专利名称：利用抗cd20抗体治疗移植物抗宿主疾病的制作方法
发明简述本发明涉及利用抗不存在于正常人T淋巴细胞上的外源表面抗原的抗体，制备治疗移植物抗宿主疾病的组合物，用以治疗接受了被该外源表面抗原转导的T淋巴细胞的患者。
尽管利用目前的标准免疫筛选技术已能够很容易地生产出大量的纯化的供体T淋巴细胞，并通过其服用达到体内诱导GVL的效果，但目前仍缺乏适当的技术，从药学上诱导服用的T淋巴细胞的选择性死亡，从而达到一旦临床上不需要时能够消除GVHD作用。
过去已生产出许多抗人表面分子的多克隆和单克隆抗体。在许多情况下，生产抗体的直接目的在于在体内杀死对那些用于免疫治疗方案的分子呈阳性的细胞。例如，在B淋巴瘤领域已生产和鉴定出抗CD20、CD19、CD40、CD22、CD52、CD38分子及其它分子的有效抗体(P.S.Multani等，J.Clin.Oncol.，16，3691-3710，1998)。在某些情况下，抗这类分子的抗体显示出体内细胞毒性作用，可能是因为他们象CD20、CD38和C厮2一样，能够激活靶细胞表面的补体系统。在其它一些情况下，是将抗体与放射活性分子结合以诱导靶辐解，就如同CD20、Lym-1等一样。其它一些抗体则是与细菌或植物来源的毒素结合，用于同样目的，就如同CD19、CD40和CD22一样。还有一些抗体则被嵌合以获得双特异性，从而使两种细胞充分接近。最后，还存在许多这些抗体的人工改造的和/或人源化的形式，它们的体内给药既降低了抗原性危险，又增强了其效力。
发明详述现已发现，通过利用本发明的方法可有效地控制移植物抗宿主疾病问题，该方法包括将外源表面抗原引入供体的T淋巴细胞，然后给受体患者服用抗该外源抗原的抗体。
外源抗原意指不存在于正常T淋巴细胞上的任何表面抗原，如CD20、CD19、CD40、CD22、CD52等表达在B淋巴细胞表面的抗原。显然，在与相应抗体反应后将对该抗体进行筛选，以便不在有组织地表达抗原的细胞群体水平上产生负面或不良效果。
尤其优选的是人B淋巴细胞的CD20表面抗原，抗该抗原的人源化单克隆抗体可从市场上买到(Rituximab，Roche)，它用于治疗非霍奇金B淋巴瘤(B non Hodgkin lymphomas)。
根据本发明，首先通过适当技术用选择的抗原转导供体T淋巴细胞，通过免疫亲和方法使其富集后将其注射到受体。如果有移植物抗宿主疾病形成，则给患者服用抗该抗原的抗体，以便通过例如补体介导的细胞毒性机制体内灭活T淋巴细胞。
所用抗体优选为单克隆抗体，更优选人源化的单克隆抗体。其剂量和给药途径取决于多种因素，包括患者的整体健康状态、体重、性别和年龄。一般地，该抗体通过静脉内途经给药，其剂量范围约为50-500mg/m2体表，每日1-3次，直至循环T淋巴细胞几乎完全消失。
Rambaldi等人(Blood，91，2189-2196，1998)已描述过T淋巴细胞的分离。
用所需抗原转导T淋巴细胞的方法是熟知的。可参见Verma.I.M和Somia的综述(Nature，389，239-242，1997)。具体地，可使用适宜的载体，包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、慢病毒(Lentiviruses)等。
这些载体中的每一种均包括许多不同的生物类型。对于逆转录病毒，其例子有兼嗜性载体、亲嗜性载体和异嗜性载体。而且，多年来还使用了许多不同的包装细胞系，以便优化这类重组逆转录病毒的生产，并确保易于操作和生产者的安全(I.M.Verma等，Nature，389，239-242，1997；M.A.Kay等，Gene therapy，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94，12744-12746，1997)。
最近，通过与多聚阳离子或脂质体复合物结合、电穿孔、在盐缓冲液中沉淀及其它技术，也已将裸DNA引入靶细胞中。
许多不同细胞类型已被定向遗传转移T和B淋巴细胞、未成熟造血前体、肌肉细胞、成纤维细胞、肝细胞和其它细胞类型(I.M.Verma等人，Nature，389，239-242，1997；M.A.kay等人，Gene therapy，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94，12744-12746，1997)。
对于CD20抗原，已使用了一种兼嗜性逆转录病毒。该病毒来源于莫洛尼鼠类白血病毒并被包装在胚肾人细胞(293T)中，而该胚肾人细胞已经过人工改造，含有分散在不同质粒中的逆转录病毒的结构单元(Human Gene Therapy，7，1405-1413，1996)。这类载体以及用外源抗原转导的T淋巴细胞(尤其是CD20+T淋巴细胞)是本发明的目标之一。
经过遗传转移之后，显著表达外源基因的细胞仅占到总细胞群中的少部分。利用能够给细胞带来选择性优势的外源基因，可对转导细胞实施筛选。也可采用其它方法如用抗外源抗原的抗体进行FACS分类，筛选转导细胞(K.Phillips等人，Nature Medicine，2，10，1154-1155，1996)。其它方法还包括用于筛选方法中的免疫亲和层析柱或预吸附的培养板等。
图2用CD20感染CEM细胞系及免疫筛选。
其中上图A利用荧光对照IgG1抗体，通过细胞荧光测定仪分析病毒感染后的CEM细胞系。
中图B利用荧光抗CD20抗体分析同样的细胞群。
下图C利用荧光抗CD20抗体分析经亲和柱免疫筛选后的同样细胞群。
图3用CD20病毒感染人新鲜T淋巴细胞上图A感染后淋巴细胞用PEIgG2a和FITC IgG1对照抗体标记。
下图B同样细胞群用抗CD20 PE和抗CD3 FITC抗体标记。在所示情况下，23％的细胞为双阳性。
下面的实施例用于进一步详细说明本发明。
为了放大，在含2.5mM dNTP、500ng“有义”引物(CGGGATCCAAAATGACAACACCCAGAAATTC)、500ng“反义”引物(CGGGATCCTTAAGGAGAGCTGTCATTTTCT)和5u pfu DNA聚合酶(购自Stratagene，La Jolla，CA，USA)的0.8μl溶液存在的情况下，将40ng质粒加至由10mMKCl、10mM(NH4)2SO4、20mM Tris HCl(pH8.75)、2mM MgSO4、0.1％Triton X-100、100μg/ml BSA组成的溶液中，至反应终体积100μl。按下述方案将反应在循环器中进行26次循环95℃1分钟，60℃1分钟和72℃2分钟。反应结束时，加入25∶24∶1的苯酚∶氯仿∶异戊醇溶液100μl。萃取后，在乙醇存在下于20℃过夜沉淀DNA。离心后，将DNA重悬于100μl水中，然后按附带在“pMOS平末端克隆盒“中的生产商指示将其亚克隆至PMOS载体(AmershamItalia，srl，Italy)。将所产生的重组质粒放大并测序，然后用BamHI消化。该酶的识别位点(G/GATCC)存在于两种PCR引物的末端。因此，该片段被亚克隆在逆转录病毒载体PINCO VUOTO的BamH1位点。逆转录病毒载体PINCO VUOTO已通过下列方法预先获得用RcoRI和NotI从质粒PINCO(F.Grignani等，Cancer Res.，58，14-19，1998)中切除1441bp的片段，该片段含有CMV启动子(巨细胞病毒)和EGFP(增强的绿色荧光蛋白)，切除EcoRI-Not I片段后用klenow片段钝化末端并将质粒环化，所得质粒称作PINCO VUOTO。该逆转录病毒载体的长度为11448bp。
PINCO VUOTO与CD20 cDNA间的重组体称为LTR-CD20-LTR，对其测序以检测CD20 cDNA的克隆及完整性以及第一个ATG上游终止密码子的缺失(
图1)。
因此，对于逆转录病毒部分，构建体LTR-CD20-LTR由得自莫洛尼鼠类白血病毒(MOMLV)的LTR、得自莫洛尼病毒的其它逆转录病毒序列、BamHI位点的CD20 cDNA以及附
图1中详细给出的第二个LTR组成。该质粒的其余部分相同个PINCO质粒(F.Grignani等，Cancer Res.，58，14-19，1998)。如附图所示，该质粒含有EB病毒的EBNA-1和Orip元件，复制起点(pUC)、氨苄青霉素抗性基因以及处于PGK-1启动子控制下的嘌呤霉素抗性基因。
Phoenix-Ampho细胞得自人胚肾293细胞系，但经过了如下改造首先用腺病毒的EIA基因对其进行转染，然后再用两个单独的质粒对其进行转染，该两种质粒编码位于罗氏肉瘤病毒启动子控制之下的莫洛尼MLV的结构基因gag和pol，以及位于巨细胞病毒启动子控制下的莫洛尼MLV的env基因。
于实验前一天，将1.5×106细胞在直径10cm的平皿中倒平板，其中含10ml DMEM培养基(Gibco，Seromed，Berlin，Germany)，并添加了10％FCS(Hiclone Laboratories，Steril System，Logan，UK)，然后放置于37℃5％CO2培养箱中。实验当天，加入16μl氯奎(原液25mM于PBS)，1分钟后加入10μg质粒DNA溶液1ml。为获得该DNA溶液，将500μl 2xHB5溶液(50mM HEPES，pH7.05，10mMkCl，12mMDextrose，280mM NaCl，1.5mM Na2HPO4(FW141.96))加至一15ml圆形试管中，在第二个15ml圆形试管中制备含10μgDNA、61μlCaCl 2M和无菌水的溶液500μl。然后将该DNA混合物滴加至第一试管中，并将所得沉淀物加至细胞中。
8小时后用10ml新鲜DMEM置换培养基。
第二天，用添加了10％FCS的5ml新鲜RPMI1640培养基置换原培养基。
第三天，通过移出5ml含有在培养过程中释放的逆转录病毒的培养基而感染。
然后将平板在室温下以1800rpm离心45分钟，除去上清液，用1ml添加了10％FCS的新鲜RPMI1640替换，接着再培养6小时。
培养结束时，利用前面制备的包装细胞的不同平皿，第二次重复感染步骤。
将0.1×106细胞转移至1.5ml Eppendorf管中，以4000rpm离心3分钟后重悬于50μl荧光抗CD20 1F5抗体(Becton Dickinson)溶液中，并于4℃维持30分钟。然后加入含0.9％NaCl、5％FCS、0.02％叠氮化钠的溶液500μl。以4000rpm离心细胞5分钟后，将样品重悬于含1％甲醛的100μl PBS溶液中，于4℃放置，直到在荧光细胞计数仪上读数。
在多次实验中，该感染方法总是产生从30％到60％不同范围的CEMCD20+细胞，而非感染的细胞系则对CD20表达呈完全阴性(如见附图2，其中间图中显示CEM群体变为40％CD20+)。
最后将细胞重悬于KPMI1640培养基中，并通过在SuperMACS系统(Milteny Biotech)中的XS+柱进行筛选。然后用添加了2.5％白蛋白生理溶液洗柱，从Super MACs中取出柱并洗涤，以回收阳性级分。
按照前面所述的免疫荧光方法进行细胞标记后，在细胞荧光测定仪上对阳性级分作进一步分析。
该方法结束时CD20+细胞的百分数始终在90％以上。如图2中下图所示，在通过免疫亲和富集后CD20+阳性的CEM群体为98％。
最后将CEM CD20+细胞群悬浮并平展于添加10％FCS的RPMI1640培养基中，于培养箱中培养。定期研究该细胞群中CD20标记物在表面的表达。结果显示，标记物的稳定性大于2个月，且90％以上的选择细胞阳性。
第二天，加入人重组IL-2(Proleukin，ChironItalia，Milan，Italy)至终浓度100μ/ml。
第三天，经洗涤和细胞计数后，于24孔平板中一个平底孔中的1ml培养基中感染1×106细胞。以1200rpm旋转10分钟后，去上清，并在Polybrene存在下用1ml过滤病毒置换，然后按前述方法于室温下以1800rpm离心45分钟。
最后，去除病毒上清液，用完全培养基替换，并保温6小时。重复离心感染步骤后，在I1-2存在下将细胞重悬于完全培养基中，并于培养箱中过夜移置。
在随后2天重复整个过程，最后在培养箱中将细胞于培养基中再保持两天。
然后按前面所述同样方法，用抗CD20 FITC、抗CD3PE、抗CD4 PE和抗CD8 FITC单克隆抗体(Becton Dickinson)标记细胞，并在细胞荧光测定仪上进行分析。
在正常供体上进行的多次实验显示，约5％-25％的CD3+T淋巴细胞在双荧光分析中获得了CD20标记。该实验之一如图3所示，在该具体实例中获得了23％的CD3/CD20双阳性。
或者，加入人AB血清至终浓度30％以作为补体来源。在连续搅拌下，将细胞于37℃恒温水溶中放置1小时。向细胞悬液中加入等体积的1x吖啶橙的PBS溶液(原液100x溶液含30mg于100ml蒸馏水中)，然后通过细胞荧光测定仪评估细胞悬液活细胞发出绿色荧光，算出其占所分析的总细胞群的百分数。利用这一快速方法，通过比较双阳性CD3/CD20细胞在各个研究细胞群中的百分比与加入Rituximab后死亡细胞的百分比，可评估Rituximab对CD20+细胞的致死效力。如下表所示，对照细胞群为单独暴露于抗体或单独暴露于补体的同样细胞。表中数据表明，暴露于Rituximab 1小时诱导约90％CD3/CD20+细胞死亡。
表CD20转导的新鲜人T淋巴细胞的补体依赖性细胞毒性具体裂解％％CD3/CD20+ Rituximab补体 Rituximab淋巴细胞 单独单独 +补体供体1 300 14 33供体2 230 11 35供体3 150 5 18经吖啶染色后在FACS中测定裂解百分比。
权利要求
1.利用抗正常人T淋巴细胞中不存在的外源表面抗原的抗体制备组合物，用于对已接受了被该外源表面抗原转导的T淋巴细胞的患者进行移植物抗宿主疾病的治疗。
2.根据权利要求1的用途，其中使用抗CD20表面抗原的抗体和被CD20抗原转导的淋巴细胞。
3.根据权利要求2的用途，其中抗CD20抗体为人源化的单克隆抗体。
4.一种载体，用于用外源表面抗原转染人T淋巴细胞。
5.根据权利要求4的载体，其中包括编码人CD20抗原的基因。
6.用外源表面抗原转导的人T淋巴细胞。
7.根据权利要求6的T淋巴细胞，它被人CD20抗原转导。
全文摘要
本发明描述了用抗不存在于正常人T淋巴细胞上的外源表面抗原的抗体制备组合物,用于对已接受了被该外源表面抗原转导的T淋巴细胞的患者进行移植物抗宿主疾病的治疗。
文档编号C12N15/85GK1355712SQ00808833
公开日2002年6月26日 申请日期2000年6月7日 优先权日1999年6月11日
发明者J·高雷, M·因特拿, A·伦巴迪, A·比翁迪 申请人:国家研究委员会