X 15mm)，Parafi Im封口，室温下 (例如约25-28°C)暗培养15-25天。通常情况下是在25°C暗培养大约21天左右。由此可 获得愈伤组织。
[0045] 诱导培养后，可将所得愈伤组织转移至分化培养基上。
[0046] 通常在25土 1°C，每天10~12小时光照的条件下分化培养25~30天，直至分化 出绿色再生植株。分化培养可使用本发明的分化培养基进行。
[0047] 分化出的再生植株可转入添加有NAA 0· 02-0. 08mg/L、多效唑（MET) 2. O-KX Omg/ L和蔗糖10_40g/L，ρΗ5· 6-6. 0的1/2MS生根壮苗培养基。在25土 1°C，每天10~12小时 光照的条件下进行25~30天的生根壮苗培养。
[0048] 生根壮苗培养基中，NAA的优选浓度范围为0. 03-0. 06mg/L，更优选为 0· 04-0. 05mg/L ;MET的优选浓度范围为3. 0-8. Omg/L，更优选为4. 0-6. Omg/L。在一具体实 施例中，MET的浓度为5. Omg/L ;蔗糖的优选浓度范围为20-30g/L。在一具体实施例中，蔗 糖的浓度为20g/L。
[0049] 生根壮苗培养基的pH优选为5. 8-5. 9。
[0050] 适用于由禾谷类作物游离小孢子获得单倍体植株的诱导培养基尤其可选用CN 201310596632. 4中披露的改造的N6诱导培养基。具体而言，该诱导培养基以表1所示的 N6培养基为基础，所不同的是含有0_2500mg/L的KNO3和0-400mg/L的（NH 4) SO4，并添加有 400-2500mg/L的水解干酪素和400-2500mg/L的谷氨酰胺：
[0051] 表1 :N6培养基的配方（单位：mg/L):
[0052]
[0053] 更优选地，使用CN 201310596632. 4表2所披露的诱导培养基。本文将该文献全 部内容以引用的方式纳入本文。
[0054] 适用于此处的分化培养基优选为CN 201310596632. 4中披露的分化培养基， 具体是以2/3MS为基本培养基，其中加有6-BA 0. 3-1. 2mg/L、KT 0. 5-2. Omg/L、NAA 0· 01-0. lmg/L、麦芽糖 10-50g/L 以及肌醇 95-105mg/L，pH 为 5· 5-6. 2。
[0055] 分化培养基中，6-BA(6-苄氨基腺嘌呤）的优选浓度为0· 4-0. 8mg/L，更优选为 0· 5-0. 6mg/L ;KT(6-糠氨基嘌呤）的优选浓度为1.0 -L 8mg/L，更优选为L 2-1. 5mg/L ; NAA (萘乙酸）的优选浓度0. 02-0. 08mg/L，更优选为0. 03-0. 06mg/L ;麦芽糖的优选浓度为 20-40g/L，更优选为 20-30g/L。
[0056] MS培养基的配方如下表2所示（单位：mg/L):
[0057] 表 2
[0058]
[0059]
[0060] MS可自行按上述配方配制，也可向Sigma等化学试剂公司购买成品。2/3MS培养 基则是将MS培养基的大量元素减少1/3,而微量元素、铁盐和有机元素不变。然后根据本文 所述配方配制本文的2/3MS诱导培养基。1/2MS培养基则是将MS培养基的大量元素减少 1/2,而微量元素、铁盐和有机元素不变。然后根据本文所述配方配制本文的1/2MS诱导培 养基。本领域技术人员将理解，可对上述表1所示的浓度做出适当的变动，例如有大约5% 或更低（例如3%左右、2%左右、1%左右，或更低的变动范围）的变动，由此配制得到的培 养基仍然具有所需的生物学功能，仍能用于实施本发明。例如，以肌醇为例，每升MS培养 基中可含有大约95-105mg的肌醇（5%的变动幅度）。其它成分的浓度也如此变动。此外， 1/2MS诱导培养基中的成分也可使用功能和性质相同或相似的成分加以替换。
[0061] 可采用气孔保卫细胞长度（何婷、郭桂梅、陈志伟等，大麦小孢子再生植株气孔保 卫细胞长度与倍性的相关性[J]，麦类作物学报，2014, 2:007)结合流式细胞术对所获得的 再生植株是否为单倍体植株进行鉴定。
[0062] 具体而言，可剪取取小孢子培养再生苗叶尖（约l-2cm长），放入卡诺氏固定液 (无水乙醇：冰乙酸=3 : 1体积比）中，浸泡至叶片完全褪色，在蒸馏水中漂洗后置于40 倍显微镜下观察，气孔保卫细胞长度值在37μπι以下基本可以判定是单倍体苗。
[0063] 流式细胞术鉴定方法：剪取小孢子培养再生苗叶尖（约l-2cm长），放入I. 5ml离 心管中，浸入液氮速冻后用磨样杵研磨成细小颗粒，加入LBOl缓冲溶液0. 5ml，重悬，加入 荧光染料PI (碘化丙啶）和RNA酶（使用BD公司PI/RNaseDNA染色试剂），混匀静置15min， 采用40 μ m筛网过滤，滤液使用BD Accuri C6流式细胞仪检测倍性，利用二倍体种子发芽 苗作为二倍体对照峰，检出小孢子培养再生植株中的单倍体植株。
[0064] 2、单倍体植株分蘖苄基部丛生芽诱导
[0065] 单倍体植株在1/2MS生根壮苗培养基上诱导生根后，移出培养瓶，洗净根部培养 基，用海绵固定在泡沫板上，转移到盛有自来水的中转箱里，放置温室中漂浮培养1-2天， 进行炼苗。温室温度为白天20-25°C，晚上16-20°C，10-16小时光照。炼苗结束后转移到 l/2Hoagland溶液中培养，每3-4天更换一次培养液，约1个月可形成多个分蘖。
[0066] 剥除单倍体植株外部叶片，保留基部长度为8cm左右的茎段，将收集的茎段用自 来水快速冲洗，洗净表面灰尘，再用酒精漂洗，无菌水冲洗，对茎段表面进行杀菌，浙干水 分加入30% NaClO溶液边浸泡边振荡10~15min后用无菌水冲洗3~4次，浙干。在超 净台上用解剖刀剥去外部较大叶片和多余部分，保留基部分蘖节部位Icm左右，接种到含 0. 3-0. 8mg/L TDZ的1/2MS丛生芽诱导培养基上培养诱导出芽，培养温度为20-26°C，优选 23土 1°C，光周期为8-14h · d \优选约IOh · d \
[0067] 约1个月可见基部有新芽生出，当新芽伸展至l-2cm长时，切除新芽转移到丛生芽 增殖培养基上。培养条件同前，可培养大约4 一 6周。
[0068] 丛生芽增殖培养基以1/2MS培养基配制，除含有1/2MS培养基的成分外，还添加 有 300-500mg/L 水解干酪素（CH)、10-30mg/L 亚精胺（Spd)、0· 6-1. 2mg/LTDZ (噻二唑苯基 脲）、0· 8-1. 2mg/L 多效唑（MET)。
[0069] 在一个具体实施例中，所述从分蘖苄基部直接诱导丛生芽培养基中，TDZ (噻二唑 苯基脲）为〇· 5mg/L。
[0070] 在一优选实施例中，丛生芽增殖培养基中，CH为400mg/L，Spd为20mg/L，TDZ为 1. Omg/L，MET 为 1.0 mg/L。
[0071] 3、完整单倍体植株的获得
[0072] 对于丛生芽增殖培养基上生长达到6周左右的丛生芽，分割成单芽，转移到1/2MS 空白培养约4周后，使植株内源激素下降到一个低水平后，再转移到生根诱导培养基上诱 导生根，形成完整再生植株。
[0073] 生根诱导培养基以1/2MS培养基配制，除含有1/2MS培养基的成分外，还添加 NAA 0· 03-0. 08mg/L 和 MET 0· 8-1. 2mg/L。
[0074] 在一个具体实施例中，所述从生根诱导培养基中，萘乙酸为0. 05mg/L，多效唑 (MET)为 1.0 mg/L。
[0075] 4、单倍体植株扩繁群体的稳定性评价
[0076] 对于从分蘖苄基部分生组织直接诱导丛生芽，经过增殖、壮苗和生根培养获得的 再生植株群体，对继代3-4代后的植株的生长速度和外部形态特征（包括叶色和叶片粗壮 程度）进行观察。
[0077] 应理解，适用于本发明方法的禾谷类作物包括但不限于大麦、小麦、水稻等。
[0078] 本发明也包括用于实施上述方法的试剂盒，所述试剂盒尤其含有：
[0079] (1)以1/2MS培养基配制的丛生芽诱导培养基，所述丛生芽诱导培养基除含有 1/2MS培养基的成分外，还添加有0. 3-0. 8mg/L TDZ ;和
[0080] ⑵以1/2MS培养基配制的丛生芽增殖培养基，所述丛生芽增殖培养基除含有 1/2MS培养基的成分外，还添加有300-500mg/L水解干酪素（CH)、10-30mg/L亚精胺（Spd)、 0· 6-L 2mg/L TDZ(噻二唑苯基脲）、0· 8-L 2mg/L 多效唑（MET)。
[0081] 在一个具体实施例中，所述试剂盒还含有：
[0082] (3)生根诱导培养基，该培养基以1/2MS培养基配制，除含有1/2MS培养基的成分 外，还添加 NAA 0· 03-0. 08mg/L 和 MET 0· 8-1. 2mg/L。
[0083] 在一个具体实施例中，所述试剂盒还含有：
[0084] (4)N6诱导培养基，该培养基以N6培养基为基础，所不同的是含有0_2500mg/L的 KNO3 和 0-400mg/L 的（NH4) SO4，并添加有 400-2500mg/L 的水解干酪素和 400-2500mg/L 的 谷氨酰胺；
[0085] (5)分化培养基，具体是以2/3MS为基本培养基，其中加有6-BA 0· 3-1. 2mg/L、KT 0· 5-2. Omg/L、NAA 0· 01-0. lmg/L、麦芽糖 10-50g/L 以及肌醇 95-105mg/L，pH 为 5. 5-6. 2 ; 以及
[0086] (6)生根壮苗培养基，该培养基以1/2MS为基础，含有1/2MS培养基的成分外，还添 加有 NAA 0· 03-0. 08mg/L、多效唑（MET)O. 8-1. 2mg/L 和蔗糖 10-40g/L，ρΗ5· 6-6. 0。
[0087] 上述（1)到（6)中所述的各培养基中的各成分的浓度均可适当改变，其优选的浓