方法，冻存前先用hsa-mir-543抑制剂预处理，所述hsa-mir-543抑制剂为山藿香定。
一种-80℃冻存cik细胞的方法：取培养中的cik细胞，于冻存前一定时间在培养基中添加有效浓度的hsa-mir-543抑制剂山藿香定，培养一定时间后，离心弃上清液，加入冻存液，调整细胞浓度至合适浓度，梯度降温至-80℃冻存。
优选地，于冻存前8h在培养基中添加有效浓度的hsa-mir-543抑制剂山藿香定，培养8h后，离心弃上清液。
优选地，山藿香定浓度为10μm。
优选地，冻存液由rpmi1640培养基、自体血浆和二甲基亚砜按体积比5:4:1混合而成。
优选地，调整细胞浓度至2×107/ml。
优选地，梯度降温方法为：首先于4℃冰箱中放置1h，然后-20℃冰箱中放置2h，转至-80℃低温冰箱放置。
有益效果：
本发明发现蔓荆子二萜c、d、e或山藿香定可以通过抑制cik细胞中hsa-mir-543的表达水平提高其在-80℃冻存6月后对肿瘤细胞的杀伤力，冻存前经蔓荆子二萜c、d、e或山藿香定预处理可以将其于-80℃冻存6月后对肿瘤细胞的杀伤力维持在冻存前的水平。因此，本发明提供的方法可以有效降低-80℃冻存对cik细胞杀伤肿瘤活性的不利影响。
附图说明
图1为药物干预对cik细胞中hsa-mir-543表达及冻存前后肿瘤杀伤力的影响。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
一、实验材料
蔓荆子二萜b、c、d、e、山藿香定和12-表山藿香定购买或自制，纯度均在95％以上。化学结构及cas登录号信息如下表所示。
rpmi1640培养基购自gibco公司。primescriprtmastermix(反转录试剂盒)、sybrpremixextaq(荧光定量pcr试剂盒)均购自大连宝生物公司。
二、实验方法
1、cik细胞分离、体外扩增、冻存与复苏
cik细胞的分离：采集健康志愿者外周抗凝全血，按等体积沿管壁缓慢加入到有20ml淋巴细胞分离液(ficoll液)的50ml离心管中，1800r/min，4℃离心20min，抽取白膜细胞层，pbs洗涤3遍得到外周血单个核细胞(pbmc)。同时吸取上层自体血浆，56℃灭活30min，室温下2000g离心10min，4℃保存备用。
cik细胞的体外扩增：将pbmc悬浮于含10％灭活的自体血浆的rpmi1640培养基，调整细胞密度1.5×106/ml，并加入ifn-γ(1000iu/ml)，细胞置37℃、5％co2培养箱中培养，24h后加入抗cd3mcab(50ng/ml)、rhil-2(500iu/ml)和rhil-1α(300iu/ml)。之后每隔2天添加含有5％自体血浆、1000iu/mlrhil-2的rpmi1640培养基，每次补液后将细胞密度控制为1.5×106/ml。培养15天后进行冻存。
cik细胞的冻存：取cik细胞，1000r/min离心10min，弃上清液，加入冻存液(rpmi1640培养基、自体血浆和二甲基亚砜体积比5:4:1)，调整细胞浓度至2×107/ml，首先于4℃冰箱中放置1h，然后-20℃冰箱中放置2h，转至-80℃低温冰箱放置6个月。
cik细胞的复苏：从-80℃冰箱中取出冻存的cik细胞，迅速放入37℃水浴锅内融化，用rpmi1640培养基洗涤，按1.5×106/ml的细胞密度悬浮于含1000iu/mlrhil-2、5％自体血浆的rpmi1640培养基，37℃、5％co2培养箱中培养。
2、分组和给药
实验分组包括未冻存组、冻存6月组，具体处理方法如下：
未冻存组：培养15天收集的未冻存cik细胞；
冻存6月组：培养15天后冻存6个月的cik细胞；冻存前，cik细胞经0或10μm药物(蔓荆子二萜b、c、d、e、山藿香定或12-表山藿香定)干预8小时。
3、cck-8法检测冻存后cik细胞杀伤活性
选对数生长期的k562细胞作为靶细胞，调整细胞密度均为1×105/ml；取未冻存组和冻存6月组复苏的cik作为效应细胞，1500r/min，离心5min，弃上清，并用rpmi1640培养液洗涤，调整cik细胞密度为2×106/ml(效靶比为20:1)。该实验分为实验组、效应细胞组、靶细胞组，每组设3个复孔，实验组于96孔板每孔加效应细胞、靶细胞各100μl；靶细胞组每孔加入靶细胞、rpmi1640培养液各100μl；效应细胞组每孔加入效应细胞、rpmi1640培养液各100μl，置37℃、5％co2培养箱中培养24h后，每孔加入cck8溶液20μl，37℃孵育4h，终止培养，选择全自动酶标检测仪(波长450nm)检测吸光度值(od值)，并按照如下公式计算cik细胞对肿瘤的杀伤率。
杀伤率(％)＝[1-(实验孔od值-效应孔od值)/靶细胞孔od值]×100％。
4、药物干预对cik细胞中hsa-mir-543表达的影响
分别取经0或10μm药物(蔓荆子二萜b、c、d、e、山藿香定或12-表山藿香定)干预8小时的cik细胞，pbs洗涤，收集细胞，加入trizol提取细胞总rna，测定浓度后，用primescriprtmastermix(反转录试剂盒)，按照500ng/10μl的体系反转录成50μl的cdna，用sybrpremixextaq(荧光定量pcr试剂盒)以20μl体系在abi7500实时荧光定量pcr仪上检测hsa-mir-543的表达水平。用β-actin基因表达水平作为内参，计算hsa-mir-543/β-actin基因的比值代表hsa-mir-543的相对表达水平。
qrt-pcr引物如下：
hsa-mir-543正向引物序列5’-ggggaaacattcgcggtgca-3’；
hsa-mir-543反向引物序列5’-tgcgtgtcgtggagtc-3’；
β-actin正向引物序列5’-gtgcacagattagctgtctac-3’；
β-actin反向引物序列5’-tactcatgcgtcttgtatcgc-3’。
5、统计学方法
用spss19.0统计软件进行统计学分析，数据采用均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，p＜0.05表示差异有统计学意义。
三、实验结果
1、药物干预对cik细胞冻存前后肿瘤杀伤力的影响
与未冻存组相比，未经药物干预的cik细胞冻存6个月后对k562细胞的杀伤力显著降低(p＜0.05)；与未冻存组相比，冻存前经10μm蔓荆子二萜c、d、e或山藿香定干预8小时的cik细胞冻存6个月后对k562细胞的杀伤力无显著差异(p＞0.05)；而蔓荆子二萜b、12-表山藿香定不具备这种作用，与未冻存组相比杀伤力显著降低(p＜0.05)。
结果如表1和图1所示。
2、药物干预对cik细胞中hsa-mir-543表达的影响
与未经药物干预的cik细胞相比，经10μm蔓荆子二萜c、d、e或山藿香定干预8小时的cik细胞中的hsa-mir-543表达水平显著降低(p＜0.05)，而10μm蔓荆子二萜b或12-表山藿香定干预8小时并不能明显降低cik细胞中hsa-mir-543的表达水平(p＞0.05)。
结果如表1所示。
表1药物干预对cik细胞中hsa-mir-543表达及冻存前后肿瘤杀伤力的影响
综上，本发明发现蔓荆子二萜c、d、e或山藿香定可以通过抑制cik细胞中hsa-mir-543的表达水平提高其在-80℃冻存6月后对肿瘤细胞的杀伤力，冻存前经蔓荆子二萜c、d、e或山藿香定预处理可以将其于-80℃冻存6月后对肿瘤细胞的杀伤力维持在冻存前的水平。因此，本发明提供的方法可以有效降低-80℃冻存对cik细胞杀伤肿瘤活性的不利影响。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。