一种蛋白纳米脂质体制剂及其在制备生物纳米植物生长调节剂中的应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种蛋白纳米脂质体制剂及其在制备生物纳米植物生长调节剂中的应用。

背景技术：

纳米生物技术是指用于研究生命现象的纳米技术，它是纳米技术和生物学的结合，同时也是一门涉及物理学、化学、量子学、机械学、材料学、电子学、计算机学、生物学、医学等众多领域的综合性交叉学科。是国际生物技术领域的前沿和热点问题，在医药卫生领域有着广泛的应用和明确的产业化前景，特别是纳米药物载体、纳米生物传感器和成像技术以及微型智能化医疗器械等，将在疾病的诊断、治疗和卫生保健方面发挥重要作用。国际上纳米生物技术在医药领域的研究已取得一定的进展。

纳米结构脂质载体是将固体脂质和空间上不相容的液体脂质在一定温度下混合制备得到的纳米粒给药载体。通过形成一些含纳米隔室的脂质骨架，提高药物载药量，避免存储过程中药物被排挤，与传统载体系统相比其具有更高的载药能力及降低储藏过程包封药物泄露的问题。

技术实现要素：

本发明的目的是提供了一种蛋白纳米脂质体制剂及其在制备生物纳米植物生长调节剂中的应用。所述制剂是通过生物纳米技术构建了超敏蛋白的纳米脂质载体，然后通过静电结合将壳寡糖包覆于脂质载体的外层制得。该蛋白纳米脂质体制剂具有稳定的纳米结构，该制剂在盐酸条件下不变性。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种蛋白纳米脂质体制剂，所述制剂包括以下组分：以重量份计，大豆磷脂5-15份、胆固醇1-5份、壳寡糖1-10份、超敏蛋白1-10份；所述制剂通过以下制备方法制得：

（1）将大豆磷脂和胆固醇分别分散到乙醇中，然后利用乙醇挥发法混合制备得到空白纳米脂质载体；

（2）在低温下将超敏蛋白加入到空白纳米脂质载体中，进行超声或是高速剪切，然后孵化；

（3）孵化一段时间后加入壳寡糖，继续孵化，得到蛋白纳米脂质体制剂。

进一步的：所述步骤（1）中大豆磷脂和胆固醇分散到乙醇中的质量体积比浓度是10%-40%。

进一步的：所述步骤（2）中低温的温度范围为10-25℃。

进一步的：所述步骤（3）孵化2~12h后加入壳聚糖。

进一步的：所述步骤（3）孵化温度为10-25℃。

本发明还提供了所述的蛋白脂质体制剂在用于制备生物纳米植物生长调节剂中的应用。

进一步的：所述蛋白脂质体制剂在所述植物生长调节剂中的使用质量比浓度为0.1-10%。

进一步的：所述蛋白脂质体制剂直接溶于水中，直接喷雾在叶面的正面或反面；或浸种、蘸根、根部施用。

进一步的：所述植物包括大葱、烟叶、青椒、大豆、棉花和茶叶。

与现有技术相比，本发明的优点和有益效果为：本发明提供的蛋白纳米脂质体制剂不是单纯的物理组合，而是通过新型生物纳米技术构建了超敏蛋白的纳米脂质载体，然后通过静电结合将壳寡糖包覆于脂质载体的外层，使该生物纳米植物生长调节剂具有稳定的纳米结构，一方面提高超敏蛋白的稳定性，使其稳定性提高了两倍，另一方面，外层包覆的壳寡糖不仅增加了纳米载体的稳定性，同时还跟超敏蛋白发挥协同效应，共同诱导植物产生广谱的抗性、增强植物的自身防卫能力、抑制多种植物病原微生物的生长，而且其无毒并可为微生物降解，对环境不会产生污染。本发明提供了一种技术含量高且治疗效果好的新型纳米植物生长调节剂。

附图说明

图1为未过滤膜的空白超敏蛋白溶液的粒径测定结果示意图；

图2为未过滤膜的空白超敏蛋白溶液的电位测定结果示意图；

图3为过0.8µm膜的空白超敏蛋白溶液的粒径测定结果示意图；

图4为过0.8µm膜的空白超敏蛋白溶液的电位测定结果示意图；

图5为过0.8µm膜的空白脂质体粒径测定结果示意图；

图6为过0.8µm膜的空白脂质体电位测定结果示意图；

图7为过0.8µm膜的超敏蛋白脂质载体粒径测定结果示意图；

图8为过0.8µm膜的超敏蛋白脂质载体电位测定结果示意图；

图9为过0.8µm膜的壳寡糖修饰的超敏蛋白纳米脂质载体01粒径测定结果示意图；

图10为过0.8µm膜的壳寡糖修饰的超敏蛋白纳米脂质载体01电位测定结果示意图；

图11为过0.8µm膜的壳寡糖修饰的超敏蛋白纳米脂质载体02粒径测定结果示意图；

图12为过0.8µm膜的壳寡糖修饰的超敏蛋白纳米脂质载体02电位测定结果示意图；

图13为蛋白脂质体制剂性质测定结果示意图；

图14为蛋白脂质体制剂与去离子水或者盐酸反应结果示意图，其中从左到右依次是蛋白原溶液加水、蛋白原溶液加盐酸、蛋白脂质体溶液（大豆磷脂:壳寡糖=4：1）加水、蛋白脂质体溶液（大豆磷脂:壳寡糖=4：1）加盐酸、蛋白脂质体溶液（大豆磷脂:壳寡糖=2：1）加水、蛋白脂质体溶液（大豆磷脂:壳寡糖=2：1）加盐酸。

图15是蛋白脂质体制剂用于大葱的实验结果对比图，其中右侧为现有普通蛋白，左侧为本发明所述蛋白脂质体制剂。

图16是蛋白脂质体制剂用于烟叶的实验结果对比图，其中上侧为现有普通蛋白，下侧为本发明所述蛋白脂质体制剂。

图17是蛋白脂质体制剂用于大豆的实验结果对比图，其中左侧为现有普通蛋白，右侧为本发明所述蛋白脂质体制剂。

图18是蛋白脂质体制剂用于青椒的实验结果对比图，其中右侧为现有普通蛋白，左侧为本发明所述蛋白脂质体制剂。

具体实施方式

下面通过附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

实施例1

本发明提供了一种蛋白纳米脂质体制剂，其包括以下组分：大豆磷脂5-15份、胆固醇1-5份、壳寡糖1-10份、超敏蛋白1-10份，以重量份计。

所述蛋白纳米脂质体制剂的制备方法具体包括以下步骤：

（1）先将大豆磷脂5-15份、胆固醇1-5份加入乙醇中，低温加热，挥干乙醇，加入10-100倍水，振荡器震荡10-30分钟，制备空白脂质载体；

（2）在低温下（25摄氏度左右）将上述用量的超敏蛋白加入到所述空白纳米脂质载体中，进行超声或是高速剪切，然后孵化；

（3）孵化2-12h之后加入适量壳寡糖，继续孵化，得到蛋白纳米脂质体制剂。并测定不同时间点的纳米粒径及电位。

实施例2

1、所述生物纳米植物生长调节剂蛋白的稳定性测定

（1）空白超敏蛋白溶液的粒径和电位的测定，其中，未过膜时的粒径为2037.9nm，见图1；电位为-15.60mv，见图2。过0.8µm的膜后的粒径为1504.1nm，见图3；电位为-12.56mv，见图4。

（2）脂质体粒径和电位的测定，其中，空白脂质体为未包载超敏蛋白的空白脂质体，过0.8µm膜的粒径为273.8nm，见图5，电位为-20.33mv，见图6。包载超敏蛋白的脂质纳米载体过0.8µm膜的粒径为699.8nm，见图7，电位为-3.85mv，见图8。证明包载蛋白之后脂质载体粒径变大，电位也发生了明显变化。

（3）壳寡糖（壳寡糖占所述蛋白脂质体的质量比为5%-10%）修饰超敏蛋白纳米脂质载体01，过0.8µm膜的粒径为570.9nm，见图9，电位为-6.50mv，见图10。

（4）壳寡糖（壳寡糖占所述蛋白脂质体的质量比为1%-3%）修饰超敏蛋白纳米脂质载体02，过0.8µm的膜的粒径为456.8nm，见图11，电位为-7.25mv，见图12。

经实验结果可证明：超敏蛋白被包裹在脂质载体内部，且所述蛋白纳米脂质体制剂的粒径在纳米范围之内，能保持稳定。

2、所述蛋白纳米脂质体制剂的稳定性初步评价

（1）将空白脂质体和制备得到的包载蛋白的脂质体放置五天之后观察其稳定性，发现包载蛋白的脂质体制剂并未出现明显沉淀现象，见图13，从图中可以得知制得的制剂稳定，符合使用要求。图13中的20和40均代表温度20℃和40℃，特别说明在40℃时，包载蛋白的纳米粒的稳定性明显高于普通蛋白溶液组，这对于夏天温度过高时的运输和储存意义重大，这样的话就可以显著延长蛋白的保存时间，降低成本，发挥更好的疗效。

（2）选取滴加盐酸的方法来检测所述蛋白纳米脂质体制剂的优势以及稳定性

具体操作如下：取等量的不同溶液各两份放入六个相同的西林瓶中，加入等量的去离子水或者盐酸，振摇，观察并记录现象，结果如图14所示。从左到右依次是超敏蛋白原溶液加水、超敏蛋白原溶液加盐酸、超敏蛋白脂质体溶液（大豆磷脂:壳寡糖=4：1）加水、超敏蛋白脂质体溶液（大豆磷脂:壳寡糖=4：1）加盐酸、超敏蛋白脂质体溶液（大豆磷脂:壳寡糖=2：1）加水、超敏蛋白脂质体溶液（大豆磷脂:壳寡糖=2：1）加盐酸。从图14中可以清楚的观察到，蛋白原溶液在盐酸条件下容易变性，而制成的纳米制剂溶液不容易变性；纳米制剂溶液则明显比蛋白原溶液具有更好的稳定性，脂质体对蛋白具有优良的保护作用。

实施例3

将所述蛋白脂质体制剂直接溶于清水中（ph中性，7-8左右），直接喷雾在叶面的正面或反面；也可浸种、蘸根、根施，用清水稀释1000倍使用，剂量（液体）的规格为15ml/100ml/250ml/500ml（其中超敏蛋白的质量比含量0.1-10%）。

使用时期：从种子浸种到收获时期均可以使用。可与其他酸性肥料或农药配合使用。一季作物一般喷施3-5次，两次喷施中间间隔15-20天。请将本品存放于阴凉、通风、干燥处。不要与强酸、强碱、强离子型制剂或溶剂一起使用。本品无毒无害，无须作其它特殊防护。

将所述蛋白脂质体制剂作为生物纳米植物生长调节剂施用于几种植物，实验结果如图15-18所示，从图中可以看出，将本发明所述蛋白脂质体制剂用于大葱、烟叶、青椒和大豆时，明显施用所述蛋白脂质体制剂的作物生长更加旺盛，抗虫害能力提高，叶面更加发绿，表现出生长旺盛的情况，提高了自身免疫力。

适用于大田作物以及蔬菜、瓜果、棉花、烟草、茶叶、花卉等经济作物，在种期、苗期、花期及果期使用效果均很好，发芽率高、根多、苗高、苗壮、叶片饱满、叶绿素含量高。在辣椒、烟草、大豆等上使用均较好，具有其独特的作用机理和明显的防病、抗虫、增产效果。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。