r>[0040]图1为本发明一种改良型甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系的改良方法的 流程图；
[0041] 图2为RC947单株与原始恢复系R2000的分子标记筛选结果。
【具体实施方式】
[0042] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
[0043] 实施例1
[0044] 一种改良型甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系的改良方法，包括以下步骤 (其流程图见图1):
[0045] (1)以甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育系Fu58Drakkar(以下简称不育系 Fu58Drakkar)为母本，以甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系R2000(以下简称恢复系 R2000)为父本，杂交获得种子；
[0046] 本实施例中，为扩大母本和父本的种源，先用保持系G142(为浙江省农业科学院 作物与核技术利用研究所油菜育种组自育材料，后更名为浙油50)将不育系Fu58Drakkar 保持一代，同时恢复系R2000自交一代；再以不育系Fu58Drakkar或保持系G142保持的不 育系Fu58Drakkar BC0(其与不育系Fu58Drakkar的基因型相同）为母本，与父本恢复系 R2000杂交，获得Fjf种子约500g。
[0047] (2)对匕代种子进行辐照处理，辐照处理后将Fi代种子播种，得到F玳植株；
[0048] 以6°Co作为辐照源，分别以lOOOGy，2000Gy，3000Gy和4000Gy为辐照剂量，剂量率 均为1. 2Gy/min。对匕代种子进行辐照处理（室温下进行），辐照处理在浙江省农业科学 院作物与核技术利用研究所浙江省辐照中心内完成，以筛选合适的半致死剂量。最终确定 的辐照剂量为2000Gy、剂量率为1. 2Gy/min。
[0049] (3)以不育系Fu58Drakkar BC0为母本，以Fi代植株为父本，杂交获得种子，将种 子播种，得到后代植株；
[0050] (4)淘汰后代植株中的不育株，对可育株进行单株分子标记筛选，获得改良型甘蓝 型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系。
[0051] 具体地：分别提取可育株单株幼嫩叶片的基因组DNA，并以基因组DNA为模板，利 用引物进行PCR扩增；
[0052]用于筛选的分子标记为Bonjon(参见Primard-Brisset Cet al. 2005. A new recombined double low restorer line for the Ogu-INRAcms in rapeseed(Brassica napus L.).Theor.Appl. Genet. Ill:736-746. )、0PF10(参见Wu Yet al. 2000. Abinary vector-based large insert library for Brassica napus and identification of clones linked to a fertility restorer locus for Ogura cytoplasmic male sterile(CMS) .Genome 43:102-109.)、0PN20和G26(Christopher PS et al.2005. Improved fertility restoration for Ogura cytoplasmic male sterile Brassica and method. W02005074671A1, World Intellectual Property Organization·)，根据分子标记 的序列分别设计引物并委托上海生物工程有限公司合成。合成后的引物序列见表1。
[0053]表1
[0054]
[0055]PCR程序为：94°C预变性5min ;然后94°C变性30s，55°C退火30s(退火温度依据梯 度PCR结果而定），72°C复性45s，循环35次；最后72°C保温lOmin。
[0056] 将PCR产物保存于4°C冰箱备用。PCR产物电泳后用凝胶成像仪（北京君意东方， JY04S-3D)记录结果。
[0057] 本实施例中，改良型恢复系R2000的筛选程序为：
[0058] ①利用检测0PN20的引物对每株可育株的基因组DNA进行PCR扩增，检测可育株 是否缺失该标记，筛选出缺失0PN20的可育株；
[0059] ②利用检测0PF10的引物对每株缺失0PN20的可育株的基因组DNA进行PCR扩增， 筛选出缺失0PN20-0PF10的可育株；
[0060] ③利用检测Bonjon的引物对每株缺失0PN20-0PF10的可育株的基因组DNA进行 PCR扩增，筛选出缺失0PN20-0PF10-BonJon的可育株；
[0061] ④利用检测G26的引物对每株缺失0PN20-0PF10-BonJon的可育株的基因组DNA 进行PCR扩增，筛选出缺失0PN20-0PF10-BonJon但具备G26的可育株即为改良型恢复系 R2000〇
[0062] 通过以上程序最终筛选出一株编号为RC947的可育单株，即为本实施例的改良型 恢复系R2000。RC947单株与原始恢复系R2000的分子标记比对分析结果见表2和图2。
[0063]表2
[0064]
[0065] 由表2可见，在原始恢复系R2000中四个分子标记均被检测到，而在RC947单株中 均无检测到0PN20、0PF10、Bonjon，但G26仍然存在；这表明RC947单株的恢复基因仍然存 在，对Ogura细胞质雄性不育系仍然具有恢复育性能力，同时也缺失了原始恢复系R2000所 具备的不良农艺性状。
[0066]因此，RC947单株含有更短的萝卜恢复基因片段，是获得的新恢复株系，可作为Ogura细胞质雄性不育三系杂交育种的新恢复材料。
【主权项】
1. 一种改良型甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系，其特征在于，它由以下方式改 良： (1) 以甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育系为母本，以甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育 恢复系为父本，杂交获得匕代种子； (2) 对h代种子进行辐照处理，辐照处理后将Fi代种子播种，得到F植株； (3) 以甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育系为母本，以匕代植株为父本，杂交获得种子， 将种子播种，得到后代植株； (4) 对所述后代植株中的可育株进行单株分子标记筛选； 最终获得所述改良型甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系。2. 如权利要求1所述的改良型甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系，其特征在于， 步骤（4)中，所述分子标记包括G26 ;以及Bonjon、0PF10或0PN20中的至少一种。3. -种改良型甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系的改良方法，其特征在于，包括 以下步骤： (1) 以甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育系为母本，以甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育 恢复系为父本，杂交获得匕代种子； (2) 对匕代种子进行辐照处理，辐照处理后将Fi代种子播种，得到F植株； (3) 以甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育系为母本，以匕代植株为父本，杂交获得种子， 将种子播种，得到后代植株； (4) 对所述后代植株中的可育株进行单株分子标记筛选，获得所述改良型甘蓝型油菜 萝卜细胞质雄性不育恢复系。4. 如权利要求3所述的改良方法，其特征在于，所述甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育 系为不育系Fu58Drakkar。5. 如权利要求3所述的改良方法，其特征在于，所述甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育 恢复系为恢复系R2000。6. 如权利要求3所述的改良方法，其特征在于，步骤⑵中，采用6°Coγ射线对F1代 种子进行均匀辐照，辐照剂量为1200~2600Gy，剂量率为1. 2Gy/min。7. 如权利要求3或6所述的改良方法，其特征在于，步骤（2)中，采用6°Coγ射线对F1 代种子进行均匀辐照，辐照剂量为2000Gy，剂量率为1. 2Gy/min。8. 如权利要求3所述的改良方法，其特征在于，步骤（4)中，所述分子标记包括G26 ;以 及Bonjon、0PF10或0PN20中的至少一种。9. 如权利要求3或8所述的改良方法，其特征在于，所述分子标记筛选包括：分别提取 可育株单株的基因组DNA，并以基因组DNA为模板，利用引物进行PCR扩增，根据扩增结果筛 选改良型甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系； 其中，第一对引物为： 上游引物：5' -GATCCGATTCTTCTCCTGTTG-3' ； 下游引物：5' -GCCTACTCCTCAAATCACTCT-3' ； 第二对引物为： 上游引物：5' -AACTTTTTGTGTTTGATTTCTTGC-3' ； 下游引物：5' -ACTCCTTCTAAACAAAACCAAACA-3' ； 第三对引物为： 上游引物：5' -CCTTAGITTAGTTGTAGGTGGTGG-3' ； 下游引物：5' -AGAAACCGCTCAATTTTAACATAA-3' ； 第四对引物为： 上游引物：5' -GCTCACCTCATCCATCTTCCTCAG-3' ； 下游引物：5' -CTCGTCCTTTACCTTCTGTGGTTG-3'。10.分子标记组合物在筛选改良型甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系中的应用， 其特征在于，所述分子标记组合物为G26、Bonjon、0PF10和0PN20。
【专利摘要】本发明公开了一种改良型甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系及其改良方法，该改良方法包括：以甘蓝型油菜Ogura？CMS不育系为母本，以甘蓝型油菜Ogura？CMS恢复系为父本，杂交获得F1代种子；对F1代种子进行辐照处理，辐照处理后播种得到F1代植株；以甘蓝型油菜Ogura？CMS不育系为母本，以F1代植株为父本，杂交获得种子，种子播种后得到后代植株；对后代植株中的可育株进行单株分子标记筛选，获得改良型甘蓝型油菜Ogura？CMS恢复系。本发明剔除了外源萝卜染色体片段中几个与恢复基因紧密连锁的分子标记，筛选获得具有更短外源萝卜染色体片段的改良型恢复系，改良型恢复系具有优良农艺形状和更高籽粒产量。
【IPC分类】A01H1/04, A01H1/06, A01H1/02
【公开号】CN105248273
【申请号】CN201510741364
【发明人】华水金, 张冬青, 张永平
【申请人】浙江省农业科学院, 温州嘉友生物科技有限公司
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年11月4日