本发明涉及农作物组织培养的技术领域，具体涉及一种菊叶薯蓣组织培养繁育方法。
背景技术：
菊叶薯蓣是引自墨西哥的外来种，主要用其根茎提取薯蓣皂素和发酵生产燃料乙醇。菊叶薯蓣因块茎产量高，皂素和淀粉含量高，提取皂素和发酵生产乙醇的生产成本低而引起重视。
组培快繁是近些年来在种苗繁殖过程中应用得最为广泛的一门新兴实用技术，目前，世界上已有几千种植物通过组织培养获得成功，但能大量应用于生产并能产生经济效益的仅有几十种，如香蕉、甘蔗、兰花、非洲菊、马铃薯等。对于菊叶薯蓣，仍需探索一种提高炼苗成活率、高效稳定、生产成本低的组培繁殖方法，以实现产业化生产。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种菊叶薯蓣组织培养繁育方法，以解决上述问题。
根据本发明的一个方面，提供了一种菊叶薯蓣组织培养繁育方法，包括以下步骤：
(1)外植体的获取与灭菌：选择长势健壮、没有病虫危害、带3～4叶、带有茎尖部位的菊叶薯蓣的茎段作为外植体，把叶子剪掉，留下带腋芽的茎段，将带腋芽的茎段放入洗涤灵溶液中搅拌，再用流动水冲洗，然后将清洗后的茎段先用酒精浸泡，再用naclo浸泡，然后用无菌水漂洗，得到无菌外植体；
(2)外植体的接种：将菊叶薯蓣无菌外植体接种在液体培养基上，获得根叶俱全的试管苗；
(3)增殖生根：将步骤(2)获得的试管苗转接在固体培养基上进行增殖和生根；
(4)试管苗移栽：试管苗出瓶移栽前，将根叶俱全的幼苗分成单株，出瓶的幼苗先用灭菌液浸泡，随后将幼苗移至有顶玻璃的移栽容器中，在温度为20-25℃，湿度为75-85％的条件下生长，待小苗高2-3cm，表示移栽成活；
(5)田间繁育：将移栽成活的幼苗，在自然条件下炼苗3-5天，然后移栽至大田进行繁育。
本发明中，pba表示四氢吡喃苄基腺嘌呤，naa表示萘乙酸，ga3表示赤霉素，kt表示激动素，ba表示6-苄基氨基嘌呤，ad表示雄甾-4-烯-3,17-二酮。
在一些实施方式中，液体培养基的成分为：2/3ms+pba0.1-0.8mg/l+naa0.2-0.8mg/l+ga30.2-0.5mg/l+kt0.2-0.4mg/l+3％蔗糖+0.1％活性炭+15-20g/l番薯汁+30-40g/l椰子汁，ph值为5.8-6.2。
在一些实施方式中，固体培养基的成分为：ms+ba0.5-1.0mg/l+ad5-10mg/l+kt0.2-0.4mg/l+3％蔗糖+0.75％琼脂+0.2-0.3％活性炭+20-40g/l椰子汁，ph值为6.0-6.5。
在一些实施方式中，ms包括以下成分：硝酸铵1650mg/l、硝酸钾1900mg/l、氯化钙440mg/l、硫酸镁370mg/l、磷酸二氢钾170mg/l、硫酸锰22.3mg/l、硫酸锌8.6mg/l、氯化钴0.025mg/l、硫酸铜0.025mg/l、硼酸6.2mg/l、钼酸钠0.25mg/l、碘化钾0.83mg/l、硫酸亚铁27.8mg/l、乙二胺四乙酸二钠37.2mg/l、烟酸0.5mg/l、维生素b60.5mg/l、维生素b10.1mg/l、肌醇100mg/l、甘氨酸2mg/l。
在一些实施方式中，液体培养基还包括pvp100mg/l。由此，可以抑制外植体褐化。
在一些实施方式中，步骤(2)和步骤(3)的培养温度为24±2℃，1000～2000lx弱光环境中，采用红光或白光，每天16小时光照培养。
在一些实施方式中，步骤(4)中，所述灭菌液为700-1000倍的甲基托布津。
优选的，本发明的菊叶薯蓣组织培养繁育方法，包括以下步骤：
(1)外植体的获取与灭菌：选择长势健壮、没有病虫危害、带3～4叶、带有茎尖部位的菊叶薯蓣的茎段作为外植体，把叶子剪掉，留下带腋芽的茎段，将该带腋芽的茎段放入洗涤灵溶液中搅拌5-10min，再用流动水冲洗10-20min，然后将清洗后的茎段先用75％酒精浸泡30-40s，再用5-20％naclo浸泡5-15min，然后用无菌水漂洗4-6次，得到无菌外植体；
(2)外植体的接种：将菊叶薯蓣无菌外植体接种液体培养基上，获得根叶俱全的试管苗；所述液体培养基的成分为：2/3ms+pba0.1-0.8mg/l+naa0.2-0.8mg/l+ga30.2-0.5mg/l+kt0.2-0.4mg/l+3％蔗糖+0.1％活性炭+15-20g/l番薯汁+30-40g/l椰子汁，ph值为5.8-6.2；
(3)增殖生根：将步骤(2)获得的试管苗转接在固体培养基上进行增殖和生根；所述固体培养基的成分为：ms+ba0.5-1.0mg/l+ad5-10mg/l+kt0.2-0.4mg/l+3％蔗糖+0.75％琼脂+0.2-0.3％活性炭+20-40g/l椰子汁，ph值为6.0-6.5；
(4)试管苗移栽：试管苗出瓶移栽前，将根叶俱全的幼苗分成单株，出瓶的幼苗先用700-1000倍的甲基托布津浸泡10-15分钟，随后将幼苗移至有顶玻璃的移栽容器中，在温度为20-25℃，湿度为75-85％的条件下生长，待其小苗高2-3cm，表示移栽成活；
(5)田间繁育：将移栽成活的幼苗，在自然条件下炼苗3-5天后，移栽至大田进行繁育。
本发明采用前期浅层液体培养和后期固体培养相结合的培养模式，通过优化培养基配方组成，以降低菊叶薯蓣组培苗继代增殖过程中的有害物质，显著提高菊叶薯蓣组培苗继代增殖系数、缩短继代周期，减少继代次数。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
本实施例的菊叶薯蓣组织培养繁育方法，包括以下步骤：
(1)外植体的获取与灭菌：
选择长势健壮、没有病虫危害、带3～4叶、带有茎尖部位的菊叶薯蓣的茎段作为外植体，把叶子剪掉，留下带腋芽的茎段，将该带腋芽的茎段放入洗涤灵溶液中搅拌5min，再用流动水冲洗20min，然后将清洗后的茎段先用75％酒精浸泡30s，再用20％naclo浸泡10min，然后用无菌水漂洗5次，得到无菌外植体；
(2)外植体的接种：
对菊叶薯蓣无菌外植体进行剪切，并取带芽节段9段接种液体培养基上，液体培养基的成分为：2/3ms+pba0.5mg/l+naa0.6mg/l+ga30.5mg/l+kt0.4mg/l+3％蔗糖+0.1％活性炭+20g/l番薯汁+30g/l椰子汁，ph值为5.9，培养温度为24±2℃，1100lx弱光环境中，采用白光，每天光照时间为16小时，培养35天，期间定期进行无菌性检测以保证母瓶无菌及种苗的可靠性，获得根叶俱全的试管苗；
(3)增殖生根：
将步骤(2)获得的试管苗转接在固体培养基上进行增殖和生根，在更换培养基时将试管苗用ms营养液浸泡4min，固体培养基的成分为：ms+ba1.0mg/l+ad8mg/l+kt0.3mg/l+3％蔗糖+0.75％琼脂+0.3％活性炭+40g/l椰子汁，ph值为6.5，培养温度为24±2℃，1700lx弱光环境中，采用白光，每天光照时间为16小时，培养周期为45天；
(4)试管苗移栽：
试管苗出瓶移栽前，将根叶俱全的幼苗分成单株，出瓶的幼苗先用800倍的甲基托布津浸泡12分钟，随后将幼苗移至有顶玻璃的移栽容器中，在温度为24℃，湿度为80％的条件下生长，待其小苗高2-3cm，表示移栽成活；
(5)田间繁育：
将移栽成活的幼苗，在自然条件下炼苗4天后，移栽至大田进行繁育。
实施例2
本实施例与实施例1的不同之处在于，步骤(2)中，液体培养基的成分为：2/3ms+pba0.8mg/l+naa0.5mg/l+ga30.3mg/l+kt0.4mg/l+3％蔗糖+0.1％活性炭+15g/l番薯汁+35g/l椰子汁，ph值为6.1。
步骤(3)中，固体培养基的成分为：ms+ba0.8mg/l+ad10mg/l+kt0.4mg/l+3％蔗糖+0.75％琼脂+0.3％活性炭+40g/l椰子汁，ph值为6.2。
实施例3
本实施例与实施例1的不同之处在于，步骤(2)中，液体培养基的成分为：2/3ms+pba0.3mg/l+naa0.8mg/l+ga30.4mg/l+kt0.3mg/l+3％蔗糖+0.1％活性炭+20g/l番薯汁+30g/l椰子汁，ph值为5.8。
步骤(3)中，固体培养基的成分为：ms+ba1.0mg/l+ad10mg/l+kt0.4mg/l+3％蔗糖+0.75％琼脂+0.3％活性炭+40g/l椰子汁，ph值为6.3。
实施例4
本实施例与实施例1的不同之处在于，步骤(2)中，液体培养基的成分为：2/3ms+pba0.1mg/l+naa0.7mg/l+ga30.5mg/l+kt0.3mg/l+3％蔗糖+0.1％活性炭+15g/l番薯汁+30g/l椰子汁，ph值为6.0。
步骤(3)中，固体培养基的成分为：ms+ba0.9mg/l+ad10mg/l+kt0.4mg/l+3％蔗糖+0.75％琼脂+0.3％活性炭+25g/l椰子汁，ph值为6.3。
以上实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。