一种细菌性基腐病抗性粳稻育种方法
【专利摘要】本发明公开一种细菌性基腐病抗性粳稻育种方法，主要包括播种移栽、获取杂交种F1以及三交F1杂交种，并分别对其进行花药愈伤诱导，从而获得细菌性基腐病抗性粳稻。本发明涉及的一种细菌性基腐病抗性粳稻育种方法能够将籼稻内细菌性基腐病抗性遗传物质高效而专一地渗入粳稻，缩短育种周期、操作门槛较低、避免变异、节约资金，易于普及推广，具有市场应用前景。
【专利说明】
一种细菌性基腐病抗性粳稻育种方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种育种方法，尤其涉及一种基于抗细菌性基腐病籼稻的粳稻育种方法，属于现代农业高新技术领域。
【背景技术】
[0002]水稻细菌性基腐病是近年来新发现的一种危害较为严重的细菌性水稻病害，目前在长江以南发生的情况较严重。水稻细菌性基腐病具有突发性、偶发性和严重性等特点，罹病水稻分蘖减少、茎基部腐烂、产生白穗、秕谷，严重的可造成水稻大面积失收，因此细菌性基腐病成为水稻高产、稳产的严重障碍，严重威胁着我国的粮食安全。
[0003]由于水稻细菌性基腐病症状类似螟虫危害或生理性青枯，易导致该病的诊断失误，从而延误该病的发现时间，造成更大的危害。现代农业对水稻病害的防治一般采取“农业防治为主，化学防治为辅”的综合防治技术，在病害发生后可以有效控制该病扩散蔓延。
[0004]现有技术防治水稻细菌性基腐病最为有效的方法是选用抗病品种的水稻，抗病细菌性基腐病水稻品种筛选试验发现，不同的水稻品种发病程度有着明显差异。抗病品种中籼稻抗病资源较多，而粳稻品种大多感病。现有技术中，Π优128、特优63、培杂72、培杂77、博优713等5个表现为高抗细菌性基腐病的籼性材料。
[0005]现有技术培育水稻细菌性基腐病菌抗性品种的方法通常有两种:常规育种和分子技术育种。
[0006]常规育种的周期很长，培育出一个水稻细菌性基腐病菌抗性品种往往需要6?8年的时间，而又由于细菌性基腐病病菌生理小种遗传的复杂性和致病性的多样性使得病菌群体的毒力基因的组成发生变化，往往选育的抗性品种在推广3?5年后即产生能侵染该品种的优势小种，最终导致新品种的抗性丧失。常规育种消耗时间长，尤其随着细菌性基腐病病菌突变频率的增加，新品种育成的速度已经跟不上细菌性基腐病病菌的突变速度。
[0007]转基因育种与分子标记辅助选择等分子技术育种是目前农业发展的新方向，对特定优良主栽品种进彳丁细菌性基腐病抗病基因和其他优良基因的转基因育种是一种可选方案，但由于目前转基因育种被抵制，且转基因育种和分子标记辅助选择育种首先需要基因定位，同样需要大田多世代的杂交回交，周期也较长，分子技术育种还存在费用高、技术门槛高的问题，难以被一般育种者所掌握。
【发明内容】
[0008]基于现有技术的缺陷，本发明提供一种能够将籼稻内细菌性基腐病抗性遗传物质高效而专一地渗入粳稻、育种周期大大缩短的细菌性基腐病抗性粳稻育种方法。
[0009]本发明涉及的细菌性基腐病抗性粳稻育种方法所需种子材料包括，粳稻材料、籼稻材料以及广亲和性粳稻材料。
[0010]所述粳稻材料为产量高、米质好、偏早熟、易感细菌性基腐病的育种主干品系，所述籼稻材料为高抗细菌性基腐病的种系。
[0011]所述粳稻材料优选为J0118，所述籼稻材料优选为博优713，所述广亲和性粳稻材料优选为广亲和系粳稻1330。
[0012]具体包括如下步骤:
[0013](I)第一播种和移栽程序:
[0014]将籼稻材料和广亲和系粳稻分别浸种于稀释的浸种液中，浸种1-2天后，催芽并按品种播种于实验秧田，单株移栽，株行距为30 X30cm; —般大田肥水和病虫草害管理，至植株正常生长到扬花期，进行步骤(2)。
[0015]所述浸种液为2mL10 % 二硫氰基甲烷乳油、2g咪酰胺、2mL70 %吡虫啉水分散粒剂，加500倍水稀释配制而成。
[0016](2)杂交种Fl的获取:
[0017]将母本植株的稻穗浸入39?46°C的温水中，浸泡6?10分钟后取出，自然冷却30分钟，剪去1/3颖壳及未开颖的小花，用纸袋将母本植株的稻穗套好并作标记，待用。当父本植株进入开花期时，将父本植株上稻穗的花药均匀落到纸袋中母本植株稻穗的柱头上，人工授粉完成后将纸袋继续套好，等待杂交稻穗的籽粒成熟，即获得杂交种Fl。
[0018]所述母本植株的稻穗浸入的温水温度优选为42°C，所述浸泡时间优选为7分钟。
[0019]本方法结实率高，并可避免自交，还能促进开花，便于授粉。
[0020](3)杂交种Fl的花药愈伤诱导:
[0021]杂交种Fl正季播种，稻穗中部花药位置占颖壳的1/2为标准取穗，取穗后用70%乙醇表面消毒，然后用塑料薄膜包住整个稻穗，保持稻穗湿润放入冰箱中，在4°C下低温预处理3天;剪去1/3颖壳及未开颖的小花，在85%的酒精中消毒处理2?10分钟，晾干后剪开花药上部，将花药置于第一培养基中，进行诱导培养，在22?28°C下暗培养2?3天后，转移至第二培养基中，于25?29°C、光周期16h75001x光照8h黑暗下进行继代培养，50天后将获得的杂交种Fl的花药愈伤组织，统计花药愈伤组织诱导率，若花药愈伤组织诱导率低于5%，则需将杂交种Fl与籼稻材料亲本回交直至花药愈伤组织诱导率高于5%。
[0022](4)第二播种和移栽程序:
[0023]将粳稻材料和杂交种Fl分别浸种于稀释的浸种液中，浸种1-2天后，催芽并按品种播种于实验秧田，单株移栽，株行距为30 X 30cm; 一般大田肥水和病虫草害管理，至植株正常生长到扬花期，进行步骤(5)。
[0024]所述浸种液同步骤(I)。
[0025](5)三交Fl杂交种的获取:
[0026]将母本植株的稻穗浸入39?46°C的温水中，浸泡6?10分钟后取出，自然冷却30分钟，剪去1/3颖壳及未开颖的小花，用纸袋将母本植株的稻穗套好并作标记，待用。当父本植株进入开花期时，将父本植株上稻穗的花药均匀落到纸袋中母本植株稻穗的柱头上，人工授粉完成后将纸袋继续套好，等待杂交稻穗的籽粒成熟，即获得三交Fl杂交种。
[0027]所述母本植株的稻穗浸入的温水温度优选为42°C，所述浸泡时间优选为7分钟。
[0028](6)三交Fl杂交种的花药愈伤诱导:
[0029]三交Fl杂交种正季播种，稻穗中部花药位置占颖壳的1/2为标准取穗，取穗后用70 %乙醇表面消毒，然后用塑料薄膜包住整个稻穗，保持稻穗湿润放入冰箱中，在4°C下低温预处理3天;剪去1/3颖壳及未开颖的小花，在85%的酒精中消毒处理2?10分钟，晾干后剪开花药上部，将花药置于第一培养基中，进行诱导培养，在22?28°C下暗培养2?3天后，转移至第二培养基中，于25?29°C、光周期16h75001x光照8h黑暗下进行继代培养，获得花药愈伤组织，继续培养出花培苗、育苗、移植到大田，等待稻穗籽粒成熟，通过筛选即获得细菌性基腐病抗性粳稻。
[0030]其中步骤(3)和(6)中所述第一培养基的成分为:N6基础培养基1900mg/L、甘氨酸2.0mg/L，烟酸0.5mg/L，琼脂7.5g/L;激动素KT 2.0mg/L，山梨醇25g/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺 500mg/L，丙氨酸 0.6mg/L，叶酸0.5mg/L，秋水仙碱 0.3mg/L ； pH 值为6.0。
[0031]步骤(3)和(6)中所述第二培养基的成分为:MS基本培养基1900mg/L、肌醇10mg/L，甘氨酸2.0mg/L，维生素BI 0.4mg/L，维生素B6 0.5mg/L，鹿糖25g/L，萘乙酸NAA 0.5mg/L，生物素0.lmg/L，甲基亚硝基脲0.8mg/L，调环酸I丐0.4mg/L，水解蛋白1.0g/L;以及浓度20 %的水稻细菌性基腐病菌粗毒素提取液，pH值为6.0。
[0032]所述水稻细菌性基腐病菌粗毒素提取液的制备方法为:将染病水稻的穗颈部剪下，清洁表面后置于湿润培养皿中，在30°C条件下暗培养，在菌丝产生后加入营养琼脂继续培养，得到菌株;将菌株接种到液体培养基中30°C下摇床培养30天，超声振荡15?60分钟、过滤、以500?1500rpm的速度离心5?10分钟，得到的上清液即水稻细菌性基腐病菌粗毒素。
[0033]本发明涉及的细菌性基腐病抗性粳稻育种方法，能够将籼稻内细菌性基腐病抗性遗传物质高效而专一地渗入粳稻，减少筛选工作量，缩短细菌性基腐病抗性水稻的育种周期，操作门槛较低、避免基因导入引起的细胞变异、可以节约大量的资金，易于普及推广，具有市场应用前景。
【具体实施方式】
[0034]下面通过具体实施例，进一步对本发明的技术方案进行具体说明。应该理解，下面的实施例只是作为具体说明，而不限制本发明的范围，同时本领域的技术人员根据本发明所做的显而易见的改变和修饰也包含在本发明范围之内。
[0035]实施例1
[0036]籼稻材料选择博优713，粳稻材料选择J0118，采用本发明的技术路线进行细菌性基腐病抗病育种，成功获得了4个农艺性状优良、细菌性基腐病抗性得到改良的花培家系。
[0037]粳稻材料JO118农艺性状优良，产量高、米质好、偏早熟，但较感细菌性基腐病。博优713是汕头市农科所育成的籼型杂交稻，除高抗细菌性基腐病外，还具有株型适中、叶片厚直、茎杆坚实、分蘖力强、米质优等优点，非常适合作为本发明细菌性基腐病抗性籼稻材料的要求。所述广亲和性粳稻材料为广亲和系粳稻1330。
[0038]其具体操作流程如下:
[0039](I)第一播种和移栽程序:
[0040]将籼稻材料和广亲和系粳稻分别浸种于稀释的浸种液中，浸种1-2天后，催芽并按品种播种于实验秧田，单株移栽，株行距为30 X30cm; —般大田肥水和病虫草害管理，至植株正常生长到扬花期，进行步骤(2)。
[0041 ] 所述浸种液为2mL10 % 二硫氰基甲烷乳油、2g咪酰胺、2mL70 %吡虫啉水分散粒剂，加500倍水稀释配制而成。
[0042](2)杂交种Fl的获取:
[0043]将母本植株的稻穗浸入42°C的温水中，浸泡7分钟后取出，自然冷却30分钟，剪去1/3颖壳及未开颖的小花，用纸袋将母本植株的稻穗套好并作标记，待用。当父本植株进入开花期时，将父本植株上稻穗的花药均匀落到纸袋中母本植株稻穗的柱头上，人工授粉完成后将纸袋继续套好，等待杂交稻穗的籽粒成熟，即获得杂交种Fl。
[0044](3)杂交种Fl的花药愈伤诱导:
[0045]杂交种Fl正季播种，稻穗中部花药位置占颖壳的1/2为标准取穗，取穗后用70%乙醇表面消毒，然后用塑料薄膜包住整个稻穗，保持稻穗湿润放入冰箱中，在4°C下低温预处理3天;剪去1/3颖壳及未开颖的小花，在85%的酒精中消毒处理2?10分钟，晾干后剪开花药上部，将花药置于第一培养基中，进行诱导培养，在22?28°C下暗培养2?3天后，转移至第二培养基中，于25?29°C、光周期16h75001x光照8h黑暗下进行继代培养，50天后将获得的杂交种Fl的花药愈伤组织，统计花药愈伤组织诱导率，若花药愈伤组织诱导率低于5%，则需将杂交种Fl与籼稻材料亲本回交直至花药愈伤组织诱导率高于5%。
[0046](4)第二播种和移栽程序:
[0047]将粳稻材料和杂交种Fl分别浸种于稀释的浸种液中，浸种1-2天后，催芽并按品种播种于实验秧田，单株移栽，株行距为30 X 30cm; 一般大田肥水和病虫草害管理，至植株正常生长到扬花期，进行步骤(5)。
[0048]所述浸种液同步骤(I)。
[0049](5)三交Fl杂交种的获取:
[0050]将母本植株的稻穗浸入42°C的温水中，浸泡7分钟后取出，自然冷却30分钟，剪去1/3颖壳及未开颖的小花，用纸袋将母本植株的稻穗套好并作标记，待用。当父本植株进入开花期时，将父本植株上稻穗的花药均匀落到纸袋中母本植株稻穗的柱头上，人工授粉完成后将纸袋继续套好，等待杂交稻穗的籽粒成熟，即获得三交Fl杂交种。
[0051 ] (6)三交Fl杂交种的花药愈伤诱导:
[0052]三交Fl杂交种正季播种，稻穗中部花药位置占颖壳的1/2为标准取穗，取穗后用70 %乙醇表面消毒，然后用塑料薄膜包住整个稻穗，保持稻穗湿润放入冰箱中，在4°C下低温预处理3天;剪去1/3颖壳及未开颖的小花，在85%的酒精中消毒处理2?10分钟，晾干后剪开花药上部，将花药置于第一培养基中，进行诱导培养，在22?28°C下暗培养2?3天后，转移至第二培养基中，于25?29°C、光周期16h75001x光照8h黑暗下进行继代培养，获得花药愈伤组织，继续培养出花培苗、育苗、移植到大田，等待稻穗籽粒成熟，即获得细菌性基腐病抗性粳稻。
[0053]其中步骤(3)和(6)中所述第一培养基的成分为:N6基础培养基1900mg/L、甘氨酸2.0mg/L，烟酸0.5mg/L，琼脂7.5g/L;激动素KT 2.0mg/L，山梨醇25g/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺 500mg/L，丙氨酸 0.6mg/L，叶酸0.5mg/L，秋水仙碱 0.3mg/L ； pH 值为6.0。
[0054]步骤(3)和(6)中所述第二培养基的成分为:MS基本培养基1900mg/L、肌醇10mg/L，甘氨酸2.0mg/L，维生素BI 0.4mg/L，维生素B6 0.5mg/L，鹿糖25g/L，萘乙酸NAA 0.5mg/L，生物素0.lmg/L，甲基亚硝基脲0.8mg/L，调环酸I丐0.4mg/L，水解蛋白1.0g/L;以及浓度20 %的水稻细菌性基腐病菌粗毒素提取液，pH值为6.0。
[0055]所述水稻细菌性基腐病菌粗毒素提取液的制备方法为:将染病水稻的穗颈部剪下，清洁表面后置于湿润培养皿中，在30°C条件下暗培养，在菌丝产生后加入营养琼脂继续培养，得到菌株;将菌株接种到液体培养基中30°C下摇床培养30天，超声振荡15?60分钟、过滤、以500?1500rpm的速度离心5?10分钟，得到的上清液即水稻细菌性基腐病菌粗毒素。
【主权项】
1.一种细菌性基腐病抗性粳稻育种方法，其特征在于:所述细菌性基腐病抗性粳稻育种方法所需种子材料包括，粳稻材料、籼稻材料以及广亲和性粳稻材料； 所述粳稻材料为产量高、米质好、偏早熟、易感细菌性基腐病的育种主干品系，所述籼稻材料为高抗细菌性基腐病的种系； 具体育种步骤如下: (1)第一播种和移栽程序: 将籼稻材料和广亲和系粳稻分别浸种于稀释的浸种液中，浸种1-2天后，催芽并按品种播种于实验秧田，单株移栽，株行距为30 X 30cm; 一般大田肥水和病虫草害管理，至植株正常生长到扬花期，进行步骤(2); (2)杂交种Fl的获取: 将母本植株的稻穗浸入39?46°C的温水中，浸泡6?10分钟后取出，自然冷却30分钟，剪去1/3颖壳及未开颖的小花，用纸袋将母本植株的稻穗套好并作标记，待用；当父本植株进入开花期时，将父本植株上稻穗的花药均匀落到纸袋中母本植株稻穗的柱头上，人工授粉完成后将纸袋继续套好，等待杂交稻穗的籽粒成熟，即获得杂交种Fl; (3)杂交种Fl的花药愈伤诱导: 杂交种Fl正季播种，稻穗中部花药位置占颖壳的1/2为标准取穗，取穗后用70%乙醇表面消毒，然后用塑料薄膜包住整个稻穗，保持稻穗湿润放入冰箱中，在4°C下低温预处理3天;剪去1/3颖壳及未开颖的小花，在85%的酒精中消毒处理2?10分钟，晾干后剪开花药上部，将花药置于第一培养基中，进行诱导培养，在22?28°C下暗培养2?3天后，转移至第二培养基中，于25?29°C、光周期16h75001x光照8h黑暗下进行继代培养，50天后将获得的杂交种Fl的花药愈伤组织，统计花药愈伤组织诱导率，若花药愈伤组织诱导率低于5%，则需将杂交种Fl与籼稻材料亲本回交直至花药愈伤组织诱导率高于5% ; (4)第二播种和移栽程序: 将粳稻材料和杂交种Fl分别浸种于稀释的浸种液中，浸种1-2天后，催芽并按品种播种于实验秧田，单株移栽，株行距为30 X 30cm; 一般大田肥水和病虫草害管理，至植株正常生长到扬花期，进行步骤(5); 所述浸种液同步骤(I); (5)三交Fl杂交种的获取: 将母本植株的稻穗浸入39?46°C的温水中，浸泡6?10分钟后取出，自然冷却30分钟，剪去1/3颖壳及未开颖的小花，用纸袋将母本植株的稻穗套好并作标记，待用；当父本植株进入开花期时，将父本植株上稻穗的花药均匀落到纸袋中母本植株稻穗的柱头上，人工授粉完成后将纸袋继续套好，等待杂交稻穗的籽粒成熟，即获得三交Fl杂交种； (6)三交Fl杂交种的花药愈伤诱导: 三交Fl杂交种正季播种，稻穗中部花药位置占颖壳的1/2为标准取穗，取穗后用70%乙醇表面消毒，然后用塑料薄膜包住整个稻穗，保持稻穗湿润放入冰箱中，在4°C下低温预处理3天;剪去1/3颖壳及未开颖的小花，在85%的酒精中消毒处理2?10分钟，晾干后剪开花药上部，将花药置于第一培养基中，进行诱导培养，在22?28°C下暗培养2?3天后，转移至第二培养基中，于25?29°C、光周期16h75001x光照8h黑暗下进行继代培养，获得花药愈伤组织，继续培养出花培苗、育苗、移植到大田，等待稻穗籽粒成熟，通过筛选即获得细菌性基腐病抗性粳稻。2.根据权利要求1所述的一种细菌性基腐病抗性粳稻育种方法，其特征在于:所述粳稻材料为J0118，所述籼稻材料为博优713，所述广亲和性粳稻材料为广亲和系粳稻1330。3.根据权利要求1所述的一种细菌性基腐病抗性粳稻育种方法，其特征在于:步骤(I)所述浸种液为2mL10 % 二硫氰基甲烷乳油、2g咪酰胺、2mL70 %吡虫啉水分散粒剂，加500倍水稀释配制而成。4.根据权利要求1所述的一种细菌性基腐病抗性粳稻育种方法，其特征在于:步骤(2)或步骤(5)所述母本植株的稻穗浸入的温水温度为42°C，所述浸泡时间为7分钟。5.根据权利要求1?4任一项所述的一种细菌性基腐病抗性粳稻育种方法，其特征在于:步骤(3)或(6)中所述第一培养基的成分为:N6基础培养基1900mg/L、甘氨酸2.0mg/L，烟酸0.5mg/L，琼脂7.5g/L;激动素KT 2.0mg/L，山梨醇25g/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺500mg/L，丙氨酸0.6mg/L，叶酸0.5mg/L，秋水仙碱0.3mg/L ； pH值为6.0。6.根据权利要求1?4任一项所述的一种细菌性基腐病抗性粳稻育种方法，其特征在于:步骤(3)或(6)中所述第二培养基的成分为:MS基本培养基1900mg/L、肌醇100mg/L，甘氨酸2.0mg/L，维生素BI 0.4mg/L，维生素B6 0.5mg/L，蔗糖25g/L，萘乙酸NAA 0.5mg/L，生物素0.lmg/L，甲基亚硝基脲0.8mg/L，调环酸I丐0.4mg/L，水解蛋白1.0g/L ；以及浓度20 %的水稻细菌性基腐病菌粗毒素提取液，PH值为6.0。7.根据权利要求6所述的一种细菌性基腐病抗性粳稻育种方法，其特征在于:所述水稻细菌性基腐病菌粗毒素提取液的制备方法为:将染病水稻的穗颈部剪下，清洁表面后置于湿润培养皿中，在30°C条件下暗培养，在菌丝产生后加入营养琼脂继续培养，得到菌株;将菌株接种到液体培养基中30 °C下摇床培养30天，超声振荡15?60分钟、过滤、以500?1500rpm的速度离心5?10分钟，得到的上清液即水稻细菌性基腐病菌粗毒素。
【文档编号】A01N51/00GK106069725SQ201610496123
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月29日
【发明人】林少会, 许建中, 孟剑华
【申请人】无锡南理工科技发展有限公司