方法

专利名称：方法
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本发明涉及用任何(或一种)单核苷酸多态检测技术、最好使用扩增抗拒突变系统(ARMS)检测真菌中导致对嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的化合物抗性的细胞色素b突变的诊断方法。本发明也涉及用于所述方法中的突变特异性引物以及含有这些引物的诊断试剂盒。本发明还涉及导致含真菌细胞色素b基因中特定突变的真菌对嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的化合物抗性的所述突变的鉴定。
嗜球果伞素类似物构成了一类新型主要的农业杀真菌剂，它们自从在二十世纪七十年代发现1，2，4-三唑以来，被认为是农业杀真菌剂方面最令人激动的发展。
嗜球果伞素类似物的杀真菌活性是其抑制真菌中线粒体呼吸的能力的结果。更具体地讲，已经确定，这些化合物具有新的单一位点作用模式，通过阻断还原型辅酶Q细胞色素c氧化还原酶复合物(细胞色素bc1)而对真菌发挥其影响，由此减少真菌细胞中高能ATP的产生(Becker等，FEBS Letts.132 329-33)。这一类抑制剂阻止多聚体细胞色素b蛋白上辅酶Q氧化还原位点Q0的电子传递(Esposti等1993Biochim.et Biophys.Acta 243-271)。与许多线粒体蛋白质不同，细胞色素b蛋白是线粒体编码的。
文献中的报道表明，细胞色素b靶位点上的特定氨基酸改变可以影响嗜球果伞素类似物的活性。在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(JP Rago等1989 J.Biol.Chem.264，14543-14548)、小鼠(Howell等1988 J.Mol.Biol.203，607-618)、莱哈衣滴虫(Chlamydomonasreinhardtii)(Bennoun等1991 Genetics 127，335-343)和种名未定的红细菌(Rhodobacterspp)(Daldal等1989 EMBO J.3951-3961)中，已经进行了深入的诱变研究。也从在海胆纲拟正海胆(Paracentrotus lividus)(Esposti等，1990 FEBS 263，245-247)以及产生嗜球果伞素类似物天然变异体的担子菌纲(Basidiomycete)真菌乳柄小菇(Mycena galopoda)和Strobilurus tenacellus(Kraiczy等，1996，Eur.J.Biochem.235，54-63)中研究对嗜球果伞素类似物抗性的天然基础，收集了相关的信息。细胞色素b基因中有两个特定区域，在这两个区域中氨基酸的改变对嗜球果伞素类似物活性有显著影响。这些区域包括氨基酸残基125-148和250-295(根据酿酒酵母的残基编号系统)。已经表明，更精确的残基126、129、132、133、137、142、143、147、148、256、275和295的氨基酸改变产生对嗜球果伞素类似物的抗性(Brasseur等1996 Biochim.Biophys.Acta 1275，61-69和Esposti等(1993)Biochimica et Biophysica Acta，1143，243-271)。
本发明第一次鉴定了在表现出对嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的化合物具有抗性的重要植物致病真菌田间分离物的细胞色素b基因中这些突变之一的关键重要性。
在本发明中，我们现在设计了用于基于单核苷酸多态检测方法(包括等位基因特异性扩增)检测真菌细胞色素b基因中一个点突变的新型诊断方法。对于本领域技术人员显而易见的是，有许多分析方法可以用来检测按照本发明的一个或多个多态位置上是否存在变异的核苷酸。一般而言，等位基因变异的检测需要突变鉴别技术、任选的扩增反应和任选的信号产生系统。Nollau等，Clin.Chem.43，1114-1120，1997和标准教科书例如Laboratory Protocols for Mutation Detection，buU.Landegren编著，Oxford University Press，1996和Mewton和Graham的PCR第2版，BIOS Scientific Publishers limited，1997中综述了目前用于检测等位基因变异的许多方法。等位基因特异性扩增反应包括基于引物的方法，包括基于PCR的方法，更具体地讲，包括等位基因特异性聚合酶链式反应(PCR)延伸(ASPCR)，具体地说为ARMS(扩增抗拒诱变系统)，其中所述突变产生对嗜球果伞素类似物的抗性，这些特别优选用于本发明的方法中。本发明的方法也包括无差别性(indiscriminate)PCR，然后对所产生的扩增子进行特异性探测。这些方法适合于检测可以赋予对任何嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的任何其它化合物抗性的特异性等位基因。已经开发了用于在多种真菌植物病原体中检测这种点突变的加强试验(robust test)。当对于一种化合物的抗性机制也赋予对另一种化合物的抗性时，甚至当所述作用方式不相同时，也可以认为化合物属于同一交叉抗性组。ASPCR的技术描述于美国专利号5639611，而ARMS技术全面描述于欧洲专利号EP 332435中。
可以用来检测突变的其它单一多态检测技术包括例如限制性片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性、多克隆分析、等位基因特异性寡核苷酸杂交、单核苷酸引物延伸(Juvonen等，(1994)Hum Genet 9316-20；Huoponen等，(1994)Hum Mutat 329-36；Mashima等(1995)，Invest Opthelmol.Vision.Sci 36，1714-20；Howell等(1994)Am J HumGenet.55 203-206；Koyabashi等，(1994)Am.J.Hum Genet.55 206-209；Johns和Neufeld(1993)Am J Hum Genet 53 916-920；Chomyn等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci USA 89 4221-4225)和InvaderTM技术(可得自ThirdWave Technologies Inc.502 South Rosa Road，Madison，WI 53719USA)。
最好使用基于PCR的检测系统。
按照本发明第一方面的一个优选实施方案，我们提供用于检测真菌核酸中突变的方法，其中所述突变的存在导致真菌对嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的任何其它化合物的抗性，所述方法包括检测在PCR反应期间产生的扩增子的存在，其中所述PCR反应包括在合适的核苷酸三磷酸和用于聚合的试剂存在下，使包含真菌核酸的受试样品与一种引物接触，其中所述扩增子的检测与所述核酸中是否存在所述突变直接相关。
在PCR反应期间产生的扩增子的检测可以直接依赖于对于所述突变存在特异性的引物的延伸，即其中引物延伸依赖于所述突变的存在，因此仅当所述突变存在时所述引物结合和/或得以延伸时，才产生扩增子(对于ARMS技术情况也是如此)，同样，它可以直接取决于对于所述突变不存在(例如野生型序列)特异性的引物的延伸，或可以将其与含有所述突变DNA序列的PCR延伸产物(即其中检测包含所述突变DNA序列的扩增子)直接相关。特别优选第一种替代方法。
所述扩增子可以得自任一PCR循环，这包括第一等位基因特异性引物延伸产物。
在另一优选实施方案中，本发明提供一种用于检测真菌核酸中突变的方法，其中所述突变的存在导致真菌对嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的任何其它化合物的抗性，所述方法包括在合适的核苷酸三磷酸和用于聚合的试剂存在下，使包含真菌核酸的受试样品与一种合适的诊断性引物接触，使得所述诊断性引物或者在所述样品中存在所述突变时得以延伸，或者当存在野生型序列时得以延伸；并且根据诊断性引物延伸产物是否存在而检测所述突变是否存在。
在再一优选实施方案中，本发明提供一种用于检测真菌核酸突变的方法，其中所述突变的存在导致真菌对嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的任何其它化合物的抗性，所述方法包括在合适的核苷酸三磷酸和用于聚合的试剂存在下使包含真菌核酸的受试样品与一种特定突变的诊断性引物接触，使得所述诊断性引物在所述样品中存在所述突变时得以延伸；并且根据诊断性引物延伸产物是否存在而检测所述突变是否存在。
按照本发明第一方面的一个特别优选的实施方案，我们提供一种用于检测真菌核酸中突变的方法，其中所述突变的存在导致真菌对嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的任何其它化合物的抗性，所述方法包括在合适的核苷酸三磷酸和用于聚合的试剂存在下使包含真菌核酸的受试样品与一种特定突变的诊断性引物接触，使得所述诊断性引物仅在所述样品中存在所述突变时得以延伸；并且根据诊断性引物延伸产物是否存在而检测所述突变是否存在。
本文所用的术语诊断性引物用来指用来特异性地鉴定突变或野生型序列是否存在的引物，而术语共用引物用来指结合于与所述诊断性引物相反的链且位于所述诊断性引物所识别区的3’的DNA、并且通过在PCR期间与所述诊断性引物作用允许扩增DNA间插序列段的引物。当所述诊断性引物为ARMS引物时，将其与突变序列或野生型序列相比时它可以具有3’错配。
在本发明的该方面和所有其它方面和实施方案中，最好使用作为或者诊断性引物或者相反链上的共用引物的一个整合部分的检测系统，检测所述引物延伸产物的延伸。这在本文中有更全面的描述。
本发明的方法特别适合于检测杀真菌剂靶蛋白的线粒体编码基因中的突变，更尤其适合于检测真菌细胞色素b基因中的突变，其中所述突变导致抑制对于细胞色素b蛋白的杀真菌剂活性，但仍允许发生ATP的产生，最优选其中真菌细胞色素b基因中的所述突变导致以下氨基酸取代之一A126T、F129L、Y132C、C133Y、G137R/S/E/V、W142T/K、G143A、I147F、T148M、N256Y/K/I、L275F/S/T或L295F，其中在所述序列中由所述数值表示的位置上第一个氨基酸被第二个氨基酸取代，所述取代的存在导致真菌对于嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的任何其它化合物的抗性，其中所述残基的鉴别基于酿酒酵母细胞色素b的残基编号系统。
嗜球果伞素和同一交叉抗性组中的化合物包括例如azoxystrobin、picoxystrobin、kresoxim-methyl、trifloxystrobin、famoxadone和fenamidone。
我们已经发现，在真菌细胞色素b核酸中与酿酒酵母细胞色素b序列中的第143密码子/氨基酸相应的位置在嗜球果伞素类似物抗性植物致病真菌田间分离物中真菌对于嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的任何其它化合物的抗性是关键性决定子。本文描述的本发明的方法特别适合于检测与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的突变，其中甘氨酸残基被另一种氨基酸取代，这抑制了嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的任何其它化合物的活性，并且在带有所述突变细胞色素b基因并由此导致真菌对嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的任何其它化合物的抗性的真菌中导致抗性表型。
所述方法最好用于检测导致与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上所述甘氨酸残基被选自以下一种氨基酸取代的突变精氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、色氨酸，最优选为丙氨酸。
在本发明第一方面的再一优选实施方案中，我们现在提供一种用于检测真菌细胞色素b基因突变的方法，所述突变导致在所编码蛋白质中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上甘氨酸被丙氨酸取代(G143A)，由此导致真菌对嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的任何其它化合物的抗性，所述方法包括用任何(或一种)单核苷酸多态检测技术鉴定真菌核酸中所述突变是否存在。
真菌细胞色素b基因中导致在所编码的蛋白质中G143A取代的突变，通常是在所述密码子的第二位(碱基)上鸟嘌呤碱基改变为胞嘧啶碱基，并且在本文描述的本发明的所有方面和实施方案中最好检测这种单核苷酸多态性。
在本发明第一方面的又一优选实施方案中，我们现在提供一种用于检测真菌细胞色素b基因中导致所编码蛋白质中G143A取代的突变的诊断方法，所述方法包括检测PCR反应期间产生的扩增子的存在，其中所述PCR反应包括在合适的核苷酸三磷酸和一种用于聚合的试剂存在下使包含真菌核酸的受试样品与诊断性引物接触，其中所述扩增子的检测与所述核酸中是否存在所述突变直接相关。
在本发明第一方面的一个特别优选实施方案中，我们现在提供一种用于检测真菌细胞色素b基因中导致所编码蛋白质中G143A取代的突变的诊断方法，所述方法包括在合适的核苷酸三磷酸和一种用于聚合的试剂存在下使包含真菌核酸的受试样品与对于导致所编码蛋白质中G143A取代的突变的诊断性引物接触，使得所述诊断性引物在所述样品中存在导致所编码蛋白质中G143A取代的突变时得以延伸；并根据诊断性引物延伸产物是否存在而检测所述突变是否存在。
在本发明第一方面的再一特别优选实施方案中，我们现在提供一种用于检测真菌细胞色素b基因中导致所编码蛋白质中G143A取代的突变的诊断方法，所述方法包括在合适的核苷酸三磷酸和一种用于聚合的试剂存在下使包含真菌核酸的受试样品与对于导致所编码蛋白质中G143A取代的突变的诊断性引物接触，使得所述诊断性引物仅在所述样品中存在导致所编码蛋白质中G143A取代的突变时得以延伸；并根据诊断性引物延伸产物是否存在而检测所述突变是否存在。
本文所用的术语G143A用来指在真菌细胞色素b序列中等同于酿酒酵母细胞色素b序列的第143密码子/氨基酸的位置上甘氨酸残基被丙氨酸残基取代。这种命名法用于本文引述的所用其它残基改变，即所有位置均相对于酿酒酵母细胞色素b蛋白序列进行引述。酿酒酵母细胞色素b基因和蛋白序列可在EMBL和SWISSPROT数据库上获得(参见EMBL登录号X84042和SWISSPROT登录号P00163)。技术人员会认识到，得自不同物种的等同蛋白的精确长度和记录可能由于氨基末端或羧基末端和/或一个或多个内部缺失或插入而改变。由于含有对应于酿酒酵母中G143的残基的氨基酸序列段是非常保守的(Widger等Proc.Nat.Acad.Sci.，U.S.A.81(1984)674-678)，因此简单的是通过目测检测或应用几种序列比对程序之一(包括Megalign或Macaw)鉴定新获得的真菌细胞色素b序列中精确对应的残基。虽然在本申请中指定G143，但因为有位置等同体和功能等同体，在新的细胞色素b中该甘氨酸的精确位置可能不是从其氨基末端起的第143残基。在SWISSPROT登录号P00163中提供了酿酒酵母细胞色素b的共有序列。在本文描述的本发明的所有方面和实施方案中，细胞色素b序列中的位置最好相对于EMBL登录号X84042中提供的酿酒酵母细胞色素b序列来确定。或者，在本文描述的本发明的所有方面和实施方案中，细胞色素b序列中的位置最好相对于SWISSPROT登录号P00163中提供的酿酒酵母细胞色素b的共有序列来确定。
按照本发明的一个方面，提供用于诊断真菌细胞色素b基因中单核苷酸多态性的方法，所述方法包括测定相对于编码所述细胞色素b蛋白中与酿酒酵母细胞色素b残基143对应的位置上的氨基酸的三联体中的一个或多个碱基的对应位置上的真菌核酸序列，并且根据所述细胞色素b基因中的多态性确定所述真菌对嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的化合物的抗性状况。
在本文描述的本发明的所有方面和实施方案中，最好是在编码所述细胞色素b蛋白中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的氨基酸的三联体中仅一个碱基表现出突变，即仅在一个位置上存在单核苷酸多态性，进一步优选在所述三联体的第一个碱基或第二个碱基上、最尤其是所述三联体的第二个碱基上存在单核苷酸多态性。
按照本发明该方面的一个优选实施方案，提供用于诊断真菌细胞色素b基因中单核苷酸多态性的方法，所述方法包括测定在编码所述细胞色素b蛋白中相应于酿酒酵母细胞色素b残基143的位置上的氨基酸的三联体的第二个碱基的对应位置上的真菌核酸序列，并且根据所述细胞色素b基因中的多态性确定所述真菌对嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的化合物的抗性状况。
在本发明上述方面的一个实施方案中，本文描述的所述诊断方法是其中在所述DNA中编码所述细胞色素b蛋白中相应于酿酒酵母细胞色素b残基143的位置上的氨基酸的三联体中的第二个碱基的对应位置上的单核苷酸多态性是存在G和/或C。
表1密码子选择甘氨酸至丙氨酸的点突变要求在所述密码子的第二个碱基上G变为C。其它突变也可以在所述密码子的第三位上产生，这是因为丙氨酸和甘氨酸遗传密码的简并性(参见表1)，但这在设计所述诊断性引物时容易考虑到。诊断性引物最好是ARMS引物。(Newton等，NucleicAcid Research 17(7)2503-2516 1989中全面描述了ARMS引物的概念)。因此，可以设计ARMS引物，用于在野生型嗜球果伞素类似物敏感型细胞色素b基因上测定G143A点突变产生的唯一序列信息。不需要得到由于G143A突变产生的在新的目的真菌中的抗性分离菌。相关植物致病真菌的某些实例列于表2中。该表并不意味着是详尽的。植物病理学家将能够容易地鉴定出与本发明方法相关的那些真菌。
表2其中可以分析G143A的菌种实例本文描述的本发明方法特别可用于植物致病真菌，尤其是用于以下真菌菌种葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola)、禾白粉菌小麦/大麦致病变种(Erysiphe graminis f.sp.tritici/hordei)、黑麦喙孢(Rhynchosporium secalis)、圆核腔菌(Pyrenophora teres)、禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)、苹果黑星菌(Venturia inaequalis)、Mycosphaerella fijiensis var.difformis、单丝壳(Sphaerothecafuliginea)、葡萄钩丝壳(Uncinula necator)、禾生刺盘孢(Colletotrichumgraminicola)、瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、盘长孢状刺盘孢(Colletotrichum gloeosporioides)、番茄粉孢(Oidium lycopersicum)、Magnaporthe grisea、致病疫霉(Phytophthora infestans)、鞑靼内丝白粉菌(Leveillula taurica)、古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)、立枯链格孢(Alternaria solani)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、Mycosphaerella musicola和落花生尾孢(Cercospora arachidola)。
在再一方面，本发明提供用于检测真菌对嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中任何其它化合物的抗性的方法，所述方法包括鉴定真菌核酸中是否存在突变，其中所述突变的存在导致对嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中任何其它化合物的抗性，所述方法包括鉴定在编码所述细胞色素b蛋白中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的氨基酸的三联体中一个或多个碱基的对应位置上是否存在单核苷酸多态性。
在该方面的再一优选实施方案中，本发明提供用于检测真菌对于嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中任何其它化合物的抗性，所述方法包括鉴定真菌核酸是否存在突变，其中所述突变的存在导致对嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中任何其它化合物的抗性，所述方法包括鉴定在编码所述细胞色素b蛋白中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的氨基酸的三联体中第二位碱基的对应位置上是否存在单核苷酸多态性。
在本发明该方面的一个优选实施方案中，采用任何(或一种)单核苷酸多态检测技术，鉴定在真菌核酸的细胞色素b基因中编码与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的氨基酸的三联体中第二位碱基的对应位置上是否存在单核苷酸多态性。
本发明还提供编码全部或部分野生型细胞色素b蛋白的真菌DNA序列，其中所述DNA序列在所述野生型蛋白中与酿酒酵母细胞色素b残基143的相应位置上编码甘氨酸残基，其中所述序列可得自或得自选择以下的一种真菌葡萄生单轴霉、禾白粉菌小麦/大麦致病变种、黑麦喙孢、圆核腔菌、禾生球腔菌、Mycosphaerella fijiensis var.difformis、单丝壳、葡萄钩丝壳、禾生刺盘孢、瓜果腐霉、盘长孢状刺盘孢、番茄粉孢、鞑靼内丝白粉菌、古巴假霜霉、立枯链格孢、立枯丝核菌、Mycosphaerella musicola和落花生尾孢。
按照本发明上述方面的真菌DNA序列最好在所述DNA中对应于所述三联体中一个或多个碱基的位置的任何一侧或两侧，最好在编码所述蛋白中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的氨基酸的三联体中的第二位碱基的任何一侧或两侧，含有约30个核苷酸，因为该区域的核酸为技术人员提供了设计物种特异性和突变特异性试剂和/或用于所有单核苷酸多态检测技术中的方法所必需的所有信息。本文所用的术语约30个是指所述序列可以包含至多30个核苷酸，例如5个至10个、15个、20个或25个核苷酸，或可以包含30个以上的核苷酸。
在所有DNA序列和蛋白质序列方面本文所用的术语“全部或部分”用来指DNA序列或蛋白序列或者它们的片段。DNA或蛋白的片段可以例如是所述全长序列的10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。
对于本领域技术人员而言，显然含有基因组(线粒体)DNA和cDNA的样品均可以按照本发明分析。当需要考虑含有基因组DNA内含子组构的样品时，使用所述序列信息。按照本发明上述方面包含部分野生型细胞色素b基因序列的野生型真菌DNA序列的实例在下表中提供，所述序列构成本发明的再一方面。
表3在上表中，在编码与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的氨基酸的三联体中导致正常的甘氨酸残基被一个替代氨基酸取代的第二位碱基以粗体和下下划线显示，其中所述取代赋予对嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的化合物的抗性。
本发明也延伸至表现出与表3中所述DNA序列有同源性或序列同一性的真菌DNA序列，包括例如在同一物种的不同样品或分离物中发现的DNA序列的变异。这些变异可以例如是由于使用替代密码子选择、改变内含子/外显子线粒体组构和氨基酸取代而引起的。
在再一方面，本发明提供编码全部或部分细胞色素b蛋白的真菌DNA序列，当所述序列对准编码细胞色素b蛋白的野生型DNA序列排列时，可以观察到所述序列在所述DNA中编码所述蛋白质中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的氨基酸的三联体中一个或多个碱基的对应位置上，含有一个核苷酸多态突变，所述突变导致正常的甘氨酸残基被一个替代氨基酸取代，前提是所述DNA序列不是编码细胞色素b的乳柄小菇序列。
在该方面的再一优选实施方案中，本发明提供编码全部或部分细胞色素b蛋白的真菌DNA序列，当所述序列对准编码细胞色素b蛋白的野生型DNA序列排列时，可以观察到所述序列在所述DNA中编码所述蛋白质中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的氨基酸的三联体中第二位碱基的对应位置上，含有一个核苷酸多态突变，所述突变导致正常的甘氨酸残基被一个替代氨基酸取代，前提是所述DNA序列不是编码细胞色素b的乳柄小菇序列。
按照本发明上述方面的真菌DNA序列最好在所述DNA中对于应所述三联体中一个或多个碱基的位置的任何一侧或两侧，最好在编码所述蛋白中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的氨基酸的三联体中的第二位碱基的任何一侧或两侧，含有约30个核苷酸，因为该区域的核酸为技术人员提供了设计物种特异性和突变特异性试剂和/或用于所有单核苷酸多态检测技术中的方法所必需的所有信息。本文所用的术语约30个是指所述序列可以包含至多30个核苷酸，例如5个至10个、15个、20个或25个核苷酸，或可以包含30个以上的核苷酸。
本发明还提供编码全部或部分突变型细胞色素b蛋白的真菌DNA序列，其中所述DNA中突变的存在赋予对于嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的化合物的抗性，所述突变发生于所述DNA中编码所述蛋白质中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的氨基酸的三联体中一个或多个碱基的对应位置上，前提是所述DNA序列不是编码细胞色素b的乳柄小菇序列。
在该方面的一个优选实施方案中，本发明还提供编码全部或部分突变型细胞色素b蛋白的真菌DNA序列，其中所述DNA中突变的存在赋予对嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的化合物的抗性，所述突变发生于所述DNA中编码所述蛋白质中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的氨基酸的三联体中的第二位碱基的对应位置上，前提是所述DNA序列不是编码细胞色素b的乳柄小菇序列。
在本发明的上述方面中，发生在所述DNA中编码所述蛋白质中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的氨基酸的三联体中的第二位碱基的对应位置上的突变，最好是鸟嘌呤碱基变为胞嘧啶碱基。
按照本发明上述方面的编码全部或部分突变型细胞色素b蛋白的真菌DNA序列最好可得自或得自选自以下的一种真菌葡萄生单轴霉、禾白粉菌小麦/大麦致病变种、黑麦喙孢、圆核腔菌、禾生球腔菌、苹果黑星菌、Mycosphaerella fijiensis var.difformis、单丝壳、葡萄钩丝壳、禾生刺盘孢、瓜果腐霉、盘长孢状刺盘孢、番茄粉孢、Magnaporthe grisea、致病疫霉、鞑靼内丝白粉菌、古巴假霜霉、立枯链格孢、立枯丝核菌、Mycosphaerella musicola和落花生尾孢，其中所述DNA中突变的存在赋予对于嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的化合物的抗性。
本发明也延伸至包含全部或部分表3中所提供序列的DNA序列，其中在所述DNA中编码所述蛋白质中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的氨基酸的三联体中的第二位碱基的对应位置上的残基是胞嘧啶残基(SEQ ID NO 176-196)。这些序列示于以下，并且构成本发明的再一方面5’TTTTGCCTTGGGGACAAATGAGTTTTTGGGCTGCAACAGTTATTACAAATTTATTCTCGGC3’(SEQ ID NO 176).
5’TATTGCCATACGGGCAGATGAGCCACTGGGCTGCAACCGTTATCACTAACCTAATGAGCGC3’- (SEQ ID NO 177)5’TGCTTCCTTATGGACAGATGTCTTTATGAGCTGCCACAGTTATAACTAATCTTATGAGTGC3’-(SEQ ID NO 178)5’TTTTACCCTACGGGCAAATGAGCCTTTGAGCTGCTACAGTTATTACTAACCTTATGAGTGC3’-(SEQ ID NO 179)5’TTTTACCCTACGGGCAAATGAGCCTTTGAGCTGAAATATTTGCCTCAAATGTATAACTAAT3’-(SEQ ID NO 180)5’TATTACCTTATGGTCAAATGTCTTTATGAGCAGCAACAGTTATAACTAACTTATTGAGTGC3’(SEQ ID NO 181)5’TTTTACCTTATGGTCAAATGTCTTTATGAGCAGCTACAGTTATAACTAATTTAATGAGCGC3’-(SEQ ID NO 182)5’TACTTCCCTTCGGTCAAATGTCGCTCTGGGCTGCAACCGTTATTACTAACCTTATGAGCGC3’-(SEQ ID NO 183)5’*TCTGGGCTGCAACCGTTAAGTAATAGCGGTTGTAAAA-(SEQ ID NO 184)5’TTTTACCCTACGGGCAGATGAGCCTATGGGCTGCAACCGTTATTACTAACCTTATGAGCGC3’-(SEQ ID NO 185)5’*AGCCTATGGGCTGCAACCGTTAAGTAGGTAATAGCGGTTGA3’-(SEQ ID NO 186)5’TTTTACCTTACGGACAAATGTCATTATGAGCTGCTACAGTTATTACTAACCTTATAAGTGC3’-(SEQ ID NO 187)5’TATTACCTTGGGGTCAAATGAGTTTTTGGGCTGCTACTGTTATTACTAATTTATTTTCAGC3’-(SEQ ID NO 188)5’TTTTACCTTATGGACAAATGTCATTATGAGCTGCAACAGTTATTACTAACCTTATAAGTGC3’-(SEQ ID NO 189)5’TTTTACCCTACGGGCAGATGAGCCTGTGGGCTGCAACCGTTATTACTAACCTTATGAGCGC3’-(SEQ ID NO 190)5’TTTTACCATACGGACAAATGTCATTATGAGCTGCAACAGTTATTACTAACCTTATGAGTGC3’-(SEQ ID NO 191)5’TTTTACCTTGGGGACAAATGAGTTTTTGGGCTGCAACTGTTATTACTAATTTATTTTCTGC3’-(SEQ ID NO 192)5’TTCTTCCTTATGGGCAAATGTCTTTATGAGCTGCTACAGTTATTACTAACCTTATGAGTGC3’-(SEQ ID NO 193)5’TATTACCTTATGGACAAATGTCATTATGAGCAGCTACAGTTATTACTAATTTATTATCTGC3’- (SEQ ID NO 194)5’TGCTTCCATACGGGCAAATGTCTCTGTGGGCTGCTACAGTAATTACTAATTTACTTTCTGC3’-(SEQ ID NO 195)5’TTTTACCTTATGGTCAAATGTCTTTATGAGCAGCTACAGTTATAACTAATTTAATGAGTGC3’(SEQ ID NO 196)本发明也延伸至表现出与含所述多态性的所述DNA序列有同源性或序列同一性的真菌DNA序列，包括例如在同一物种的不同样品中发现的DNA序列的变异。这些变异可以例如是由于应用替代密码子选择、改变内含子/外显子线粒体组构和氨基酸取代而引起的。
编码全部或部分本文所述的野生型或突变型细胞色素b蛋白的DNA序列最好为分离的形式。例如，通过从天然存在的任何物质中进行部分纯化。所述DNA序列是可分离自(可得自)或分离自(得自)本文公开的真菌。
本发明还提供存储本文所述并且要求保护的任何所述序列的计算机可读形式的媒介，所述序列包括编码本文所述的突变型细胞色素b蛋白的全部或部分DNA序列或蛋白质序列，其中所述突变的存在导致真菌对于嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中任何化合物的抗性；来自选自以下真菌的编码突变型细胞色素b蛋白的全部或部分DNA序列或蛋白质序列葡萄生单轴霉、禾白粉菌小麦/大麦致病变种、黑麦喙孢、圆核腔菌、禾生球腔菌、苹果黑星菌、Mycosphaerellafijiensis var.difformis、单丝壳、葡萄钩丝壳、禾生刺盘孢、瓜果腐霉、盘长孢状刺盘孢、番茄粉孢、Magnaporthe grisea、致病疫霉、鞑靼内丝白粉菌、古巴假霜霉、立枯链格孢、立枯丝核菌、Mycosphaerellamusicola和落花生尾孢，其中所述蛋白质赋予真菌对于嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的化合物的抗性，前提是所述DNA序列或蛋白质序列不是乳柄小菇的细胞色素b序列；选自以下的一种真菌的编码野生型细胞色素b序列的全部或部分DNA序列或蛋白质序列葡萄生单轴霉、禾白粉菌小麦/大麦致病变种、黑麦喙孢、圆核腔菌、禾生球腔菌、Mycosphaerella fijiensis var.difformis、单丝壳、葡萄钩丝壳、禾生刺盘孢、瓜果腐霉、盘长孢状刺盘孢、番茄粉孢、鞑靼内丝白粉菌、古巴假霜霉、立枯链格孢、立枯丝核菌、Mycosphaerellamusicola和落花生尾孢；或任何等位基因特异性寡核苷酸；本文公开的等位基因特异性寡核苷酸探针、等位基因特异性引物、共用引物或诊断性引物。
所述计算机可读媒介可以用于例如同源性搜索、作图、单倍型定型(haplotyping)、基因型定型(genotyping)或任何其它生物信息分析。任何计算机可读媒介均可以使用例如光盘、磁带、软盘、硬式磁盘机或计算机芯片。
本发明的多核苷酸序列或其部分、特别是涉及并且鉴定本文鉴定的单核苷酸多态性(尤其是真菌细胞色素b中引起所编码蛋白中G143A改变的G变为C)的那些多核苷酸序列，是有价值的信息源。通过在计算机可读媒介中存储所述序列信息，然后以标准生物信息程序应用所述信息，最容易促进该信息源的应用。本发明的多核苷酸序列作为数据库中的组成部分特别有用，用以进行序列同一性和其它搜索分析。本文所用的与本发明多核苷酸或多核苷酸序列有关的在计算机可读媒介中所述序列信息的存储以及在序列数据库中的应用，包括可以还原为、转变为有形媒介或以有形媒介存储的本发明多核苷酸的任何可检测的化学特征或物理特征，所述有形媒介例如计算机盘，最好为计算机可读形式。例如，色谱扫描数据或峰数据、照相扫描数据或峰数据、质谱数据、序列凝胶(或其它)数据。
也提供基于计算机的方法用以进行序列鉴定，所述方法包括以下步骤提供一种计算机可读媒介的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含本发明的一种多态性；并且将所述含有多态性的多核苷酸序列与至少一种其它多核苷酸或多肽序列比较，以鉴定同一性(同源性)，即筛选所述多态性的存在。
本发明还提供赋予真菌对于嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的化合物的抗性的真菌细胞色素b蛋白，其中在所述蛋白质中，由于编码所述蛋白质的DNA中存在突变而改变了正常的甘氨酸残基，所述突变发生在所述DNA中编码所述蛋白质中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的氨基酸的三联体中的一个或多个碱基的对应位置上，前提是所述序列不是乳柄小菇的细胞色素b序列。
在该方面的一个优选实施方案中，本发明还提供赋予真菌对于嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的化合物的抗性的真菌细胞色素b蛋白，其中在所述蛋白质中，由于编码所述蛋白质的DNA中存在突变而改变了正常的甘氨酸残基，所述突变发生在所述DNA中编码所述蛋白质中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的氨基酸的三联体中的第二位碱基的对应位置上，前提是所述序列不是乳柄小菇的细胞色素b序列。
乳柄小菇的细胞色素b序列由Kraiczy等描述(Eur.J.Biochem.235，54-63(1996))，而所述DNA序列在EMBL数据库中，EMBL登录号为X87997。
在按照本发明上述方面的蛋白质中的甘氨酸残基，最好被一个替代氨基酸取代，并且所述取代导致所述真菌表现出对于嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中任何其它化合物的抗性。
按照本发明上述方面的突变最好导致所述甘氨酸残基被选自以下的一种氨基酸取代精氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酸，最好是丙氨酸。
再一方面，本发明提供能够识别所述突变型细胞色素b蛋白的抗体。
再一方面，本发明提供一种方法，用于检测真菌细胞色素b基因中导致在所编码蛋白中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的甘氨酸残基被取代的突变，所述方法包括鉴定真菌核酸样品中所述突变是否存在，其中任何(或一种)单核苷酸多态检测方法基于来自编码所述野生型或突变型蛋白质中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的氨基酸的三联体中一个或多个碱基的对应位置的上游和/或下游约30-90个核苷酸的序列信息。
在该方面的再一优选实施方案中，本发明提供一种方法，用于检测真菌细胞色素b基因中导致在所编码蛋白中G143A取代的突变，所述方法包括鉴定真菌核酸样品中所述突变是否存在，其中任何(或一种)单核苷酸多态检测方法基于来自编码所述野生型或突变型蛋白质中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的氨基酸的三联体中第二位碱基的对应位置的上游和/或下游约30-90个核苷酸的序列信息。
在该方面的再一优选实施方案中，本发明提供一种方法，用于检测真菌细胞色素b基因中导致在所编码蛋白中G143A取代的鸟嘌呤变为胞嘧啶的突变，所述方法包括鉴定真菌核酸样品中所述突变是否存在，其中任何(或一种)单核苷酸多态检测方法基于来自编码所述野生型或突变型蛋白质中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的氨基酸的三联体中第二位碱基的对应位置的上游和/或下游约30-90个核苷酸的序列信息。
按照本发明上述方面的序列信息最好得自选自以下的一种真菌葡萄生单轴霉、禾白粉菌小麦/大麦致病变种、黑麦喙孢、圆核腔菌、禾生球腔菌、苹果黑星菌、Mycosphaerella fijiensis var.difformis、单丝壳、葡萄钩丝壳、禾生刺盘孢、瓜果腐霉、盘长孢状刺盘孢、番茄粉孢、Magnaporthe grisea、致病疫霉、鞑靼内丝白粉菌、古巴假霜霉、立枯链格孢、立枯丝核菌、Mycosphaerella musicola和落花生尾孢，所述真菌更优选选自葡萄生单轴霉、禾白粉菌小麦/大麦致病变种、黑麦喙孢、圆核腔菌、禾生球腔菌、Mycosphaerella fijiensis var.difformis、单丝壳、葡萄钩丝壳、禾生刺盘孢、瓜果腐霉、盘长孢状刺盘孢、番茄粉孢、鞑靼内丝白粉菌、古巴假霜霉、立枯链格孢、立枯丝核菌、Mycosphaerella musicola和落花生尾孢。
本文所用的术语约30个是指所述序列可以包含至多30个核苷酸，例如5个至10个、15个、20个或25个核苷酸，或可以包含30个以上的核苷酸。在本发明的上述方面，最好所用的序列信息是编码所述野生型或突变型蛋白质中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的氨基酸的三联体中第二位碱基的对应位置的上游和/或下游约30个、最好是30个核苷酸的序列信息。
按照本发明的核酸最好是DNA，所述核酸的受试样品方便地是来自真菌材料的总DNA制备物、来自真菌材料或真菌材料本身或含真菌核酸的植物或种子提取物的cDNA制备物。在本发明中，我们描述了通过用总DNA制备物、cDNA制备物以及通过直接用真菌孢子材料作为PCR中的模板，检测G143A突变。人们会认识到，受试样品同样可以是对应于所述受试样品中序列的核酸序列。也就是说，可以首先分离出或用任何便利的技术例如PCR扩增样品核酸中的全部或部分所述区，然后将其用于本发明方法中。
本发明提供分析农田样品的DNA中突变的方法，所述突变由于其起源特殊，与包括人类样品在内的类似情况相比，其确定要差得多。农田样品的研究要困难得多，与通常含有仅来自一个个体的DNA的人类样品相比，在非常大量的野生型DNA和/或来自田间分离物中存在的其它有机体的无关DNA中检测低频率发生的突变事件，对于技术的要求更高。
可以使用任何便利的聚合用酶，前提是它没有以任何显著程度的鉴别正常模板序列和突变型模板序列之间的固有能力。便利的酶的实例包括没有显著3’-5’外切核酸酶活性的热稳定酶，例如Taq DNA聚合酶，特别是‘Ampli Taq Gold’TMDNA聚合酶(PE AppliedBiosystems)、Stoffel片段或Taq(Thermus aquaticus)或Tth(Thermusthermophilus)DNA聚合酶的其它合适的N末端缺失修饰物。
再一方面，本发明提供能够与选自以下真菌的编码野生型细胞色素b蛋白的全部或部分真菌核酸序列结合的等位基因特异性寡核苷酸葡萄生单轴霉、禾白粉菌小麦/大麦致病变种、黑麦喙孢、圆核腔菌、禾生球腔菌、苹果黑星菌、Mycosphaerella fijiensis var.difformis、单丝壳、葡萄钩丝壳、禾生刺盘孢、瓜果腐霉、盘长孢状刺盘孢、番茄粉孢、Magnaporthe grise、致病疫霉、鞑靼内丝白粉菌、古巴假霜霉、立枯链格孢、立枯丝核菌、Mycosphaerella musicola和落花生尾孢，其中所述寡核苷酸包含一段序列，所述序列识别编码与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的甘氨酸残基的核酸序列。
在本发明该方面的一个优选实施方案中，所述真菌核酸序列选自葡萄生单轴霉、禾白粉菌小麦/大麦致病变种、黑麦喙孢、圆核腔菌、禾生球腔菌、Mycosphaerella fijiensis var.difformis、单丝壳、葡萄钩丝壳、禾生刺盘孢、瓜果腐霉、盘长孢状刺盘孢、番茄粉孢、鞑靼内丝白粉菌、古巴假霜霉、立枯链格孢、立枯丝核菌、Mycosphaeyellamusicola和落花生尾孢。
按照本发明上述方面的真菌核酸最好是DNA。
在本发明的再一方面，我们提供能够与编码全部或部分突变型细胞色素b蛋白的真菌核酸序列结合的等位基因特异性寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含一段序列，所述序列识别在与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上编码选自以下一种氨基酸的核酸序列精氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、色氨酸，最好是丙氨酸。
在本发明该方面的一个优选实施方案中，我们提供能够与编码全部或部分突变型细胞色素b蛋白的选自以下真菌的真菌核酸序列结合的等位基因特异性寡核苷酸葡萄生单轴霉、禾白粉菌小麦/大麦致病变种、黑麦喙孢、圆核腔菌、禾生球腔菌、苹果黑星菌、Mycosphaerellafijiensis var.difformis、单丝壳、葡萄钩丝壳、禾生刺盘孢、瓜果腐霉、盘长孢状刺盘孢、番茄粉孢、Magnaporthe grisea、致病疫霉、鞑靼内丝白粉菌、古巴假霜霉、立枯链格孢、立枯丝核菌、Mycosphaerellamusicola和落花生尾孢，其中所述寡核苷酸包含一段序列，所述序列识别在与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上编码选自以下一种氨基酸的核酸序列精氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、色氨酸、最好是丙氨酸。
按照本发明上述方面的真菌核酸最好是DNA。
再一方面，本发明提供一种等位基因特异性寡核苷酸探针，所述探针能够检测在所述DNA中编码所述蛋白质中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的氨基酸的三联体中一个或多个碱基的对应位置上的真菌细胞色素b基因多态性。
在该方面的再一优选实施方案中，本发明提供一种等位基因特异性寡核苷酸探针，所述探针能够检测在所述DNA中编码所述蛋白质中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的氨基酸的三联体中第二位碱基的对应位置上的真菌细胞色素b基因多态性。
在本发明上述方面的再一优选实施方案中，所述多态性是鸟嘌呤碱基变为胞嘧啶碱基，所述突变在选自以下的真菌中葡萄生单轴霉、禾白粉菌小麦/大麦致病变种、黑麦喙孢、圆核腔菌、禾生球腔菌、苹果黑星菌、Mycosphaerella fijiensis var.difformis、单丝壳、葡萄钩丝壳、禾生刺盘孢、瓜果腐霉、盘长孢状刺盘孢、番茄粉孢、Magnaporthegrisea、致病疫霉、鞑靼内丝白粉菌、古巴假霜霉、立枯链格孢、立枯丝核菌、Mycosphaerella musicola和落花生尾孢。
所述等位基因特异性寡核苷酸探针优选长17-50个核苷酸，更优选长约17-35个核苷酸，最优选长约17-30个核苷酸。
这类探针的设计对于普通分子生物学者是显而易见的，并且可以基于DNA或RNA序列信息。这类探针具有任何方便的长度，例如至多50个碱基、至多40个碱基，更方便的是长度为至多30个碱基，例如长8-25个或8-15个碱基。一般而言，这类探针将包含与所述基因中相应的野生型或变异型基因座完全互补的碱基序列。然而，如果需要，可以引入一个或多个错配，前提是不过分影响所述寡核苷酸探针的鉴别能力。本发明的探针可以带有一个或多个标记，以便于检测。
本发明还提供核苷酸引物，所述核苷酸引物可以检测按照本发明的核苷酸多态性。
按照本发明的另一方面，提供等位基因特异性引物，所述引物能够检测在所述DNA中编码所述蛋白质中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的氨基酸的三联体中一个或多个碱基的对应位置上的细胞色素b基因多态性。
按照本发明该方面的一个优选实施方案，提供等位基因特异性引物，所述引物能够检测在所述DNA中编码所述蛋白质中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的氨基酸的三联体中第二位碱基的对应位置上的细胞色素b基因多态性。
在上述方面中，所述DNA序列中的突变最好是鸟嘌呤碱基改变为胞嘧啶碱基。
在再一方面，本发明提供能够检测选自以下一种真菌的编码野生型细胞色素b蛋白的真菌DNA序列的等位基因特异性引物葡萄生单轴霉、禾白粉菌小麦/大麦致病变种、黑麦喙孢、圆核腔菌、禾生球腔菌、苹果黑星菌、Mycosphaerella fijiensis var.difformis、单丝壳、葡萄钩丝壳、禾生刺盘孢、瓜果腐霉、盘长孢状刺盘孢、番茄粉孢、Magnaporthe grisea、致病疫霉、鞑靼内丝白粉菌、古巴假霜霉、立枯链格孢、立枯丝核菌、Mycosphaerella musicola和落花生尾孢，其中所述引物能够检测在与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上编码甘氨酸残基的DNA序列。
在本发明该方面的一个优选实施方案中，所述真菌DNA序列选自以下真菌的DNA序列葡萄生单轴霉、禾白粉菌小麦/大麦致病变种、黑麦喙孢、圆核腔菌、禾生球腔菌、Mycosphaerella fijiensis var.difformis、单丝壳、葡萄钩丝壳、禾生刺盘孢、瓜果腐霉、盘长孢状刺盘孢、番茄粉孢、鞑靼内丝白粉菌、古巴假霜霉、立枯链格孢、立枯丝核菌、Mycosphaerella musicola和落花生尾孢。
在本发明的再一方面，我们提供能够检测编码全部或部分突变型细胞色素b蛋白的真菌DNA序列的等位基因特异性引物，其中所述等位基因特异性引物能够检测在与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上编码选自以下的一种氨基酸的DNA序列精氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、色氨酸，最好是丙氨酸。
在本发明该方面的一个优选实施方案中，我们提供能够检测选自以下真菌的编码全部或部分突变型细胞色素b蛋白的真菌DNA序列的等位基因特异性引物葡萄生单轴霉、禾白粉菌小麦/大麦致病变种、黑麦喙孢、圆核腔菌、禾生球腔菌、苹果黑星菌、Mycosphaerellafijiensis var.difformis、单丝壳、葡萄钩丝壳、禾生刺盘孢、瓜果腐霉、盘长孢状刺盘孢、番茄粉孢、Magnaporthe grisea、致病疫霉、鞑靼内丝白粉菌、古巴假霜霉、立枯链格孢、立枯丝核菌、Mycosphaerellamusicola和落花生尾孢，其中所述引物能够检测在与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的编码选自以下一种氨基酸的DNA序列精氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、色氨酸，最好是丙氨酸。
等位基因特异性引物通常与共用引物一起用于扩增反应例如PCR反应中，这通过选择性扩增特定序列位置上的一个等位基因提供了等位基因之间的鉴别，例如用于ARMS测定中。
我们现在已经设计了用于以上所列真菌菌种中G143A突变的引物，已经表明所述引物可用来可靠地和加强地检测出特定突变。所述引物检测在所述DNA中编码所述蛋白质中与酿酒酵母b残基143相应位置上的氨基酸的三联体中第二位碱基的相应位置上鸟嘌呤碱基变为胞嘧啶碱基。所述等位基因特异性引物在本文中称为诊断性引物。因此，再一方面，本发明提供能够与包含突变型真菌细胞色素b核酸序列的模板结合的诊断性引物，其中所述引物3’端的最后一个核苷酸对应于所述突变型真菌细胞色素b基因中存在的核苷酸，并且所述核苷酸的存在导致真菌对于嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中任何其它化合物的抗性。
本发明的诊断性引物优选至少长20个核苷酸，最优选长26个核苷酸，但这可以长15-20个核苷酸。
在本发明上述方面的一个优选实施方案中，所述引物中倒数第二位核苷酸(-2)与野生型细胞色素b序列的对应位置中存在的核苷酸不同。
在再一优选实施方案中，正是所述引物的-3核苷酸与野生型细胞色素b序列的对应位置中存在的核苷酸不同。
其它去稳定组分可以与所述-2或-3核苷酸一起掺入。
在本发明上述方面的再一特别优选的实施方案中，我们提供能够与包含突变体真菌细胞色素b核苷酸序列的模板结合的诊断性引物，其中所述引物3’端的最后一个核苷酸对应于所述突变型真菌细胞色素b基因中存在的核苷酸，并且其中其余核苷酸中的至多10个、例如至多8个、6个、4个、2个、1个核苷酸可以相对于野生型序列而改变，而不显著影响所述诊断性引物的特性。
在本发明上述方面的再一特别优选的实施方案中，我们提供包含以下所列序列及其衍生物的诊断性引物，其中3’端的最后一个核苷酸与以下所列序列相同，并且其中其余核苷酸中的至多10个、例如至多8个、6个、4个、2个、1个核苷酸可以改变，而不显著影响所述诊断性引物的特性。
方便的是，所述诊断性引物的序列与以下所提供序列完全一样。最好是本发明所有方面中的ARMS引物长26个核苷酸。在大多数以下所列引物中，已经使倒数第二位核苷酸与野生型cytb序列不同，以将所述引物去稳定，由此使其对所述模板更具选择性，并且这些引物按照本发明是特别优选的。对于引物设计领域的技术人员而言，显而易见的是在不会不利地影响所述引物与所需模板结合的能力的情况下，上述碱基的替代碱基或除上述碱基以外的碱基也可以改变。
表4用于检测G143A突变的ARMS引物设计作为举例，表4中所包括的引物包括●用于圆核腔菌和苹果黑星菌的ARMS引物，它们可以有效用于或者基因组DNA制备物或者生物样品，所述生物样品包括真菌分离物、真菌培养物、真菌孢子或受感染的植物材料。●用于单丝壳、番茄粉孢、鞑靼内丝白粉菌、葡萄钩丝壳、致病疫霉、Magnaporthe grisea、立枯丝核菌的ARMS引物，它们仅可以有效用于cDNA。●用于葡萄生单轴霉、禾白粉菌小麦或大麦致病变种、黑麦喙孢、禾生球腔菌、M.fijiensis var.difformis、禾生刺盘孢、瓜果腐霉、盘长孢状刺盘孢、古巴假霜霉、落花生尾孢、Mycosphaerellamusicolad和立枯链格孢的ARMS引物，它们可以有效用于或者基因组DNA制备物、cDNA制备物、cDNA制备物或者生物样品，所述生物样品包括真菌分离物、真菌培养物、真菌孢子或受感染的植物材料。
建议使用其中目前在目的单核苷酸多态性(SNP)周围未鉴定出内含子/外显子组构的菌种的cDNA材料。
为了使示于上表中的引物适合用于标准ASPCR反应，3’端的最后一个碱基应该对应于所述点突变，而不引入去稳定碱基。
这类引物可以使用任何常规合成方法制备。这类方法的实例可以在标准教科书中找到，所述教科书例如为“Protocols ForOligonucleotides And AnaloguesSynthesis And Properties；”MethodsIn Molecular Biology Series；第20卷；Sudhir Agrawal编著，HumanaISBN0-89603-247-7；1993；第1版。
人们会认识到，可以设计诊断性引物的延伸，以指示导致所编码蛋白质中G143A取代的突变不存在。最好应用ARMS引物来检测出导致所编码蛋白质中G143A取代的突变不存在。本文描述了设计用于该目的引物。
野生型序列的检测可用作检测所述突变的对照，也是需要定量测定样品中存在的野生型和突变型等位基因时所必需的。
因此再一方面，本发明提供能够与包含野生型真菌细胞色素b核苷酸序列的模板结合的诊断性引物，其中所述引物3’端最后一个核苷酸对应于野生型真菌细胞色素b基因中存在的核苷酸，而所述野生型真菌表现出对嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中任何其它化合物敏感性。
在本发明该方面的一个优选实施方案中，所述引物的倒数第二位核苷酸(-2)与野生型细胞色素b序列的对应位置中存在的核苷酸不同。
在再一优选实施方案中，所述引物的-3核苷酸与野生型细胞色素b序列的对应位置中存在的核苷酸不同。
其它去稳定组分可以与所述-2或-3核苷酸一起掺入。
本发明的诊断性引物优选至少长20个氨基酸，最优选长26个核苷酸，但可以长15-20个核苷酸。在本发明上述方面的再一特别优选的实施方案中，我们提供能够与包含野生型真菌细胞色素b核苷酸序列的模板结合的诊断性引物，其中所述引物3’端的最后一个核苷酸对应于野生型真菌细胞色素b中存在的核苷酸，并且其中其余核苷酸中的至多10个、例如至多8个、6个、4个、2个、1个核苷酸可以相对于野生型序列而改变，而不显著影响所述诊断性引物的特性。
在本发明该方面的再一特别优选的实施方案中，我们提供包含以下所列序列及其衍生物的诊断性引物，其中3’端的最后一个核苷酸与以下所列序列相同，并且其中其余核苷酸中的至多10个、例如至多8个、6个、4个、2个、1个核苷酸可以改变，而不显著影响所述诊断性引物的特性。方便的是，所述诊断性引物的序列与以下所提供序列完全一样。在大多数以下所列引物中，已经使倒数第二位核苷酸与野生型细胞色素b序列不同，以将所述引物去稳定，由此使其对所需模板更具选择性。对于引物设计领域的技术人员而言，显而易见的是在不会不利地影响所述引物与所述模板结合的能力的情况下，上述碱基的替代碱基或除上述碱基以外的碱基也可以改变。
表5用于检测野生型序列的ARMS引物设计为了使上表中所示引物适合用于标准ASPCR反应，3’端的最后一个碱基应该对应于所述野生型序列，而不引入去稳定碱基。
上述实例涉及基于DNA正向链的ARMS引物。特别优选应用基于DNA正向链的ARMS引物。
如果需要，ARMS引物也可以基于DNA的反向链。根据上述用于正向链引物的相同原理，设计这类反向链引物，即所述引物可以至少长20个氨基酸，最优选长26个核苷酸，但可以长15-20个核苷酸，并且所述引物3’端的最后一个核苷酸与相关模板(即突变型或野生型)匹配，最好倒数第二位残基被最佳改变，使得它与所述相关模板不匹配。另外，在所述引物中，其余核苷酸中的至多10个、例如至多8个、6个、4个、2个、1个核苷酸可以改变，而不显著影响所述诊断性引物的特性。
在许多情况下，方便的是在一个或多个PCR扩增循环中，应用本发明的诊断性引物和本文称为共用引物的另一种扩增引物。在欧洲专利号EP-B1-0332435中叙述了该方面的一个便利的实例。所述另一种扩增引物或者是正向或者是反向共用引物。对于每个菌种，所用的引物如下。以下所示的引物是反向引物。
表6与ARMS引物一起使用的共用引物的实例在表6中所提供的较长序列的情况下，技术人员将能够应用该信息来设计合适的引物。
对本领域技术人员显而易见的是，所述共用引物可以是任何方便的识别位于所述突变选择性引物3’的细胞色素b基因(或其它目的基因)互补链的病原体特异性序列。
所述PCR扩增子的大小优选长50-400bp，但可以长30-2500bp，或可能长30-10,000bp.
可以使用一种方便的对照引物，所述对照引物设计位于G143A位置的上游。对本领域技术人员显而易见的是，所述对照引物可以是非特异性地扩增所述突变序列或野生型序列的任何引物。当与上述相应的反向(“共用”)引物一起使用这些引物时，无论是否存在G143A点突变，都将发生扩增。
表7可能的对照引物设计的实例可以使用多种方法来检测诊断性引物延伸产物和/或扩增产物是否存在。这些对于核酸检测方法领域的技术人员而言是显而易见的。优选的方法取消了放射性标记试剂的需要。特别优选的检测方法是基于荧光检测诊断性引物延伸产物是否存在的方法。具体的检测方法包括凝胶电泳分析、于1998年11月25日以Zeneca Limited的名义申请的PCT申请号PCT/GB98/03521中描述的“Scorpions”TM产物检测法(所述申请的内容通过引用结合到本文中)、“Taqman”TM产物检测法例如专利号US-A-5487972和US-A-5210015中描述的方法；在专利号WO-95/13399中概述的“Molecular Beacons”产物检测法以及在专利申请WO 97/05280中概述的表面增强Raman共振光谱学(SERRS)。其它优选的检测方法包括ARMS线性延伸(ALEX)以及公布的PCT申请号WO 99/04037中描述的运用ALEX的PCR。方便的是，使用实时检测。特别优选将PCT申请号PCT/GB98/03521和公布的UK专利申请号GB2338301中描述的“Scorpions”TM产物检测法的应用，用于本文描述的本发明所有方面。特别优选将本文描述的ARMS和Scorpion技术的组合用于本文所述的本发明的所有方面，优选的检测法是基于荧光的检测法。这些检测法中的许多方法适合于使用所有上述引物的定量研究。可以在不同试管中进行这些不同的PCR，或者在一个试管中进行多重的这些不同PCR。使用这类方法，可以对野生型分子背景中的点突变分子存在的频率进行估计。
如本文例举的，我们已经用基于DNA正向链的ARMS引物且结合基于DNA反向链的Scorpion检测作为检测方法。Scorpion检测元件最好包含表6中所示的反向引物。本领域技术人员容易看出，也可以使用ARMS引物和Scorpion检测元件的替代组合。例如，基于所述DNA正向链的引物可以是ARMS引物与Scorpion检测系统的组合，并且可以将其与基于DNA反向链的共用引物一起使用，或者基于DNA反向链的引物可以是ARMS引物与Scorpion检测系统的组合，并且可以将其与基于DNA正向链的共用引物一起使用。
在本文所述的大多数实施例中，所述Scorpion检测元件在所述共用引物上。对所述突变序列和野生型序列特异性的ARMS引物与荧光标记的所述共用引物联合使用。这两个反应在不同的PCR试管中进行，当所述探针与所产生的扩增子结合时，发出荧光。或者，可以将所述Scorpion元件掺入到ARMS引物中。在这种情况下，这两种ARMS引物可以用不同的荧光团标记，并且与所述共用引物(这时是未标记的)一起使用。这三种引物可以包括在同一反应中，因为所得的突变型扩增子和野生型扩增子将导致发出不同的荧光。
正如在公布的UK专利申请号GB2338301中所描述的，Scorpions技术可以以许多不同方式应用，例如嵌入实施方案，其中Scorpions引物尾部带有能够掺入双链核酸分子的碱基之间的嵌入染料，在掺入时所述嵌入染料成为高度发荧光的；FRET实施方案，其中在所述引物中所包含的染料形成能量传递对；无淬灭剂实施方案，其中荧光团与Scorpions引物尾部连接；Bimolecular实施方案，其中可以将荧光团和淬灭剂引入两个分离但互补的分子上；捕获探针实施方案，其中可以用相同的非扩增性尾特异性地捕获和探测扩增子；和茎区(Stem)实施方案，其中所述引物尾部包含自身互补茎区。在公布的UK专利申请号GB2338301中全面描述了这些实施方案，所述申请的内容通过引用结合到本文中。
本文所述的本发明方法可靠地检测真菌基因的突变，其中所述突变的存在导致真菌对于其靶蛋白由线粒体基因编码的杀真菌剂的抗性，其检测水平范围为每1,000,000个野生型等位基因1个突变型等位基因至每10,000个野生型等位基因1个突变型等位基因，优选范围为每100,000个野生型等位基因1个突变型等位基因至每10,000个野生型等位基因1个突变型等位基因。本发明的方法也可以检测以较高频率发生的突变，例如每100个野生型等位基因1个突变型等位基因、每10个野生型等位基因1个突变型等位基因，或其中仅存在突变型等位基因。同样，本发明的方法可以用来检测突变型等位基因背景中野生型等位基因的频率。
由于利用ARMS技术和用于本发明中的定量法而使得更为灵敏的等位基因特异性引物延伸的组合，使其成为极其有价值的检测以低频率发生的真菌突变的技术。
检测给定分离物中存在的等位基因，使得能够将表型生物分析的结果与靶基因的DNA分布型相联系。单点突变作为抗性机制的发现解释了所述抗性的定量性质，而单一孢子分离物序列的证实，证实了所述筛选在测定受试样品中抗性分离物和敏感性分离物频率中的准确性。
将等位基因特异性引物延伸、ARMS的特异性和本文例举的实时荧光检测与Scorpion系统结合在一起的方法的开发，使得与生物测定程序中可行的方法相比能够分析更大量样品中抗性突变的存在。更大的样品数使得能够鉴定出以低于通过生物测定可以容易检测出低百分比频率的抗性突变。这使得能够在根据田间数据明显看出抗性之前，在所述群体中鉴定出所述抗性。与采用生物测定所能够取样和测试的区域和部位相比，该方法的高通量特性使得能够对更大区域和更多部位进行取样和测试。与实时荧光检测结合的等位基因特异性引物延伸例如ARMS，允许在通过生物测定在异质细胞和/或异核细胞中根据表型观察到所述基因的效应之前，检测群体中所述抗性基因的存在，因此减少了当样品携带低频率抗性基因型时将样品分为敏感性的误差。与等待在植物中发生病害相比，通过同时读出(实时)获得结果要快得多，这使得能够更加快速地对大田情况作快速反应和对抗性管理提出建议。
可以将一种或多种本发明的诊断性引物与本发明方法使用的说明以及合适的包装合宜地包装在一起，并且作为试剂盒出售。试剂盒将合适地包括以下中的一种或多种诊断性、野生型、对照和共用寡核苷酸引物合适的核苷酸三磷酸，例如dATP、dCTP、dGTP、dTTP；一种合适的如先前描述的聚合酶；和一种缓冲液。
在再一方面，本发明提供一种检测植物致病真菌抗杀真菌剂抗性的方法，所述方法包括检测真菌基因中的突变，其中所述突变的存在导致真菌对嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中任何其它化合物的抗性，所述方法包括用任何(或一种)单核苷酸多态检测技术鉴定真菌核酸中所述突变是否存在。
在该方面的再一实施方案中，本发明提供一种检测植物致病真菌抗杀真菌剂抗性的方法，所述方法包括检测PCR反应期间产生的扩增子的存在，其中所述PCR反应包括在合适的核苷酸三磷酸和一种用于聚合的试剂存在下使包含真菌核酸的受试样品与诊断性引物接触，其中所述扩增子的检测与所述核酸中是否存在突变直接相关，其中所述突变的存在导致对于其靶蛋白由线粒体基因编码的杀真菌剂的抗性。
在该方面的一个优选实施方案中，本发明提供一种检测植物致病真菌对于其靶蛋白由线粒体基因编码的杀真菌剂的抗性的方法，所述方法包括在合适的核苷酸三磷酸和一种用于聚合的试剂存在下使包含真菌核酸的受试样品与特定突变的诊断性引物接触，所述突变的存在导致对于所述杀真菌剂的抗性，使得当在所述样品中存在所述突变时，所述诊断性引物得以延伸；然后根据诊断性引物延伸产物是否存在来检测所述突变是否存在。
在该方面的再一优选实施方案中，本发明提供一种检测植物致病真菌对于其靶蛋白由线粒体基因编码的杀真菌剂的抗性的方法，所述方法包括在合适的核苷酸三磷酸和一种用于聚合的试剂存在下使包含真菌核酸的受试样品与特定突变的诊断性引物接触，所述突变的存在导致对于所述杀真菌剂的抗性，使得仅当在所述样品中存在所述突变时，所述诊断性引物才得以延伸；然后根据诊断性引物延伸产物是否存在来检测所述突变是否存在。
在上述方面和实施方案中描述的本发明方法，尤其适合用于其中细胞色素b基因中突变的存在导致杀真菌剂抗性的植物致病真菌菌株，最尤其适合用于其中所述突变导致对于嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的化合物的抗性的植物致病真菌菌株，最尤其是在所述真菌DNA中的所述突变导致在所编码蛋白中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的甘氨酸残基被取代的情况下，更尤其是在所述突变导致所编码蛋白中的G143A取代的情况下，尤其是在所述突变是在与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的密码子中第二位上G变为C的碱基改变。
在再一方面，本发明提供一种对于导致植物致病真菌对其靶蛋白由线粒体基因编码的杀真菌剂的抗性的突变频率的检测并定量的方法，所述方法包括检测真菌基因中突变是否存在，其中所述突变的存在导致真菌对所述杀真菌剂的抗性，所述方法包括用任何(或一种)单核苷酸多态检测技术鉴定和定量真菌核酸中所述突变是否存在。
在该方面的再一优选实施方案中，本发明提供一种对于导致植物致病真菌对其靶蛋白由线粒体基因编码的杀真菌剂的抗性的突变频率的检测并定量的方法，所述方法包括检测真菌基因中突变是否存在，其中所述突变的存在导致真菌对于嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中任何其它化合物的抗性，所述方法包括用任何(或一种)单核苷酸多态检测技术鉴定和定量真菌核酸中所述突变是否存在。
在该方面的再一实施方案中，本发明提供一种对于导致植物致病真菌对其靶蛋白由线粒体基因编码的杀真菌剂的抗性的突变频率的检测并定量的方法，所述方法包括检测PCR反应期间产生的扩增子的存在，其中所述PCR反应包括在合适的核苷酸三磷酸和一种用于聚合的试剂存在下使包含真菌核酸的受试样品与合适的引物接触，其中所述扩增子的检测与所述核酸中是否存在所述突变直接相关，其中所述突变的存在导致对于其靶蛋白由线粒体基因编码的杀真菌剂的抗性；然后根据PCR期间产生的扩增子是否存在来检测所述突变的相对存在或不存在。
在该方面的一个优选实施方案中，本发明提供一种对于导致植物致病真菌对其靶蛋白由线粒体基因编码的杀真菌剂的抗性的突变频率的检测并定量的方法，所述方法包括在合适的核苷酸三磷酸和一种用于聚合的试剂存在下使包含真菌核酸的受试样品与检测所述核酸中存在和不存在特定突变的诊断性引物接触，所述突变的存在导致对于所述杀真菌剂的抗性，使得当在所述样品中存在所述合适的真菌模板时，与所述特定突变存在和不存在相关的所述诊断性引物得以延伸；然后根据诊断性引物延伸产物是否存在来检测所述突变的相对存在和不存在。
在该方面的再一优选实施方案中，本发明提供一种对于导致植物致病真菌对其靶蛋白由线粒体基因编码的杀真菌剂的抗性的突变频率的检测并定量的方法，所述方法包括在合适的核苷酸三磷酸和一种用于聚合的试剂存在下使包含真菌核酸的受试样品与检测所述核酸中存在和不存在特定突变的诊断性引物接触，所述突变的存在导致对于所述杀真菌剂的抗性，使得仅当在所述样品中存在所述合适的真菌模板时，与所述特定突变存在和不存在相关的所述诊断性引物得以延伸；然后根据诊断性引物延伸产物是否存在来检测所述突变的相对存在和不存在。
在上述方面和实施方案中描述的本发明方法，尤其适合用于其中细胞色素b基因中突变的存在导致杀真菌剂抗性的植物致病真菌菌株，最尤其适合用于其中所述突变导致对于嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的化合物的抗性的植物致病真菌菌株，最尤其是在所述真菌DNA中的所述突变导致在所编码蛋白中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的甘氨酸残基被取代的情况下，更尤其是在所述突变导致所编码蛋白中的G143A取代的情况下，尤其是在所述突变是在与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的密码子中第二位上G变为C的碱基改变。
在又一方面，本发明提供一种选择施用于作物的活性杀真菌剂及其最适施药水平的方法，所述方法包括分析能够感染所述作物的真菌样品，并且检测和/或定量测定来自所述真菌的基因中的突变的存在和/或不存在，其中所述突变的存在可以导致对于其靶蛋白由线粒体基因编码的杀真菌剂的抗性，然后选择活性杀真菌剂及其最适施药水平。
在本发明该方面的一个特别优选实施方案中，所述检测方法包括任何(或一种)单核苷酸多态检测技术，所述检测方法更优选包括在合适的核苷酸三磷酸和一种用于聚合的试剂存在下使包含真菌核酸的受试样品与所述特定突变的诊断性引物接触，使得当在所述样品中存在所述突变时，所述诊断性引物得以延伸；然后根据诊断性引物延伸产物是否存在来检测所述突变是否存在，并且通过在合适的核苷酸三磷酸和一种用于聚合的试剂存在下使包含真菌核酸的受试样品与检测所述核酸中存在和不存在特定突变的诊断性引物接触，所述突变的存在导致对于其靶蛋白由线粒体基因编码的杀真菌剂的抗性，使得当在所述样品中存在所述合适的真菌模板时，与所述特定突变存在和不存在相关的所述诊断性引物得以延伸；然后根据诊断性引物延伸产物是否存在来检测并定量所述突变的相对存在和不存在，来达到定量。
在本发明该方面的再一特别优选的实施方案中，所述检测方法包括在合适的核苷酸三磷酸和一种用于聚合的试剂存在下使包含真菌核酸的受试样品与所述特定突变的诊断性引物接触，使得仅当在所述样品中存在所述突变时，所述诊断性引物才得以延伸；然后根据诊断性引物延伸产物是否存在来检测所述突变是否存在，并且通过在合适的核苷酸三磷酸和一种用于聚合的试剂存在下使包含真菌核酸的受试样品与检测所述核酸中存在和不存在特定突变的诊断性引物接触，所述突变的存在导致对于其靶蛋白由线粒体基因编码的杀真菌剂的抗性，使得仅当在所述样品中存在所述合适的真菌模板时，与所述特定突变存在和不存在相关的所述诊断性引物才得以延伸；然后根据诊断性引物延伸产物是否存在来检测并定量所述突变的相对存在和不存在，来达到定量。
本文中描述的本发明方法尤其适合用于其中细胞色素b基因中突变的存在导致杀真菌剂抗性的植物致病真菌菌株，最尤其适合用于其中所述突变导致对于嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的化合物的抗性的植物致病真菌菌株，最尤其是在所述真菌DNA中的所述突变导致在所编码蛋白中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的甘氨酸残基被取代的情况下，更尤其是在所述突变导致所编码蛋白中的G143A取代的情况下，尤其是在所述突变是在与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的密码子中第二位上G变为C的碱基改变。
在又一方面，本发明提供一种防治作物真菌感染的方法，所述方法包括将一种杀真菌剂施用于所述作物，其中按照如上所述的本发明的任一选择方法选择所述杀真菌剂。
上述的本发明方法尤其适合用于其中细胞色素b基因中突变的存在导致杀真菌剂抗性的植物致病真菌菌株，最尤其适合用于其中所述突变导致对于嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的化合物的抗性的植物致病真菌菌株。
在再一方面，本发明提供用于检测杀真菌活性化合物的方法，所述方法包括针对已经按照本文描述的本发明方法测试了导致对于其靶蛋白由线粒体基因编码的杀真菌剂抗性的突变是否存在的真菌菌株，来筛选化合物；然后测定针对所述真菌菌株的杀真菌活性。
本文描述的本发明方法尤其适合用于其中细胞色素b基因中突变的存在导致杀真菌剂抗性的植物致病真菌菌株，最尤其适合用于其中所述突变导致对于嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的化合物的抗性的植物致病真菌菌株，最尤其是在所述真菌DNA中的所述突变导致在所编码蛋白中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的甘氨酸残基被取代的情况下，更尤其是在所述突变导致所编码蛋白中的G143A取代的情况下，尤其是在所述突变是在与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的密码子中第二位上G变为C的碱基改变。
通过应用本文所述的本发明方法，可以确定待施用于所述作物的杀真菌剂的合适施液量和/或合适的杀真菌剂组合。
本文所述的本发明方法特别适合于监测作物中真菌对于嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的化合物的抗性，所述作物例如谷类作物、水果和蔬菜，例如canola、向日葵、烟草、甜菜、棉花、大豆、玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、番茄、芒果、桃、苹果、梨、草莓、香蕉、甜瓜、马铃薯、胡萝卜、莴苣、卷心菜、洋葱、葡萄和草坪。
本文所述的本发明方法对于检测线粒体编码基因例如细胞色素b基因中低频率突变特别灵敏，使其成为一种特别有用商业上重要的筛选发生杀真菌剂抗性的植物致病真菌的途径，其中所述抗性是由于线粒体编码基因中的突变引起的。
图2a显示说明采用C特异性引物和Scorpion引物在野生型DNA背景中对葡萄生单轴霉突变型DNA连续稀释液进行PCR扩增(以双份进行)的图。如该图所示，代表50％C/G的菱形＝第1条线，代表100％G的菱形＝第7条线，代表10％C的圆形＝第2条线，代表1％C的圆形＝第3条线，代表0.1％C的圆形＝第4条线，代表0.01％C的圆形＝第5条线，而代表NTC的圆形＝第6条线。
图2b显示说明采用葡萄生单轴霉ARMS引物在野生型DNA背景中对突变型DNA的2种连续稀释液进行多重实验(以双份进行)的图。如该图所示，由菱形代表的线表示1∶100Gfam的结果，由三角形代表的线表示1∶500 Gfam的结果，由圆形代表的线表示1∶100Ctet的结果，而由方形代表的线表示1∶500Ctet的结果。
图3a显示说明采用所述三种引物对(特异性G/C和对照引物)扩增的禾白粉菌总DNA(以双份进行)的图。如该图所示，由菱形代表的线表示1/100标准的结果，由三角形代表的线表示1/100Gmix的结果，而由叉形符号代表的线表示1/100Cmix的结果。
图3b显示说明采用所述三种引物对扩增敏感型禾白粉菌分离物的图。如该图所示，由菱形代表的线表示Qmix，1/100的结果＝第1条线，由方形代表的线表示Qmix，1/1000的结果＝第2条线，由三角形代表的线表示Gmix，1/100的结果＝第3条线，由圆形代表的线表示Gmix，1/1000的结果＝第4条线，由叉形符号代表的线表示Cmix，1/100的结果＝第5条线，由菱形代表的线表示Cmix，1/1000的结果＝第6条线。
图4显示说明采用所述三种引物对扩增抗性禾白粉菌分离物的图。如该图所示，由菱形代表的线表示Qmix，1/100的结果＝第1条线，由方形代表的线表示Qmix，1/1000的结果＝第2条线，由三角形代表的线表示Gmix，1/100的结果＝第3条线，由菱形代表的线表示Gmix，1/1000的结果＝第4条线，由叉形符号代表的线表示Cmix，1/100的结果＝第5条线，由圆形代表的线表示Cmix，1/1000的结果＝第6条线。
图5a显示说明采用野生型特异性引物对扩增的野生型黑麦喙孢质粒连续稀释液的PCR扩增(以双份进行)的图。如该图所示，由菱形代表的线表示G质粒10^8的结果，由三角形代表的线表示G质粒10^6的结果，由方形代表的线表示G质粒10^4的结果，而由圆形代表的线表示G质粒10^2的结果。
图5b显示说明采用野生型特异性引物对扩增的最高浓度的野生型和突变型黑麦喙孢质粒的PCR扩增(以双份进行)的图。从该图可以观察到，由菱形代表的线表示G质粒10^8的结果，而由三角形代表的线表示c质粒10^8的结果。
图6a显示说明采用突变型特异性引物对扩增的突变型黑麦喙孢质粒连续稀释液的PCR扩增(以双份进行)的图。如该图所示，由菱形代表的线表示c质粒10^8的结果，由三角形代表的线表示c质粒10^6的结果，由方形代表的线表示c质粒10^4的结果，而由圆形代表的线表示c质粒10^2的结果。
图6b显示说明采用突变型特异性引物对扩增的最高浓度的野生型和突变型黑麦喙孢质粒的PCR扩增(以双份进行)的图。从该图可以观察到，由菱形代表的线表示G质粒10^8的结果，而由三角形代表的线表示c质粒10^8的结果。
图7a、7b和7c显示说明采用G引物对在三种稀释液中经PCR扩增黑麦喙孢DNA和cDNA模板(以双份进行)的图。从该图可以观察到，由菱形代表的线表示总DNA，而由三角形代表的线表示cDNA。
图8a、8b和8c显示说明采用C引物对在三种稀释液中经PCR扩增黑麦喙孢DNA和cDNA模板(以双份进行)的图。从该图可以观察到，由菱形代表的线表示总DNA，而由三角形代表的线表示cDNA。
图9a和9b显示说明采用所述三种引物对在两种稀释液中扩增圆核腔菌P13和P15分离株(以双份进行)的图。如该图所示，图9a代表S-mix的菱形＝第1条线，代表S-mix 1/10的三角形＝第2条线，代表G-mix的方形＝第3条线，代表G-mix 1/10的圆形＝第4条线，代表C-mix的圆形＝第5条线，代表C-mix 1/10的方形＝第6条线。在图9b中，代表s-mix的菱形＝第1条线，代表s-mix，1/10的三角形＝第2条线，代表g-mix的方形＝第3条线，代表g-mix，1/10的圆形＝第4条线，代表c-mix的圆形＝第5条线，代表c-mix，1/10的方形＝第6条线。
在下述实施例中设计的Scorpion引物具有以下共同的修饰●六甘醇(HEG)单体，作为阻断部分，位于所述引物的模板结合区和所述尾区之间，该部分防止聚合酶介导的所述引物模板尾区的链拷贝。●将一种FAM荧光分子加入所述引物的5’端。FAM是一种荧光分子，它可以例如容易地被ABI PRISM 7700仪器(PE Biosystems)的488nm激光检测。●MR是连接于尿嘧啶残基的非荧光淬灭剂其它荧光分子和淬灭机制也可以适用于Scorpion引物设计，也将适用于本发明。
在实施例4中，也将嵌入染料用作一种检测机制。所述18个实施例结合在一起，描述了来自一组重要的野生型真菌分离物的部分细胞色素b基因序列的鉴定，而实施例1、2和6也描述了来自抗嗜球果伞素类似物和同一交叉抗性组中其它化合物的真菌分离物的部分细胞色素b基因序列的鉴定。所述方法特别适用于嗜球果伞素类似物azoxystrobin和picoxystrobin。
葡萄生单轴霉的野生型ES2B嗜球果伞素类似物敏感型分离株于1996年收集于西班牙。这种分离株尚未暴露于嗜球果伞素类似物选择。人工挑出受感染的葡萄叶，将其储藏在聚乙烯袋中，并送至Jealotts’s Hill Research Station(Zeneca Agrochemicals)。到达时，将叶片成对放置在塑料盒中的潮湿吸收纸上，并且将背轴孢子形成面放在一起，在21-24℃培育24-48小时。从叶片上切下单个病斑，将孢子囊悬浮于5ml去离子水中，然后喷洒到5-6周龄葡萄幼苗(Ohanez变种(var.Ohanez))的背轴面上。将新接种的植株在湿润室(humidity chamber)(周围温度，相对湿度100％)中培育24小时，然后移至生长室(昼24℃/r.h.60％；夜18℃/r.h.95％；日长16小时；6,000 lux)。6天后将植株移回湿润室再达24小时，此后成功的感染表现为背轴叶面上的孢子形成病斑。如上所述进行进一步的传代培养，将孢子囊悬浮液调至5,000-10,000孢子囊/ml。
用基于大雄疫霉，(Phytophthora megasperma)和构巢曲霉(Aspergillus nidulans)细胞色素b基因保守区的引物(Cytb12F(5’TGAACATATTATGAGAGATGT3’)(SEQ ID NO 106)和Cyt10R(5’AATTGCATAAAAAGGTAAAAA3’)(SEQ ID NO 107)，它们描绘了基于酿酒酵母编号系统的编码真菌细胞色素b的氨基酸区66和281的序列的轮廓)，扩增编码野生型葡萄生单轴霉细胞色素b序列中一个相当大部分的DNA片段。用苯酚/氯仿提取方案，从嗜球果伞素类似物敏感型分离株中提取DNA。在30ml重蒸水(ddH2O)中洗涤来自病害覆盖90-100％的6个叶片(来源于人工接种的6周龄葡萄幼苗)的孢子囊。将孢子囊悬浮液通过Miracloth(Calbiochem产品目录号475855)过滤，然后于4℃以3600rpm离心10分钟。然后将孢子囊在液氮中冷冻，用已经预先清洗并通过酸洗涤和高压灭菌灭菌的研棒和研钵研磨成细粉。加入0.5ml裂解缓冲液(200mM Tris-HCl(pH 8.5)、250mMNaCl、25mM EDTA和0.5％SDS)，并将悬浮液转移至1.5ml无菌螺口Eppendorf管中。立即加入0.5ml苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)混合物，然后通过倒转数次进行混合。将所述管以14000rpm离心30分钟，然后将水相转移至新的Eppendorf管中。然后重复苯酚/氯仿/异戊醇提取，但这次将所述管以14000rpm仅离心15分钟。在将水相转移至新的Eppendorf管中后，进行最后一次氯仿提取。然后通过加入0.1体积的3M乙酸钠(pH 5.5)和0.6体积的异丙醇，沉淀真菌DNA。在倒转数次之后，将所述管于4℃以14000rpm离心20分钟。然后用70％乙醇将DNA沉淀洗涤2次，真空干燥，并重悬于50μl ddH2O中。通过凝胶电泳检查DNA产量和质量，在重蒸水中制备连续稀释液(1∶10、1∶100和1∶1000)用作随后PCR中的模板材料。按照Taq聚合酶(Gibco)的生产商的建议，建立PCR，最终反应体积为100ul。将所述引物加入反应中，至终浓度为1pmole/μl。将每种DNA稀释液10μl加入合适的PCR中。进行标准程序，以限制PCR污染的危险。在Hybaid Omn-EPCR仪器上进行30个循环，每个循环为94℃45秒、42℃45秒和72℃1分钟30秒。也进行一个94℃3分钟的最初步骤以及一个72℃10分钟的最后延伸。然后通过凝胶电泳分析18μl反应混合物，评估PCR的效率。然后将2μl所述约500bp PCR产物的样品克隆到TAPCR克隆pCR2.1载体(Invitrogen产品目录号K4500-01)中，并且按照生产商的建议转化到大肠杆菌(Escherichia coli)细胞(TOP10 OneShotTM感受态细胞)中。通过按照生产商的说明进行Wizard minipreps(Promega产品目录号A7100)以及用EcoRI分析限制消化物，检查一系列所得克隆是否存在插入片段。然后用M13正向引物和反向引物对具有合适插入片段(约500bp)的6个克隆测序(ABI377XL自动测序仪)。当用相关生物信息软件(Seqman，Editseq and Macaw)分析来自这些研究的核苷酸序列数据时，发现所得的新序列编码一种与其它已知卵菌例如大雄疫霉细胞色素b序列具有密切同源性的新的细胞色素b基因。在表3中可以找到编码G143密码子(按照酿酒酵母氨基酸编号系统)中第二位碱基上游30bp和下游30bp的所得葡萄生单轴霉61个核苷酸序列段的序列。
基于上述分析的用于随后扩增目的细胞色素b区的葡萄生单轴霉特异性引物是PLAS17F(5’AAATAACGGTTGGTTAATTCG3’)(SEQID NO 108)和PLAS15R(5’TCTTAAAATTGCATAAAAAGG3’(SEQID NO 109)，所述引物描绘了依照酿酒酵母编号系统的真菌细胞色素b的氨基酸区73-283的轮廓。
在一个试验部位鉴定出一个葡萄生单轴霉嗜球果伞素类似物抗性分离株。收集受感染的葡萄叶片，并且基本上如上所述进行加工，但是将样品传代培养为大型群体(mass population)，并且在测试之前没有以单个病斑进行分离。证实嗜球果伞素类似物抗性的测试方法是在4周龄葡萄幼苗上进行24小时预防性喷洒。通过将5mg嗜球果伞素类似物(本文所有实施例中所用的嗜球果伞素类似物指的是azoxystrobin)(技术材料，纯度97％)溶于1ml丙酮中，并且于室温下在去离子水中进行进一步的稀释，得到10ppm喷洒率(已知产生100％防治嗜球果伞素类似物敏感型基线分离株的剂量)，制备化学稀释系列。用DeVilbiss喷枪以10psi喷洒靶叶片的背轴面至最大保留。对照植物仅用去离子水喷洒。让经处理的植株在生长室(条件如上所述)中干燥过夜。以5,000孢子囊/ml进行葡萄生单轴霉受试样品的接种，然后如先前所述培育新接种的植株。接种后7天，分离出在经处理的叶片上的任何潜在抗性生长物，将其传代培养，以提供足够的材料用于PCR分析。该分离株命名为T5。
用PLAS17F和PLAS15R引物从所述抗性分离株(T5)中扩增部分细胞色素b基因序列。用上述苯酚/氯仿提取方案，从该分离株中提取总基因组DNA(核DNA和线粒体DNA)。再次通过凝胶电泳检查DNA的存在和质量，在重蒸水中以1∶10和1∶100稀释合适的等分样品用于PCR研究。然后将10μl每种DNA稀释液加入Ready.To.GoTMTaq聚合酶PCR微珠(Amersham Pharmacia Biotech产品号27-9555-01)中，用PLAS17F和PLAS15R引物溶液制成25μl，每种至引物终浓度1pmole/μl。进行标准程序，以限制PCR污染的危险。然后在HybaidOmn-E PCR仪器上进行30个循环的PCR，每个循环为94℃45秒、52℃45秒和72℃1分钟30秒。也包括一个最初步骤-94℃3分钟以及最后的延伸步骤-72℃10分钟。这些PCR以双份进行。在0.8％TBE琼脂糖凝胶上通过凝胶电泳分析10μl所述PCR后，在克隆之前合并所得的约500bp PCR产物。然后将1μl所述合并的PCR产物样品克隆到TA克隆pCR2.1载体(Invitrogen)中，并且按照生产商的建议转化到大肠杆菌细胞(TOP10 One ShotTM感受态细胞)中。通过进行Wizard minipreps(按照Promega的说明)以及用EcoRI分析限制消化物，检查一系列所得克隆是否存在插入片段。然后用M13正向引物和反向引物对具有正确大小插入片段(约500bp)的10个克隆测序(ABI377XL自动测序仪)。
在所有10种情况下用合适的生物信息软件(Seqman，Editseq andMacaw软件)分析所述序列数据，当与野生型序列比较时，揭示出所述细胞色素b序列中一个G--＞C的点突变。这种DNA点突变导致在位置143(按照酿酒酵母氨基酸编码系统)上一个甘氨酸变为丙氨酸。
设计不同的特异性ARMS葡萄生单轴霉引物，以检测这种G143A点突变是否存在基于野生型序列的两种正向ARMS引物G-sp-f-1CCTTGGTGACAAATGAGTTTTTGTGG(SEQ ID NO 110)G-sp-f-2CCTTGGTGACAAATGAGTTTTTGGAG(SEQ ID NO 111)基于G143A突变的两种正向ARMS引物C-sp-f-1CCTTGGTGACAAATGAGTTTTTGGCC(SEQ ID NO 112)C-sp-f-2CCTTGGTGACAAATGAGTTTTTGGAC(SEQ ID NO 113)和设计位于所述点突变上游的对照引物STANDGCCTTGGGGACAAATGAGTTTTTG(SEQ ID NO 114)在所有上述ARMS引物中，-1碱基(所述引物序列的3’端碱基)对应于所述靶点突变位点。以粗体显示的碱基不同于野生型葡萄生单轴霉细胞色素b序列的碱基。在所有所述ARMS引物(不是对照引物)中，-20碱基从G碱基变为T碱基。进行这种改变是为了破坏G碱基的掺入(run)。在G-sp-f-2和C-sp-f-2引物中，-2位从G碱基变为A碱基。在G-sp-f-1中，-3位从G碱基变为T碱基。在C-sp-f-1引物中，所述-2引物从G碱基变为C碱基。进行这些序列改变，以将所述引物去稳定，并且使得任何引物延伸对于相应模板更具特异性。所述文献中的实施例已经表明，将ARMS引物去稳定，降低了引物在错误模板上错误起始(mispriming)的危险(Newton等，Nucleic Acid Research 17(7)2503-2516 1989)。
ScorpionTM产物检测系统在这种情况下用作检测机制，将该检测系统掺到反向引物上。所产生的扩增子用所述ARMS引物时长234bp，用对照引物时长235bp。用Oligo 5和MFold程序(MFold用Zucker的能量最低化方法(Zucker，M.(1989)Science 244，48-52；SantaLucia，J.Jr(1998).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，1460-1465)预测RNA或DNA分子的最适和亚适二级结构)设计Scorpion引物。葡萄生单轴霉Scorpion引物的序列是5’FAM-CCCGCCGTAATTGTAGGGGCTGTACTAATACGGCGGG(SEQ ID NO 115)MR-HEG-GATACCTAATGGATTATTTGAACCTACCT3’(SEQ ID NO 116)下划线的区域是发夹形成部分，FAM是荧光素染料，MR是连接于尿嘧啶残基的非荧光淬灭剂，HEG是阻断复制的六甘醇单体。斜体表示的序列是反向引物序列，而粗体表示的序列是与所述反向引物的延伸产物结合的Scorpion序列。
用MFold程序可以显现该Scorpion引物的茎环二级结构(参见


图1)。预测在其惰性形式中具有的能量为-2.2 kcal/mol。然而，在延伸产物存在时，所述发夹结构被分离，因为Scorpion引物的探针序列与延伸产物结合，预测能量为-6.1 kcal/mol。这将FAM染料与其淬灭剂分离，引起例如用ABI Prism 7700仪器可检测到荧光发射。因此，与Scorpion惰性状态中的茎环构型相比，在能量学上有利于Scorpion元件退火到新合成的链上。
所有引物均由Oswel DNA Service(Lab 5005，Medical andBiological Sciences Building，Southampton)合成。在使用之前，将每种所述引物分别在总体积为500μl的重蒸水中稀释至5μM。然后在PCR中将引物进一步稀释至500nM的终浓度。
在所有情况下，在反应混合物中都包括1单位/25ul反应物的AmpliTaq Gold酶(Perkin-Elmer/ABI)。反应混合物也含有1×缓冲液(10mM Tris-HCl(pH 8.3)、50mM KCl、3.5mM MgCl2、0.01％明胶)和100μM dNTP。扩增在ABI Prism 7700仪器中进行，以进行连续的荧光监测。在95℃10分钟的一个最初循环之后，进行50个循环95℃15秒和60℃45秒。在所有循环的退火/延伸阶段监测荧光。
首先通过用各种不同浓度的质粒DNA作为模板，验证引物以用于这类分析中。进行这种验证是为了检查所述引物设计的特异性和灵敏度。将部分野生型细胞色素b基因序列和相应的含G143A突变的序列段克隆到TA pCR2.1载体(Invitrogen)中用于这一验证方法中。与C-sp-f-1和G-sp-1引物相比，优选C-sp-f-2和G-sp-f-2引物，因为重复PCR得到更为一致的结果，并且特异性略强。在所有情况下，将质粒DNA在1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)中稀释。
图2a中所示的图描绘了用ARMS C-sp-f-2引物扩增野生型模板背景中的突变型质粒稀释液的PCR。由于C质粒稀释度在野生型质粒背景中降低，因此延迟了荧光检测。在所有情况下，在所述PCR中的质粒终浓度为1×107分子/μl。用C质粒的每种10倍稀释液，在荧光检测中延迟3-4个循环。当C质粒在野生型质粒背景中以10000拷贝中仅存在1个拷贝时，仍可用所述特异性ARMS引物检测到。C-sp-f-2引物整体来讲对其相应的模板具有特异性，因为在该实验中在100％野生型质粒样品中不能检测到荧光。
研究了可以作为原材料用于使用这种Scorpion技术的抗性监测测定的不同可能的材料。在该研究中使用三种不同的分离株。对于每种这些分离物，既直接从田间病变葡萄叶片收集孢子囊，也直接从人工接种的室温生长的叶片(如前所述)收集孢子囊。在这两种情况下，都用重蒸水从叶片上洗下孢子囊。然后通过离心收集孢子囊，并保持于-80℃待用。然后将孢子囊样品重悬于1ml重蒸水中，并且再次在重蒸水中以1∶10和1∶100稀释。如上所述进行实时PCR测定，只是也在每个PCR中加入牛血清白蛋白(0.25μg/μl)，并且用5μl每种稀释液作为模板。每种稀释以双份进行，分别与共用Scorpion反向引物一起加入C-sp-f-2、G-sp-f-2和对照正向引物。用从温室生长的葡萄叶收集的孢子囊作为原材料得到良好的结果，给出一致的循环阈值(Ct)。用直接从田间葡萄叶收集的孢子囊得到的结果差，因此按照以下两种方法，以改进数据的质量以减少PCR中的抑制作用(与温室生长的叶片相比，田间材料将含有许多更可能的污染物)，以及使所述DNA更可用于扩增。
为了减小抑制组分对PCR的影响，提高加入反应物中的BSA浓度，并且将去垢剂Tween-20加入PCR中。为了使所述DNA更可用于扩增，进行一个最初的PCR，用得自该反应的PCR产物作为实时PCR中的模板，孢子稀释液在加入实时PCR之前煮沸10分钟，以改进细胞裂解，并且用3种不同的方案(得自Genosys Biotechnologies Inc.的DNA Isolator、得自Helena Biosciences的DNAzol和Qiagen DNeasyplant mini试剂盒)，从孢子中提取DNA。用以1∶10、1∶100和1∶1000在重蒸水中稀释的孢子囊或DNA作为模板，依次试验每种方法。用C-sp-f-2和G-sp-f-2ARMS引物和对照引物，并且都用反向Scorpion共用引物，对每种稀释液以三份重复测试。将5μl每种模板加入PCR测定中，条件基本上如前所述，但加入0.25μg/μlBSA(当所述BSA浓度不是变量时)。用或者DNAzol或者Qiagen DNA preps提取的DNA得到良好一致的结果。
估计从田间试验收集的葡萄生单轴霉分离株(指定为17A)中G143和A143等位基因频率。将来自120片叶片的孢子囊收集到重蒸水中，并且通过离心收获。该样品含有约2400个病斑和6.4×107个孢子囊。将12×106个孢子囊保存在-80℃下，以待用于DNA提取。用DNeasyPlant Minikit(Qiagen产品目录号69103)进行基因组DNA提取，将所得的DNA以1∶10和1∶100在重蒸水中稀释，以用作实时PCR分析的模板。PCR条件如上所述。所产生的循环阈值(Ct)对于G特异性引物为20，对于C特异性引物为34，产生14个循环的Ct差异，因此抗性等位基因的频率约为1/10,000。
也已经评估了多重化(multiplex)方法。在这种情况下，将所述Scorpion检测元件掺入到ARMS引物上，以使得能够在同一PCR中进行多重G143和A143等位基因PCR扩增。Scorpion/ARMS引物序列如下G143等位基因特异性引物5’FAMCCCGCCCTGGGATAGCCGAGAATAAATGGGCGGG(SEQ ID NO 1)MR-HEG CCTTGGTGACAAATGAGTTTTTGGAG(3’SEQ ID NO 118)A143等位基因特异性引物5’TETCCCGCCCTGGGATAGCCGAGAATAAATGGGCGGG(SEQ ID NO 119)MR-HEG CCTTGGTGACAAATGAGTTTTTGAGC3’(SEQ ID NO 120)所述Scorpion检测元件细节如上所述。A143等位基因特异性引物用TET标记，以允许在所述两种扩增子之间进行区别。使用一种共用反向(未标记的)引物反向5’CATAACCAGTCAACAACTTCTTTTCC3’(SEQ ID NO 121)在这两种情况下产生的扩增子长95bp。再次用Oligo5和MFold程序设计Scorpion引物(如上所述)。其它实时PCR组分如上所述，只是在该多重化方法的验证期间引物浓度改变。通过降低G FAM Scorpion的终浓度至100nM，并且将C TET Scorpion和反向引物的终浓度维持在500nM，有可能用质粒DNA作为模板，可靠地检测至少1∶500 C∶G的比率(参见图2b)。
禾白粉菌小麦致病变种和大麦致病变种(小麦和大麦白粉病的病原体)的分离株收集于法国北部、德国、爱尔兰和英国。这种收集可以通过两种方法之一完成人工收集田间叶片或通过固定在车上的喷射孢子收集器(Burkard Manufacturing Co.Ltd.，Rickmansworth，UK)人工收集空气孢子样品。
从在多个试验中小麦群体已经暴露于嗜球果伞素类似物的地点收集感染孢子形成白粉的小麦叶片。在送回实验室时，将叶片放入聚乙烯袋中并且于21℃培育过夜。第二天孢子重新形成孢子堆(pustule)。通过在置于含1.2％水琼脂(water agar)的9cm培养皿中滤纸(Whatman No.1)上的新鲜叶段(小麦Rapier栽培品种(cv Rapier)，9日龄)上轻敲受感染的叶片，将所有孢子堆进行传代培养。将新接种的平板培育7天，然后测试所得菌落对嗜球果伞素类似物的敏感性。
关于孢子收集，从9日龄植株(Rapier栽培品种)上切下小麦叶片，置于塑料平皿中的1.8％水琼脂上，维持在5℃下待用。将喷射孢子收集器安装在汽车顶上，将汽车以高达90km/hr的速度沿每个国家中预定路线行驶。含有叶段塑料平皿置于孢子收集柱基部，以允许进入收集器的空气传播的孢子沉降到叶片上。约每80km更换平皿。一旦一批叶段已经用于孢子收集器中后，立即将其转移至含60ml 1.8％水琼脂和滤纸的方形培养皿(10cm2)中，并储存于5℃。
返回Jealott’s Hill时，将暴露于孢子收集器的叶片在恒温室(日长16小时，光照4-5,000lux，温度21℃，周围相对湿度)中培育。在孢子收集器中暴露后5-6天时，可以观察到形成禾白粉菌孢子堆(叶片材料多个小区黄化，然后出现粉状孢子形成斑)。将这些孢子堆或者在9cm培养皿中的叶段上传代培养为“群体”(每个取样阶段一个群体)，或者作为单一孢子堆分离物切下，然后分别在5cm培养皿中的15ml覆盖有滤纸的1.2％水琼脂上分别培育。将接种禾白粉菌群体的叶段培育7天，此后孢子形成足以用于接种表型抗性分析物。将单一孢子分离物培育7天，但再将其传代培养一次，以提供足够的材料用于测试。如果孢子形成差，则重复上述步骤，直至在所有叶段上获得良好(60-70％)孢子形成病害覆盖度，以产生足够的分生孢子用于测定。
在接种之间，用5ppm(已知产生100％防治嗜球果伞素敏感性基线分离株的喷洒率)嗜球果伞素类似物和Tween 20润湿剂的水溶液处理24小时的摘下的小麦幼苗叶片上，进行抗性分离物的测试和随后的维持。将分离物或者作为大群体(mass population)或者作为或单一孢子堆分离物进行测试。将分生孢子干接种到经处理的叶段上。受感染的材料在受控环境(如上所述)中培育7天，然后进行评价。
用5ppm嗜球果伞素类似物处理的叶段上任何生长物均被认为是具有潜在抗性。来自这些病斑的材料进一步在嗜球果伞素类似物处理的叶片上传代培养，以证实在植物中的抗性，并且用本申请中描述的分子测定进行分析。通过大群体筛选可以检测到约1/100或更高的表型抗性频率，通过将经处理叶片上生长物与对照(抗性)相当的单一孢子分离物与其中经处理叶片产生100％病害防治(敏感型)的平板进行比较，估计更精确的频率。
用基于黑曲霉(Aspergillus niger)和粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)细胞色素b基因保守区的引物(Cytb3F(5’CAGCTTCAGCTTTCTTCT3’)(SEQ ID NO 122)和(Cytb9R(5’ACTTAAAGGTCTAAATTG3’)(SEQ ID NO 122)，所述引物描绘了编码基于酿酒酵母编号系统的真菌细胞色素b氨基酸区86-322的序列的轮廓)，扩增部分禾白粉菌小麦致病变种细胞色素b基因序列。通过直接从具有孢子形成病害的叶片上轻敲，将来自尚未暴露于嗜球果伞素类似物选择的嗜球果伞素类似物敏感型分离物的约500mg分生孢子收集到1.5ml Eppendorf管中。用苯酚/氯仿提取方案(参见上文)从该分生孢子样品中提取DNA。通过凝胶电泳分析DNA的存在和质量，在重蒸水中制备连续稀释液(1∶10、1∶100和1∶1000)，用作PCR中的模板材料。按照Taq聚合酶(Gibco)的生产商的建议，建立PCR，最终反应体积为100μl，然后将引物加入反应中，至终浓度为1pmole/μl。将每种DNA稀释液10μl加入合适的PCR中。进行严格的程序，以限制PCR污染的危险。在Hybaid Omn-E仪器上进行30个循环，每个循环为94℃45秒、42℃45秒和72℃1分钟30秒。也进行一个94℃3分钟的最初保温以及一个72℃10分钟的最后延伸。然后通过凝胶电泳分析18μl反应混合物，评估PCR的效率。将2μl约500bp PCR产物的样品克隆到TA PCR克隆pCR2.1载体(Invitrogen)中，并且按照生产商的建议转化到大肠杆菌细胞(TOP 10 One ShotTM感受态细胞)中。通过进行Wizard minipreps(按照Promega的说明)以及用EcoRI分析限制消化物，检查一系列所得克隆是否存在插入片段。然后用M13正向引物和反向引物对具有预期插入片段大小(约500bp)的6个克隆测序(ABI377XL自动测序仪)。当用相关生物信息软件分析来自这些研究的核苷酸序列数据时，发现所得的新序列编码一种与其它已知子囊菌细胞色素b序列具有密切同源性的新的细胞色素b基因。在表3中可以找到编码G143密码子(按照酿酒酵母氨基酸编号系统)中第二位碱基上游30个碱基和下游30个碱基的61个核苷酸的序列段。
将基于所述新序列设计的禾白粉菌特异性引物用于随后的细胞色素b目的区域的扩增中。这些引物是ERY11F(5’ATGAACAATTGGTACAGTAAT3’)(SEQ ID NO 124)和ERY12R(5’GTTAGGTATAGATCTTAATAT3’)(SEQ ID NO 125)。它们结合在一起描述了依照酿酒酵母编码系统的真菌细胞色素b的氨基酸区114-287的编码序列的轮廓。
用ERY11F和ERY12R引物从禾白粉菌小麦致病变种嗜球果伞素类似物抗性群体中，扩增部分细胞色素b序列。将分生孢子(约200mg)悬浮于200μl重蒸水中，并且在重蒸水中以1∶10、1∶100和1∶1000稀释。将10μl每种分生孢子稀释液加入Ready.To.GoTMTaq聚合酶PCR微珠(Amersham Pharmacia Biotech产品号27-9555-01)中，用ERY11F和ERY12R引物溶液制成25μl，使得引物终浓度为1pmole/μl。进行标准程序，以限制PCR污染的危险。在Hybaid Omn-E仪器上进行30个循环，每个循环为94℃45秒、52℃45秒和72℃1分钟30秒。也包括一个94℃3分钟的最初步骤以及一个72℃10分钟的最后延伸。在这种情况下所有PCR均以三份重复进行。在在0.8％TBE琼脂糖凝胶上通过凝胶电泳分析10μl所述PCR后，在克隆之前合并所得的约500bp PCR产物。然后将2μl所述合并的PCR产物样品克隆到TA Invitrogen PCR克隆pCR2.1载体中，并且按照生产商的建议转化到大肠杆菌细胞(TOP10 One ShotTM感受态细胞)中。通过进行Wizardminipreps(按照Promega的说明)以及用EcoRI分析限制消化物，检查一系列克隆的插入片段。然后用M13正向引物和反向引物对具有预期大小(约500bp)插入片段的10个克隆测序(ABI377XL自动测序仪)。用合适的生物信息软件产生的对所述序列数据的分析，当与先前获得的野生型禾白粉菌小麦致病变种细胞色素b基因序列比较时，揭示出在所有10个分离株中在所述细胞色素b基因序列中的一个G--＞C点突变。该DNA点突变导致在第143位(按照酿酒酵母编码号系统)上甘氨酸变为丙氨酸。
也从两种禾白粉菌大麦致病变种分离物中鉴定出部分细胞色素b基因序列。从受感染的大麦叶片(按先前关于小麦所述方法进行制备)上将分生孢子小样品(约100mg)轻敲到无菌Eppendorf管中。将这些分生孢子样品保持在-80℃下待用。然后将每种样品重悬于200μl重蒸水中，并且以1∶10和1∶100进一步稀释，将10μl每种稀释液用作扩增的模板。用ERY11F和ERY12R引物扩增部分细胞色素b基因序列。PCR条件和组分如前所述。在凝胶电泳分析时，发现一种预期大小(约500bp)的PCR产物。将该产物克隆到TA pCR2.1载体中，并且如前所述进行测序。在序列分析时，发现除G143密码子第二位碱基下游379bp的1bp(T变为A)外，从禾白粉菌大麦致病变种扩增的细胞色素b序列与从禾白粉菌小麦致病变种中扩增的所述序列相同。这种碱基改变将不导致最终蛋白质中的氨基酸改变(即沉默突变)。
用上述方案研究了31种不同的禾白粉菌分离物，在所有情况下，发现所述序列与引起禾白粉菌小麦致病变种中抗嗜球果伞素类似物抗性的G143A突变是一致的。在禾白粉菌大麦致病变种样品中没有检测到A143抗性等位基因。
根据关于G143A点突变的上述信息，设计了特异性ARMS禾白粉菌引物基于野生型序列的正向ARMS引物G-sp-1CCATACGGGCAGATGAGCCACTGGAG(SEQ ID NO 126)基于G143A突变的正向ARMS引物C-sp-1CCATACGGGCAGATGAGCCACTGGAC(SEQ ID NO 127)和设计位于所述点突变上游的对照引物STAND2GCCATACGGGCAGATGAGCCACTG(SEQ ID NO 128)在G-sp-1和C-sp-1引物的情况下，-1碱基(3’端碱基)都对应于G143/A143密码子的第二位核苷酸。所述引物中不同于野生型细胞色素b禾白粉菌序列的碱基以粗体表示。-2位从G碱基变为A碱基。进行这种改变是为了将所述引物去稳定，正如在ARMS反应中所常见的。
ScorpionTM产物检测系统在这种情况下用作检测机制。再次用Oligo5和MFold程序(参见实施例1中的细节)设计Scorpion引物。禾白粉菌Scorpion引物的序列是5’FAM-CCCGCGTTTTAGCTGCTTTAGCTTTAATGCGGCGGG(SEQ ID NO 129)MR-HEG-AACACCTAAAGGATTACCAGATCCTGCAC3’(SEQ ID NO 130)下划线的区域是发夹形成部分，FAM是荧光素染料，MR是连接于尿嘧啶残基的非荧光淬灭剂，而HEG是阻断复制的六甘醇单体。斜体表示的序列是反向引物序列，而粗体表示的序列是退火于所述反向引物的延伸产物的Scorpion序列。
所有引物均由Oswel DNA service合成。在使用之前，将所述引物分别在500μl总体积中稀释至5μM。然后在PCR中将引物进一步稀释至500nM的终浓度。
首先通过用质粒DNA和总DNA作为模板，验证引物可用于ARMS/Scorpion分析中。进行这种验证是为了检查所述引物设计的特异性和灵敏度。将包含部分野生型细胞色素b基因序列的DNA片段和含G143A突变的相应序列克隆到TApCR2.1载体中，以用于这一验证方法中。质粒DNA总是在1mg/ml BSA中稀释，然后用作实时PCR测定中的模板。用苯酚/氯仿提取法，从禾白粉菌小麦致病变种嗜球果伞素类似物敏感型对照分离物中提取用于分析的真菌DNA(如前所述)。然后，用经验证的引物，在两个分生孢子稀释度下，测试来自法国嗜球果伞素类似物敏感型分离株(F12C)的禾白粉菌小麦致病变种分生孢子样品和来自德国嗜球果伞素类似物抗性分离株(11-8)的禾白粉菌小麦致病变种分生孢子样品。所有三种真菌分离株均来源于单一孢子堆。
在所有情况下，在反应混合物中都包括1单位/25μl反应物的AmpliTaq Gold酶(Perkin-Elmer/ABI)。反应混合物也含有1×缓冲液(10mM Tris-HCl(pH 8.3)、50mM KCl、3.5mM MgCl2、0.01％明胶)、100μM dNTP。扩增在ABI Prism 7700仪器中进行，以进行连续的荧光监测。在一个95℃10分钟的最初保温之后，进行50个循环95℃15秒和60℃45秒。在所有循环的退火/延伸阶段监测荧光。
当针对对照模板(质粒和来自嗜球果伞素类似物敏感型对照分离株的DNA)测试时，禾白粉菌ARMS/Scorpion引物表现出良好的特异性，并且无证据显示从错误的模板发生错误起始。在图3a中，显示了用所述三种引物的混合物(第二链+禾白粉菌Scorpio、G-sp-1+禾白粉菌Scorpio以及C-sp-1+禾白粉菌Scorpio)对1∶100稀释度的嗜球果伞素类似物敏感型对照禾白粉菌DNA的扩增。每种反应均以双份进行。对照引物反应和G特异性引物反应发出强荧光信号，而C特异性引物反应没有显示出任何荧光的增加。对照ARMS引物和G特异性ARMS引物已被识别出，并且结合于所述模板，而C特异性引物不与反应中存在的模板结合。在这种情况下，G143A143等位基因分析表明仅存在野生型等位基因。
图3b描述了其中用所述三种引物的混合物(第二链+禾白粉菌Scorpion、G-sp-1+禾白粉菌Scorpion以及C-sp-1+禾白粉菌Scorpion)分析法国敏感型分离株(F12C)的PCR。在每种情况下，都将约200mg分生孢子悬浮于200μl重蒸水中，并且在重蒸水中以1∶100和1∶1000稀释。将5μl所述稀释液加入到合适的PCR中。在再次分析时，对照引物反应和G特异性引物反应发出强信号，而C特异性引物反应没有显示出任何荧光的增加。这表明在该样品中仅检测出野生型等位基因。与使用质粒DNA作为模板相比，当用分生孢子作为反应模板时，产生确定的荧光延迟。这或者是因为在所述反应中存在的可以用作模板的分子拷贝减少，或者由于在分生孢子样品中存在抑制性组分。
图4描述了其中用所述三种引物的混合物(第二链+禾白粉菌Scorpio、G-sp-1+禾白粉菌Scorpio以及C-sp-1+禾白粉菌Scorpio)扩增分生孢子两种稀释度的德国抗性分离株的PCR。在这种情况下，对照引物反应和C特异性引物反应发出强信号，而G特异性引物反应没有表现出任何荧光。这表明在该样品中仅检测出突变型G143A等位基因。
野生型黑麦喙孢分离株收集于英国和法国(参见表8黑麦喙孢分离株详细资料)。K1124和K3327分离株可以被认为是“基线”(在田间施用嗜球果伞素类似物之前收集的)，而其它分离株得自在多个季节内已经暴露于数次喷洒嗜球果伞素类似物的试验地点。人工挑出受感染的大麦叶片，储存在聚乙烯袋中并送至Jealott’s Hill Research Station(Zeneca Agrochemicals)。到达实验室时，从叶片切下单个病斑，在乙醇中进行表面消毒(30秒)，接着在0.1％次氯酸钠溶液中洗涤(2分钟)，然后置于Lima Bean琼脂(参见表9)上，在交替12小时黑光(365nmPhilips TLD 18W/08-Philips Lighting Ltd，Croydon，UK)/12小时无光周期、19℃恒温下培育4-5天。在病斑上生长出的菌落作为未计数的孢子悬浮液，在Lima Bean琼脂上传代培养，并如上所述培育约7天，直至达到孢子形成。取出所得孢子，将其贮存于液氮中，直至需要分离株。通过将孢子悬浮液平板接种到Lima Bean琼脂上，并且如上所述培育约7天直至达到孢子形成，达到分离株的回收。
表8黑麦喙孢分离株的详细资料从两个黑麦喙孢分离株(K1124和K3327)中获得部分细胞色素b基因序列。这些分离株是由接种到无可发酵碳源的培养基中的100,000孢子/ml悬浮液以19℃、85rpm振荡培养21天(12小时光照/12小时黑暗)而生长出来的，经Miracloth过滤收集菌丝体，并于-20℃冷冻待用。通过用苯酚/氯仿提取方案(参见实施例1)，从菌丝体制备DNA。通过凝胶电泳检查DNA产量和质量，然后制备连续储备液稀释液(在重蒸水中1∶10、1∶100和1∶1000)用作PCR扩增中的模板。按照先前的实施例中所述建立PCR。所用的引物或者是根据真菌细胞色素b基因的同源区(描绘了编码根据酿酒酵母编码系统的氨基酸区100-294的序列)设计的简并引物(deg4F(5’AGGTYTRTAYTRYGGDTCWTA3’)(SEQ ID NO 131)和deg3R(5’AGCDATAACWCCTAATAATTT3’)(SEQ ID NO 132)，或者是禾白粉菌特异性引物ERY11F和ERY12R(如实施例2中详细描述的)。然后用两种引物对，从每个分离株扩增一条预期大小(约500bp)的带，将每种PCR产物克隆到pCR2.1 TA载体(Invitrogen)中。进行Wizard minipreps以鉴定具有预期大小(约500bp)插入片段的克隆，并且提交5个克隆，以使用M13正向引物和反向引物从每个克隆事件进行测序。当用相关生物信息软件分析时，发现已经鉴定出一种与其它子囊菌细胞色素b基因序列密切相关的新的细胞色素b基因序列。在表3中可以找到编码G143密码子(按照酿酒酵母氨基酸编号系统)中第二位碱基上游30个碱基和下游30个碱基的61个核苷酸的序列段。
在G143A点突变位点周围设计了不同的特异性ARMS黑麦喙孢引物基于野生型序列的两种正向ARMS引物G-sp-2CCTTATGGACAGATGTCTTTATGATG(SEQ ID NO 133)G-sp-3CCTTATGGACAGATGTCTTTATGAAG(SEQ ID NO 134)基于预期的G143A突变的两种正向ARMS引物C-sp-2CCTTATGGACAGATGTCTTTATGATC(SEQ ID NO 135)C-sp-3CCTTATGGACAGATGTCTTTATGAAC(SEQ ID NO 136)和设计位于所述点突变上游的对照引物STAND3TCCTTATGGACAGATGTCTTTATG(SEQ ID NO 137)在所述ARMS引物中，-1碱基(3’端碱基)对应于G143/A143密码子的第二位核苷酸。所述引物中不同于黑麦喙孢野生型细胞色素b序列的碱基以粗体表示。-2位从G碱基变为A碱基或T碱基。进行这种改变是为了将所述引物去稳定，正如ARMS引物所常见的。
ScorpionTM产物检测系统在这种情况下用作检测机制，再次用Oligo5和MFold程序设计Scorpion反向引物(参见实施例1中的细节)。黑麦喙孢Scorpion引物的序列是5’FAM-CCCGCCATATTAGCTGCATTAGTATTAATGCGCCGGG(SEQ ID NO 138)-MR-HEG-TACACCTAAAGGATTACCTGACCCTGCAC3’(SEQ ID NO 139)(有关细节参见先前的实施例)。
所有引物均由Oswel DNA Service合成。在使用之前，将所述引物分别在500μl总体积中稀释至5μM。然后在PCR中将引物进一步稀释至500nM的终浓度。
首先通过用不同浓度的质粒DNA作为模板，验证引物可用于ARMS/Scorpion分析中。进行这种验证是为了检查所述引物设计的特异性和灵敏度。将部分野生型细胞色素b基因序列和含G143A突变的相应序列克隆到TApCR2.1载体中，以用于这一验证方法中。由于在黑麦喙孢DNA中尚未发现该突变，因此用定点诱变策略将A143点突变掺入到所述序列中，即将所述点突变掺入到一种引物设计中，然后用野生型克隆作为模板，用该引物扩增目的区。用前述标准方法建立PCR，在Hybaid Omn-E仪器上进行30个循环，每个循环为94℃45秒、56℃45秒和72℃1分钟30秒。也包括一个94℃3分钟的最初保温以及一个72℃10分钟的最后延伸保温。将约370bp的PCR产物克隆到TApCR2.1载体中，并且在用于该实验之前，对所得克隆测序，以检查任何PCR诱导的错误。
计算出未稀释的所述质粒DNA制备物的浓度约为2×1011分子/μl。因此将两种质粒储备液在1mg/ml BSA中稀释至2×107、105、103和101分子/μl，然后使用5μl等份的每种稀释液，在相应的PCR中产生约1×108、106、104和102分子质粒。PCR条件和组分如前所述。在图5a中，显示出用G引物混合物检测到G质粒的连续稀释度，用每种10倍质粒稀释液，荧光检测延迟约4个循环。图5b显示用G-sp-2引物混合物扩增的最高浓度的G(野生型(Wt))和C(突变型)盒。即使所述DNA模板浓度高(反应中约108分子模板)，G引物也是直至PCR中非常晚的时期，才离开C模板而错误起始。在G错误起始事件之前的显著延迟，因此证明了所述引物具有良好的特异性窗(window of specificity)。通过特异性和非特异性质粒稀释液，C-sp-2引物组也显示出良好特异性(图6a和6b)。在以下实验中使用G-sp-2和C-sp-2引物混合物来代替G-sp-3和C-sp-3引物混合物。
该研究的第二部分是用总(基因组)DNA和cDNA作为PCR的模板进行比较。用苯酚-氯仿提取法(如前所述)从黑麦喙孢分离株中制备总DNA材料。用RNeasy Plant minikit(Qiagen产品目录号74903)，按照生产商的建议，从100mg磨碎的菌丝体提取总RNA。然后使用Advantage RT-PCR试剂盒(Clontech产品目录号K1402-1)，按照生产商的建议，用1μg总RNA，用RT PCR进行第一链cDNA的合成。制备来自三个分离株(K3278、K3274和K3276)的总DNA和cDNA库。将总DNA库用作模板，以1∶100、1∶1000和1∶10000稀释，而将cDNA用作纯模板，以1∶5和1∶10稀释。在每种情况下，将5μl模板加入PCR中。也使用实施例1和2中描述的实时PCR的条件，只是在此时进行40个循环的PCR，而不是50个循环。图7a、7b和7c说明了用三个稀释度(稀释度1总DNA(1∶100)和cDNA(纯)；稀释度2总DNA(1∶1000)和cDNA(1∶5)；稀释度3总DNA(1∶10000)和cDNA(1∶10))的总DNA和cDNA模板、用G引物混合物扩增而获得的结果。图8a、8b和8c描述了用C引物混合物扩增的总DNA和cDNA模板。使用总DNA而不用cDNA作为模板，得到更为灵敏的结果和更早的循环阈值。为了提供最好的机会来检测出任何C突变，选择稀释度为1∶10和1∶1000的总DNA输入物用于将来的分析。当将C特异性引物混合物用于这种40个循环的PCR中时，不能检测出荧光变化，表明在这些分离株中仅发现野生型G143等位基因。
从两个分离株(K1056和K1916)中鉴定部分细胞色素b序列。所述原始野生型序列得自通过用浸渍的菌丝体悬浮液接种马铃薯葡萄糖肉汤(参见表9)而制备的生物样品。将烧瓶在12小时白光/12小时无光制度下，在定轨摇床上以85rpm、19℃恒温培育21天，直至有足够的菌丝体材料用于DNA提取方案。然后通过Miracloth过滤而收集菌丝体，并将其于-20℃冷冻待用。用苯酚/氯仿提取方案(参见实施例1)制备总DNA。通过凝胶电泳检查DNA产量和质量后，制备连续稀释液(在重蒸水中1∶10、1∶100和1∶1000)用作PCR模板。试验许多不同的引物(特异性引物和简并引物)组合，在大多数情况下没有获得扩增产物。然而，根据黑曲霉和粗糙脉孢霉的保守细胞色素b序列设计的一种引物对(Cytb3F和Cyt9R，有关细节参见实施例2)确实产生了一种约500bp PCR产物。将该产物克隆到TA pCR2.1载体(Invitrogen)中，用M13正向引物和反向引物对6个克隆进行测序。当分析所述结果时，发现反向引物正确地结合于细胞色素b序列，而正向引物在具有内含子样特征的DNA序列中错误起始。在所述新的细胞色素b基因的序列段中设计特异性圆核腔菌引物(Pt2R5’CTT ACA TCT GTAATA GGT AAT3’)(SEQ ID NO 140)，并将其与根据苹果黑星菌细胞色素b基因序列设计的正向引物(Pt5F5’TGT TAC TTT AGC AATGCA CTA3’)(SEQ ID NO 141)一起用于圆核腔菌cDNA模板。从这两种分离株的菌丝体样品中制备cDNA。用RNeasy试剂盒(Qiagen)，按照生产商的建议，从100mg磨碎的菌丝体中提取总RNA。用AdvantageRT-PCR Clontech试剂盒(按照生产商的建议)，用RT PCR从1μg总RNA进行第一链cDNA合成。然后将5μl所得cDNA用于PCR中。PCR组分和条件如前所述。扩增出两种分离株的约800bp PCR产物(描绘了编码根据酿酒酵母编号系统的真菌细胞色素b的氨基酸区48-310的序列)。在这两种情况下，都将PCR产物克隆到TA pCR2.1载体(Invitrogen)中，用M13正向引物和反向引物对每个分离株的4个含有预期大小插入片段(约800bp)的克隆测序。序列数据分析表明，已经分离出一种与其它已知子囊菌细胞色素b序列密切相关的新的细胞色素b基因序列。在表3中可以找到编码G143密码子(按照酿酒酵母氨基酸编号系统)中第二位碱基上游30个碱基和下游30个碱基的cDNA序列的61个核苷酸的序列段。
在G143A点突变位点周围设计了特异性ARMS圆核腔菌引物基于野生型序列的正向ARMS引物G-sp-4CCCTACGGGCAAATGAGCCTTTGAAG(SEQ ID NO 142)基于可能的G143A突变的正向ARMS引物C-sp-5CCCTACGGGCAAATGAGCCTTTGATC(SEQ ID NO 143)和设计位于所述点突变上游的对照引物STAND4ACCCTACGGGCAAATGAGCCTTTG(SEQ ID NO 144)所用的反向引物是UNLS4TACACCTAAAGGATTTCCTGACCCTGCAA(SEQ ID NO 145)再者，在所述ARMS引物中，-1碱基(3’端碱基)对应于G143/A143密码子的第二位核苷酸。所述引物中不同于圆核腔菌野生型细胞色素b序列的碱基以粗体表示。-2位从G碱基变为A碱基或T碱基。进行这种改变是为了将所述引物去稳定。
所有引物均由Oswel DNA Service合成。在使用之前，将所述引物分别在500μl总体积中稀释至5μM。然后在PCR中将引物进一步稀释至500nM的终浓度。
在这种情况下，用一种嵌入染料来检测所述PCR产物。所用的染料是YO-PRO-1染料(Molecular Probes，Seattle Washington，USA)，该染料与双链DNA结合，并且发射出可用ABI Prism 7700仪器检测到的荧光。
首先通过用不同浓度的质粒DNA作为模板，验证引物。进行这种验证是为了检查所述引物设计的特异性和灵敏度。将部分野生型圆核腔菌细胞色素b基因序列和含有通过定点诱变引入的G143A突变的相应序列克隆到TA pCR2.1载体中，以用于这一验证方法中(如实施例3中所述)。
计算出未稀释的所述质粒DNA储备液的浓度约为2×1011分子/μl。将两种质粒稀释至2×107、105、103和101分子/μl，然后使用5μl的每种稀释液，在相应的PCR中产生约1×108、106、104和102分子质粒(有关PCR条件参见实施例1)。唯一不同的是将YO-PRO-1染料加入反应混合物中。在第35个循环后引物二聚体产物的产生干扰所述信号。这种检测法的灵敏度低于Scorpion检测系统，因为它受背景噪音(例如来自引入二聚体形成的荧光发射)的影响更大。然而，得出的结论是，通过用该方法可以得出有价值的信息，但在解释结果时必须更加小心。
在以下实验中，检查上述分离株是否存在G143A等位基因。在具有无可发酵碳源的培养基中培养分离株，以得到用于ARMS/Scorpion测定的材料。但原始孢子悬浮液接种(1ml，100,000孢子/ml)含有肉汤的锥瓶中。培养物在定轨摇床上如前所述进行培育，然后收获所得的菌丝体用于cDNA制备。从每种分离株制备(如前所述)cDNA材料。进行这一步是为了避免设计位于圆核腔菌细胞色素b序列的复杂的内含子/外显子组构中的引物。
如前所述建立所有PCR，并进行50个循环。唯一不同的是将YO-PRO-1染料加入反应混合物中。将纯cDNA和以1∶10稀释的cDNA用作模板，在所有情况下都将5μl模板加入PCR测定中。
图9a和9b描述了用所三种引物对以双份进行的对以两种稀释度测试的11种分离株中两个分离株的PCR扩增结果。在所测试的样品中没有可检测水平的G143A等位基因的情况。采用Scorpion检测系统的实时PCR研究也根据已确定的编码目的氨基酸区的圆核腔菌细胞色素b基因的基因组组构，设计了诊断性G143A Scorpion测定。
通过用根据已知编码序列和随后鉴定的内含子序列而设计的一系列引物，对基因组DNA制备物进行PCR扩增，阐明了目的碱基周围的内含子/外显子组构。使用多种不同的引物组合，按照生产商的说明，将Taq ExtenderTMPCR Additive和Perfect Match PCR Enhancer(均得自Strategene，产品目录号分别为600148和600129)用于大PCR片段的扩增中。在Hybaid Omn-E PCR仪器上进行最初的94℃保温3分钟后，进行30个循环，每个循环为94℃45秒、52℃45秒和72℃3分钟。也包括一个最后的72℃保温10分钟。当用凝胶电泳分析PCR产物时，用引物对pter23F(编码区5’ACA TAG TAA TAC TGCTTC AGC3’)(SEQ ID NO 146)-pter25R(内含子区5’TAC ATT TGAGGC AAA TAT TTC(SEQ ID NO 147)3’)发现一个2.7kb PCR产物，而用引物对pter7F(编码区5’CTA CGG GCA AAT GAG CCT TTG3’)(SEQ ID NO 148)-pter6R(编码区5’CTC TGG AAC TAT CGC TGCAGG3’)(SEQ ID NO 149)发现一个7.5kb PCR产物。按照生产商的说明，将这些PCR产物克隆到pCR-XL-TOPO载体(Invitrogen，产品目录号K4700-10)，并且如前所述对每个克隆事件的2个克隆进行测序。发现G143密码子的第二位碱基位于一个36bp外显子的3’端。在表3中可以找到编码G143密码子(按照酿酒酵母氨基酸编号系统)中第二位碱基上游30个碱基和下游30个碱基的61个核苷酸的序列段。
在正向链上设计了一系列31bpARMS引物和一种对照引物(用于扩增突变型和野生型等位基因)，而在内含子序列的反向链上设计了一种共用Scorpion引物。所得的扩增子长121bp(用ARMS引物)和123bp(用对照引物)。在这种情况下，G143密码子中第二位碱基在一个36bp的外显子上，离开3’剪接位点仅1bp。再次用Oligo5和MFold程序(参见实施例1中的详细描述)设计Scorpion引物。圆核腔菌Scorpion引物序列是5’FAM CCC GCC GCA AGC TGA TTT CAT AGG CGG G(SEQ ID NO 150)MR-HEG TTCAA GTA CAT CCA ATT TCA ATA TAC ACT3’(SEQ ID NO 151)Scorpion引物的描述、引物合成和实时PCR条件如先前实施例中所述。
在这种Scorpion测定的优化中，测试的比先前实施例中更多的引物的特异性，每种引物在其3’端具有不同的错配碱基，以引起去稳定(以粗体突出的)，如下所示。
表11圆核腔菌ARMS引物在1×107分子/反应的野生型和突变型质粒模板上进行最初的引物验证。每种质粒模板在ABI Prism 7700仪器上以双份进行实时PCR，使用G特异性ARMS引物、C特异性ARMS引物和对照引物(对照引物既扩增突变型等位基因，也扩增野生型等位基因)以及共同反向Scorpion引物。
正如表12中所见，当针对突变型质粒模板和野生型质粒模板测试时，不同的ARMS引物设计产生不同的特异性窗。当与所测试的其它引物比较时，PT-G-1和PT-C-5提供最宽的特异性窗。因此，选择它们作为该测定的优选引物对。引物PT-C-5在正确的模板上的Ct值为16，而PT-G-1在正确模板上的Ct值也为16。PT-C-5引物在第34个循环时在错误模板上错误起始，产生18个循环的特异性窗，而PT-G-1引物在第32个循环时错误起始，产生16个循环的特异性窗，等于所述两种引物的灵敏度有约10倍的差异。
表12ARMS引物验证在其中均在1mg/mlBSA中将突变型质粒以1∶1、1∶10、1∶100、1∶1,000、1∶10,000和1∶100,000的频率掺加野生型质粒背景的质粒掺加实验中，测试PT-G-1和PT-C-5 ARMS引物。在所有情况下，PCR测定中每个频率的总质粒浓度都为1×107分子/反应。实时PCR条件和组分如前所述。
在下表中总结了所得数据
表13掺加实验的结果因为C质粒在野生型质粒背景中减少，所以荧光检测被延迟。用C质粒的每种10倍稀释液，在荧光检测中延迟4个循环。在10,000个野生型分子的背景中一个突变型分子的PT-C-5循环阈值可以清楚地看到，但1∶100,000下不能将PT-C-5引物错误起始与100％野生型(G)盒区分开来，因此遮蔽了较低的C∶G频率。这表明，在这种情况下ARMS转换将允许可信地检测到≤1∶10,000的频率。
用新优化的实时Scorpion PCR测定，测试了收集于爱尔兰Cork的一系列圆核腔菌样品(Ir 5-8、Ir 9-13、Ir 14-17、Ir 18-21、Ir30-34)。将这些4个或5个分离株的各组分离株接种到V8琼脂平板上，培育直至达到所得菌落孢子形成。
将菌丝体从琼脂平板中收集到10ml无菌重蒸水中。将菌丝体悬浮液转移至15ml Falcon管中，并以3200rpm离心10分钟。除去水，将菌丝丛(mass)分配到两个无菌Eppendorf管中。然后通过以13,000rpm离心5分钟，沉淀菌丝体。用移液管除去上清液，将其中一个菌丝体沉淀用于DNA提取，而将另一个菌丝体沉淀保存于-80℃待用。用Qiagen DNeasy Plant Mini Kit方案，按照生产商的方案中所述进行DNA提取，以从植物组织中分离DNA。将DNA稀释10倍和100倍，以用于所述测定，每个PCR测定中使用5μl等份的DNA。用每种引物对(PT-C-5、PT-G-1和对照引物；每种引物均与含有Scorpion检测系统的共同反向引物一起使用)，以三份重复和两个稀释度测试所有分离株。
以下显示了用基因组DNA的1∶10稀释液作为模板筛选分离株的结果
表14圆核腔菌实时PCR结果在大多数情况下，PT-C-5引物仅显示出在第34个循环或第34个循环之后的循环阈值(Ct)，此时显示出在质粒模板上发生错误起始。在某些情况下，PT-C-5引物根本没有错误起始。这些结果证明，没有证据显示在所研究的样品中存在G143A突变。
在1999年期间从法国和意大利的实验地点和商业葡萄园收集受感染的葡萄叶片和果实，并送至Jealott’s Hill Research Station(ZenecaAgrochemicals)。到达实验室后，用小画笔将菌丝体和孢子转移到从6-7叶幼苗(Ohanez变种)摘下的新鲜表面消毒的叶片上。来自每个收集地点的葡萄钩丝壳作为一个单独的群体处理。
在实验室收到时，将接种的叶片置于21℃恒温室培育2-3周。一旦检测出孢子形成病害，则用受感染的叶片来接种直接在塑料植物繁殖器中播种的3-4叶葡萄幼苗。用压缩空气管线(compressed airline)将每个分离株的分生孢子从源叶片吹到至多40个葡萄幼苗的合适靶叶片上。将盖重新置于繁殖器上，然后将其在受控环境生长室中培育2周。收集在这些植株上产生的分生孢子，并冷冻于-80℃下待用。
用得自Qiagen的RNeasy试剂盒(按照生产商的建议)，从100mg来源于一个分离株的磨碎的葡萄钩丝壳孢子中提取总RNA。用Advantage RT-PCR Clontech试剂盒(按照生产商的建议)，用RT PCR从1μg总RNA合成第一链cDNA。然后将5μl cDNA用作PCR扩增的模板，使用ERY 11F(5’ATGAACAATTGGTACAGTAAT3’)(SEQID NO 163)和ERY 4R(5’AAATCTGTTAAAGGCATAGCC3’)(SEQID NO 164)，根据酿酒酵母编号系统，所述引物描绘了真菌细胞色素b的氨基酸114-309的轮廓。扩增出预期大小(约500bp)的一个DNA片段，按照生产商的建议将所述PCR产物克隆到pCR2.1 TA载体(Invitrogen)中。进行Wizard minipreps，以鉴定具有合适插入片段的克隆，提交了5个克隆，以便用M13正向引物和反向引物测序。用相关生物信息软件(Seqman and Macaw)分析时，发现已经鉴定出一种与其它子囊菌细胞色素b序列密切相关的新的细胞色素b基因序列。在表3中可以找到编码G143密码子(按照酿酒酵母氨基酸编号系统)中第二位碱基上游30个碱基和下游30个碱基的cDNA序列的61个核苷酸的序列段。根据所述新序列设计特异性葡萄钩丝壳引物，以直接用于孢子材料。怀疑在目的区(G143SNP周围500bp)内存在内含子序列，因为先前在生物材料上进行的PCR扩增未获成功。使用多种不同的引物组合，将Taq ExtenderTMPCR Additive和Perfect Match PCREnhancer(均得自Strategene)用于(按照生产商的说明)大PCR片段的扩增中。在Hybaid Omn-E PCR仪器上进行最初的94℃保温3分钟后，进行30个循环，每个循环为94℃45秒、52℃45秒和72℃3分钟。也包括一个最后的72℃保温10分钟。引物组合2F(5’GTT TTACCC TAC GGG CAG ATG3’)(SEQ ID NO 165)-5R(5’AAA GAATCT GTT TAA GGT TGC 3’)(SEQ ID NO 166)、2F6R(5’AAA CCACCT CAA AGA AAC TCC 3’)(SEQ ID NO 167)和4F(5’CAT GAATAG GAC AAG ATA TCG 3’)(SEQ ID NO 168)-6R成功地扩增了长度范围为1.6kb-3kb的PCR产物。将这些PCR产物克隆到TA pCR2.1载体(Invitrogen)中，并且用随后的克隆如前所述进行测序。对于对应于每种不同PCR产物的一个克隆实施引物步查策略，对这三个克隆的序列分析表明，在所述PCR片段中存在两个内含子(长度为1.6kb和1.1kb)，G143密码子的第二位碱基位于一个内含子剪接位点上游10bp。在表3中可以找到编码G143密码子(按照酿酒酵母氨基酸编号系统)中第二位碱基上游10个碱基和下游30个碱基的41个核苷酸的序列段。
从田间收集单丝壳感染的黄瓜和甜瓜叶片，用小画笔将分生孢子在实验室中干接种到新鲜叶材料(黄瓜和甜瓜)上。将单分生孢子(monoconidial)分离株传代培养，并在植物中通过24小时预防性鉴别剂量测定(至多100ppm剂量，已知产生100％防治野生型菌株)进行测试。用真空泵抽吸将来自候选抗性分离株的分生孢子转移到合适的容器中。用PCR分析来分析该样品的一部分，将其余部分进行重新测试，以证实表型抗性。
在约100mg分生孢子嗜球果伞素类似物敏感型样品上实施RT-PCR策略(如实施例3中所述)。将所得的cDNA用作PCR扩增反应中的模板，使用引物Ery2F(5’TCACCTAGAACATTAACATGA3’)(SEQID NO 169)和4R(5’AAATCTGTTAAAGGCATAGCC3’(SEQ ID NO170))，根据酿酒酵母编号系统，所述引物描绘了真菌细胞色素b的氨基酸108-309的轮廓。其它PCR组分和条件如前所述。在所述PCR产物的凝胶电泳分析期间发现一种预期大小(约600bp)的PCR产物，然后将该产物克隆到TA pCR2.1载体(Invitrogen)中，用M13正向引物和反向引物如前所述对具有正确大小插入片段(约600bp)的5个克隆进行测序。用相关生物信息软件(Seqman and Macaw)分析时，发现已经鉴定出一种与其它子囊菌细胞色素b序列密切相关的新的细胞色素b基因序列。然后设计特异性单丝壳PCR引物，用于从基因组DNA扩增G143区。在PCR扩增中使用引物对SF1(5’TTCCCTTCGGTCAAATGTCGC3’)(SEQ ID NO 171)-SF8(5’AAACCCCCTCAGAGAAACTCC3’)(SEQ ID NO 172)和SF1-SF10(5’GACCCCGCGCTATCATGTAAG3’)(SEQ ID NO 173)，使用重悬于重蒸水中的孢子样品作为模板。PCR组分和条件如先前实施例中所述。通过凝胶电泳分析PCR产物，用SF1/8引物对发现一种约2kb产物，而用SF1/10引物对发现一条约2.1kb带。将这两种PCR产物克隆到TA pCR2.1克隆载体(Invitrogen)中，并且如前所述对5个克隆进行测序。采用引物步查策略，对来自这两个克隆事件的两个克隆进行全测序。当用相关生物信息软件分析序列数据时，发现在G143密码子第二位碱基下游9bp处，存在一个1917bp的内含子。在表3中可以找到编码G143密码子(按照酿酒酵母氨基酸编号系统)中第二位碱基上游6个碱基和下游30个碱基的37个核苷酸序列段的cDNA序列和基因组序列(考虑了内含子/外显子组构)。
也从分生孢子嗜球果伞素类似物抗性样品中扩增部分细胞色素b基因序列。将分生孢子样品(＜50mg)重悬于200μl重蒸水中，并且在重蒸水中以1∶10、1∶100稀释。将10μl每种稀释液用作PCR扩增的模板，使用SF1/SF8特异性单丝壳引物。将Taq ExtenderTMPCR Additive和Perfect Match PCR Enhancer(均得自Strategene)用于(按照生产商的说明)扩增这种大PCR片段。在Hybaid Omn-E PCR仪器上进行最初的94℃保温3分钟后，进行30个循环，每个循环为94℃45秒、50℃45秒和72℃5分钟。也包括一个最后的72℃保温10分钟。用凝胶电泳分析分析所述PCR产物，发现一个预期大小的带(约2kb)。将其克隆到TA pCR2.1载体(Invitrogen)中，并且如先前实施例中所述，对具有所述预期大小插入片段的10个克隆进行测序。用合适的生物信息软件(Seqman，Editseq and Macaw软件)分析所述序列数据，当在所有10中情况下与野生型序列比较时，揭示所述细胞色素b序列中的一个G--＞C点突变。该DNA点突变导致第143位(按照酿酒酵母氨基酸编码系统)上单个甘氨酸变为丙氨酸。
从田间收集受感染的香蕉叶片，将子囊孢子从叶片上直接接种到培养皿中的人工培养基上。将单子囊孢子(monoascosporic)分离株维持在人工培养基上，并通过在肉汤培养基中进行摇瓶培养，准备用于PCR分析。通过Micracloth收集菌丝体，并用经酸洗涤和高压灭菌的研棒和研研钵将其研磨成细粉。将100mg磨碎的菌丝体用于基因组DNA提取和第一链cDNA合成(如先前实施例中所述)。将基因组DNA在用作PCR模板之前，在重蒸水中以1∶10、1∶100和1∶1000稀释。将5μlcDNA和10μl每种基因组DNA稀释液用作PCR扩增的模板，使用实施例3中所述的简并引物对。PCR条件和组分如先前实施例中所述。在凝胶电泳分析所述PCR产物时，当cDNA用作模板时发现一条预期大小的带(约500bp)，而当将基因组DNA用作模板时发现一条较大的带(约1.6kb)。将所述两种PCR产物克隆到pCR2.1 TA载体(Invitrogen)中，并且用M13正向引物和反向引物对具有正确大小插入片段(约500bp和1.6kb)的5个所得克隆进行测序。用相关生物信息软件分析所述序列数据时，发现所述较大PCR产物在G143密码子中第二位碱基下游78bp含有一个1064bp的内含子。除了在所述较大PCR产物中存在该内含子外，DNA序列是相同的。该细胞色素b基因序列被鉴定为新的，并且与其它子囊菌细胞色素b序列密切相关。在表3中可以找到编码G143密码子(按照酿酒酵母氨基酸编号系统)中第二位碱基上游30个碱基和下游30个碱基的61个核苷酸的序列段。
将孢子囊从受感染叶材料上洗到去离子水中。用喷枪将所得孢子囊悬浮液以10,000孢子/ml的浓度接种到新鲜叶材料上。在发生病害后，将收集于重蒸水中的孢子悬浮液样品在离心机中离心，产生沉淀，将其保存于-80℃待用。然后将古巴假霜霉孢子囊重悬于200μl重蒸水中，并且在重蒸水中以1∶10和1∶100稀释。将10μl每种孢子囊稀释液用作PCR扩增的模板，使用引物PLAS17F和PLAS15R(参见实施例1中的细节)。PCR条件和组分如先前实施例中所述。在凝胶电泳分析所述PCR产物时，发现一条预期大小的带(约500bp)。然后将该PCR产物克隆到pCR2.1 TA载体中，并且用M13正向引物和反向引物对具有正确大小插入片段(约500bp)的5个所得克隆进行测序。用相关生物信息软件分析时，发现已经鉴定出一种与其它卵菌细胞色素b序列密切相关的新的细胞色素b基因序列。在表3中可以找到编码G143密码子(按照酿酒酵母氨基酸编号系统)中第二位碱基上游30个碱基和下游30个碱基的61个核苷酸的序列段。实施例9在实施例9中，我们报道了部分禾生球腔菌细胞色素b基因序列的鉴定。禾生球腔菌是小麦叶枯病的病原体。
从田间收集受感染的小麦叶片，并且将其在湿润环境中培育，以促进孢子产生。从叶片上取出孢子角，将其涂布到Czapek Dox V8琼脂平板(参见表9)上，并且在受控环境中于19℃培育6天。将单个菌落分离物进一步传代培养，并在合适的培养基中通过摇瓶培养扩增。取出真菌材料并保持于-80℃下待用。如实施例1中所述，对200mg磨碎的菌丝体进行基因组DNA制备。通过凝胶电泳检查基因组DNA产量和质量，并且在重蒸水中以1∶10和1∶100稀释。将10μl每种稀释液用作PCR扩增的模板，使用引物Cyt3F和Cyt9R(参见实施例2中的细节)。PCR组分和条件如实施例2中所述。通过凝胶电泳分析所述PCR产物，发现一条预期大小的带(约500bp)。将该PCR产物克隆到TA pCR2.1载体中，并且如前所述对含有正确大小插入片段的5个克隆进行测序。用相关生物信息软件分析所述序列数据时，发现所述PCR片段编码一种显示出与其它子囊菌细胞色素b基因序列有密切同源性的新的细胞色素b基因序列的一部分。在表3中可以找到编码G143密码子(按照酿酒酵母氨基酸编号系统)中第二位碱基上游30个碱基和下游30个碱基的61个核苷酸的序列段。
从田间收集受感染的叶片材料(草坪或苔藓)，取出真菌材料并在人工培养基上传代培养。真菌材料通过摇瓶培养扩增，收获，并保存于-80℃待用。如实施例1中所述，对200mg磨碎的菌丝体进行基因组DNA制备。通过凝胶电泳评价基因组DNA产量和质量，并且在重蒸水中制备1∶10和1∶100稀释液。将10μl每种稀释液用作PCR扩增的模板，使用引物deg4F和deg3R(参见实施例3中的细节)。PCR组分和条件如实施例3中所述。通过凝胶电泳分析所述PCR产物，发现一条预期大小的带(约500bp)。将该PCR产物克隆到TA pCR2.1载体中，并且如前所述对含有正确大小插入片段的5个克隆进行测序。用相关生物信息软件分析时，发现已经鉴定出一种与其它子囊菌细胞色素b序列密切相关的新的细胞色素b基因序列。在表3中可以找到编码G143密码子(按照酿酒酵母氨基酸编号系统)中第二位碱基上游30个碱基和下游30个碱基的61个核苷酸的序列段。
从田间收集受感染的植物材料(芒果或红辣椒)，取出真菌材料并在人工培养基上传代培养。菌丝体以摇瓶培养扩增，通过Miracloth过滤收获。将菌丝体贮存于-80℃待用。用经酸洗涤的无菌研棒和研钵研磨菌丝体，并将100mg用于基因组DNA制备和第一链cDNA合成(步骤如前述实施例中所述)。将10μl每种基因组稀释液和5μl纯cDNA用作PCR扩增的模板，使用引物deg4F和deg3R(参见实施例3中的引物细节)。PCR组分和条件如前述实施例中所述。通过凝胶电泳分析所述PCR产物，发现预期大小的带(约500bp)。当用基因组DNA或cDNA作为模板时，PCR产物的大小相同，这表明在所扩增的DNA区中没有内含子。将所述PCR产物克隆到TA pCR2.1载体中，并且如前述实施例中所述对每个克隆事件的含有正确大小插入片段的5个克隆进行测序。用相关生物信息软件分析测序数据时，发现所述PCR产物在所有情况下均相同，并且编码一种与其它子囊菌序列有密切同源性的新的细胞色素b基因序列。在表3中可以找到编码G143密码子(按照酿酒酵母氨基酸编号系统)中第二位碱基上游30个碱基和下游30个碱基的61个核苷酸的序列段。
从田间收集病变的番茄叶片，通过在沉降塔中干接种，将分生孢子在新鲜叶片材料上传代培养。通过真空泵抽吸，将由所产生的感染生长的分生孢子抽吸取到无菌Eppendorf管中，并保存于-80℃待用。如先前所述，在由100mg孢子分离的RNA上进行第一链cDNA合成，并将5μl该cDNA用于PCR扩增，使用引物Ery2-4(参见实施例6中的细节)。PCR组分和条件如先前所述。当通过凝胶电泳分析所述PCR产物时，发现一种预期大小的PCR产物(约500bp)。克隆该PCR产物，并且如前所述对含有正确大小插入片段(约500bp)的5个克隆进行测序。用相关生物信息软件分析时，发现所述PCR片段编码一种与其它子囊菌细胞色素b序列密切相关的新的细胞色素b基因序列。在表3中可以找到编码G143密码子(按照酿酒酵母氨基酸编号系统)中第二位碱基上游30个碱基和下游30个碱基的61个核苷酸的序列段。
从田间收集病变的辣椒叶片，将分生孢子干接种到整个植株的新鲜叶片材料上。通过真空泵抽吸，将来自所产生感染的分生孢子抽吸到合适的容器中，并用PCR分析。从Jealott’s Hill的田间和温室收集病变的辣椒叶片和番茄叶片，并将受感染叶片材料直接用于PCR分析。
如前所述，在从100mg孢子或病变的植物材料分离的RNA上进行第一链cDNA合成。当病变的植物材料用作原材料时，通过从所述准备材料中除去无病害植物组织，富集真菌病斑。将5μl cDNA等份样品用于PCR扩增，使用引物Ery11-12(参见实施例2中的细节)。PCR组分和条件如先前所述。当通过凝胶电泳分析所述PCR产物时，发现一种预期大小的PCR产物(约500bp)。克隆该PCR产物，并且如前所述对含有正确大小插入片段(约500bp)的5个克隆进行测序。用相关生物信息软件分析时，发现所述PCR片段编码一种与其它子囊菌细胞色素b序列密切相关的新的细胞色素b基因序列。在表3中可以找到编码G143密码子(按照酿酒酵母氨基酸编号系统)中第二位碱基上游30个碱基和下游30个碱基的61个核苷酸的序列段。
从田间收集受感染的叶片材料(番茄或马铃薯)，取出真菌材料并在人工培养基上传代培养。真菌样品通过摇瓶培养扩增。培养物保藏中心的分离株已经贮存于液氮中，并且定期在人工培养基上传代培养，或在再贮存于-80℃之前通过活寄主材料传代培养。用经酸洗涤的无菌研棒和研钵将在摇瓶中生长的菌丝体磨碎，并且将100mg用于基因组DNA制备和第一链cDNA合成(步骤如先前实施例中所述)。将10μl每种基因组稀释液和5μl纯cDNA用作PCR扩增的模板，使用引物deg4F和deg3R(参见实施例3中的细节)。PCR组分和条件如实施例3中所述。通过凝胶电泳分析所述PCR产物，发现预期大小的带(约500bp)。当使用基因组DNA或cDNA作为模板时，所述PCR产物的大小相同，表明在所扩增的DNA区中没有内含子。将所述PCR产物克隆到TA pCR2.1载体中，并且如上所述对每个克隆事件的含有正确大小插入片段的5个克隆进行测序。用相关生物信息软件分析测序数据时，发现所述PCR产物在所有情况下都是相同的，并且编码一种显示出与其它子囊菌序列具有密切同源性的新的细胞色素b基因序列。在表3中可以找到编码G143密码子(按照酿酒酵母氨基酸编号系统)中第二位碱基上游30个碱基和下游30个碱基的61个核苷酸的序列段。
当用直接从田间受感染番茄叶片提取的基因组DNA作为PCR扩增的模板，并使用引物Ery11-12(有关细节参见上文)时，也扩增了一种与先前分离的立枯链格孢序列仅12bp不同的序列。虽然这种DNA序列含有12个核苷酸的差异，但将这两种序列翻译时，它没有在氨基酸水平上产生任何差异。这两种序列之间的显著差异是在G143密码子中第二位碱基下游62bp处存在一个约1.2kb的内含子。内含子/外显子组构和密码子选择方面的这些差异证明，这些变异在一个物种中是可能的。
从田间收集受感染的叶片材料(花生)，取出真菌材料并在人工培养基上传代培养。培养物储存于液氮中待用。从储存物中取出材料，并在琼脂上培养，以摇瓶培养扩增所得的菌落，并将其保存于-80℃待用。用经酸洗涤的无菌研棒和研钵将菌丝体磨碎，并且将100mg用于基因组DNA制备和第一链cDNA合成(步骤如先前实施例中所述)。将10μl每种基因组稀释液和5μl纯cDNA用作PCR扩增的模板，使用引物deg4F和deg3R(参见实施例3中的细节)。PCR组分和条件如实施例3中所述。通过凝胶电泳分析所述PCR产物，发现预期大小的带(约500bp)。当使用基因组DNA或cDNA作为模板时，所述PCR产物的大小再次相同，表明在所扩增的DNA区中没有内含子。将所述PCR产物克隆到TA pCR2.1载体中，并且如前所述对每个克隆事件的含有正确大小插入片段的5个克隆进行测序。用相关生物信息软件分析测序数据时，发现所述PCR产物在所有情况下都是相同的，并且编码一种显示出与其它细胞色素b基因序列具有密切同源性的新的细胞色素b基因序列。在表3中可以找到编码G143密码子(按照酿酒酵母氨基酸编号系统)中第二位碱基上游30个碱基和下游30个碱基的61个核苷酸的序列段。
从田间收集受感染的叶片材料(水稻)，取出真菌材料并在人工培养基上传代培养。培养物储存于液氮中待用。从储存物中取出材料，并在琼脂上培养，以摇瓶培养扩增所得的菌落，并将其保存于-80℃待用。在从100mg磨碎的菌丝体分离的RNA上，如前所述进行第一链cDNA合成，并且将5μl用于PCR扩增，使用担子菌简并引物1F(5’WYTRGTAYTAATGATGGCTATHGG3’)(SEQ ID NO 174)和1R(5’TCTTARWATWGCATAGAAWGG3’)(SEQ ID NO 175)，所述引物描绘了按照酿酒酵母编号系统的真菌细胞色素b的氨基酸121-283的轮廓。PCR组分和条件如先前所述。当通过凝胶电泳分析所述PCR产物时，发现一种预期大小的PCR产物(约500bp)。将该PCR产物克隆，并且如前所述对含有正确大小插入片段(约500bp)的5个克隆进行测序。用相关生物信息软件分析测序数据时，发现所述PCR产物编码一种显示出与其它担子菌序列具有密切同源性的新的细胞色素b基因序列。在表3中可以找到编码G143密码子(按照酿酒酵母氨基酸编号系统)中第二位碱基上游30个碱基和下游30个碱基的61个核苷酸的序列段。
从田间收集受感染的叶片材料(草坪)，取出真菌材料并在人工培养基上传代培养。培养物储存于液氮中待用。从储存物中取出材料，并在琼脂上培养，以摇瓶培养扩增所得的菌落，并将其保存于-80℃待用。如实施例1中所述，在200mg磨碎的菌丝体上进行基因组DNA制备。通过凝胶电泳分析基因组DNA的产量，将储备液在重蒸水中以1∶10和1∶100稀释。用10μl每种稀释液作为PCR扩增的模板，使用引物PLAS17F和PLAS15R(参见实施例1中的细节)。PCR组分和条件如实施例1中所述。通过凝胶电泳分析所述PCR产物，发现一条正确大小的带(约500bp)。将该PCR产物克隆到TA Invitrogen pCR2.1载体中，并且如前所述对含有正确大小插入片段的5个克隆进行测序。用相关生物信息软件分析所述测序数据时，发现所述PCR片段编码一种显示出与其它卵菌序列有密切同源性的新的细胞色素b基因序列。在表3中可以找到编码G143密码子(按照酿酒酵母氨基酸编号系统)中第二位碱基上游30个碱基和下游30个碱基的61个核苷酸的序列段。
从田间收集受感染的香蕉叶片，并且将子囊孢子从叶片直接接种到培养皿中的人工培养基上。单子囊孢子分离株维持在人工培养基上，并通过在肉汤培养基中进行摇瓶培养，准备用于PCR分析。通过Miracloth收集菌丝体，并用经酸洗涤的无菌研棒和研钵磨成细粉。将100mg磨碎的菌丝体用于基因组DNA提取和第一链cDNA合成(如实施例7中所述)。基因组DNA在用作PCR模板前，在重蒸水中以1∶10、1∶100和1∶1000稀释。将5μl cDNA和10μl每种基因组稀释液用作PCR扩增的模板，使用简并引物对F4/R3(参见实施例3中所述)。PCR条件和组分如先前实施例中所述。通过凝胶电泳分析所述PCR产物时，当将基因组DNA和cDNA都用作模板时，发现一条预期大小的带(约500bp)。将这两种PCR产物克隆到pCR2.1TA载体中，并且用M13正向引物和反向引物对具有正确大小插入片段(约500bp)的5个所得克隆进行测序。用相关适生物信息软件分析所述序列数据时，发现所述PCR片段编码一种与其它子囊菌细胞色素b基因序列有密切同源性的新的细胞色素b基因序列。在表3中可以找到编码G143密码子(按照所述氨基酸编号系统)中第二位碱基上游30个碱基和下游30个碱基的61个核苷酸的序列段。
<110>曾尼卡有限公司<120>方法<130>P50396<150>GB 9910100.8<151>1999-04-30<150>GB 0006004.6<151>2000-03-13<150>GB 0007901.2<151>2000-03-31<160>196<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>61<212>DNA<213>葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola)<400>1ttttgccttg gggacaaatg agtttttggg gtgcaacagt tattacaaat ttattctcgg 60c 61<210>2<211>61<212>DNA<213>禾白粉菌小麦/大麦致病变种(Erysiphe graminis f.sp.tritici/hordei)<400>2tattgccata cgggcagatg agccactggg gtgcaaccgt tatcactaac ctaatgagcg 60c 61<210>3<211>61<212>DNA<213>黑麦喙孢(Rhynchosporium secalis)<400>3tgcttcctta tggacagatg tctttatgag gtgccacagt tataactaat cttatgagtg 60c 61<210>4<211>61<212>DNA<213>圆核腔菌(Pyrenophora teres)<400>4ttttacccta cgggcaaatg agcctttgag gtgctacagt tattactaac cttatgagtg 60c 61<210>5<211>61<212>DNA<213>固核腔菌(Pyrenophora teres)<400>5ttttacccta cgggcaaatg agcctttgag gtgaaatatt tgcctcaaat gtataactaa 60t 61<210>6<211>61<212>DNA<213>禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)<400>6tattacctta tggtcaaatg tctttatgag gagcaacagt tataactaac ttattgagtg 60c 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ttattgagtg 60c 61<210>182<211>61<212>DNA<213>Mycosphaerella fijiensis<400>182ttttacctta tggtcaaatg tctttatgag cagctacagt tataactaat ttaatgagcg 60c 61<210>183<211>61<212>DNA<213>单丝壳(Sphaerotheca fuliginea)<400>183tacttccctt cggtcaaatg tcgctctggg ctgcaaccgt tattactaac cttatgagcg 60c 61<210>184<211>37<212>DNA<213>单丝壳(Sphaerotheca fuliginea)<400>184tctgggctgc aaccgttaag taatagcggt tgtaaaa 37<210>185<211>61<212>DNA<213>葡萄钩丝壳(Uncinula necator)<400>185ttttacccta cgggcagatg agcctatggg ctgcaaccgt tattactaac cttatgagcg 60c 61<210>186<211>41<212>DNA<213>葡萄钩丝壳(Uncinula necator)<400>186agcctatggg ctgcaaccgt taagtaggta atagcggttg a 41<210>187<211>61<212>DNA<213>禾生刺盘孢(Colletotrichum graminicola)<400>187ttttacctta cggacaaatg tcattatgag ctgctacagt tattactaac cttataagtg 60c 61<210>188<211>61<212>DNA<213>瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)<400>188tattaccttg gggtcaaatg agtttttggg ctgctactgt tattactaat ttattttcag 60c 61<210>189<211>61<212>DNA<213>盘长孢状刺盘孢(Colletotrichum gloeosporioides)<400>189ttttacctta tggacaaatg tcattatgag ctgcaacagt tattactaac cttataagtg 60c 61<210>190<211>61<212>DNA<213>番茄粉孢(Oidium lycopersicum)<400>190ttttacccta cgggcagatg agcctgtggg ctgcaaccgt tattactaac cttatgagcg 60c 61<210>191<211>61<212>DNA<213>鞑靼内丝白粉菌(Leveillula taurica)<400>191ttttaccata cggacaaatg tcattatgag ctgcaacagt tattactaac cttatgagtg 60c 61<210>192<211>61<212>DNA<213>古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)<400>192ttttaccttg gggacaaatg agtttttggg ctgcaactgt tattactaat ttattttctg 60c 61<210>193<211>61<212>DNA<213>立枯链格孢(Alternaria solani)<400>193ttcttcctta tgggcaaatg tctttatgag ctgctacagt tattactaac cttatgagtg 60c 61<210>194<211>61<212>DNA<213>落花生尾孢(Cercospora arachidola)<400>194tattacctta tggacaaatg tcattatgag cagctacagt tattactaat ttattatctg 60c 61<210>195<211>61<212>DNA<213>立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)<400>195tgcttccata cgggcaaatg tctctgtggg ctgctacagt aattactaat ttactttctg 60c 61<210>196<211>61<212>DNA<213>Mycosphaerella musicola<400>196ttttacctta tggtcaaatg tctttatgag cagctacagt tataactaat ttaatgagtg 60c 6权利要求
1.一种用于检测真菌核酸中突变的方法，其中所述突变的存在导致真菌对嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的其它任何化合物的抗性，所述方法包括用任一(或一种)单核苷酸多态检测技术鉴定在真菌核酸中是否存在所述突变。
2.一种用于检测真菌核酸中突变的方法，其中所述突变的存在导致真菌对嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的任何其它化合物的抗性，所述方法包括检测在PCR反应期间产生的扩增子的存在，其中所述PCR反应包括在合适的核苷酸三磷酸和用于聚合的试剂存在下，使包含真菌核酸的受试样品与一种诊断性引物接触，其中所述扩增子的检测与所述核酸中是否存在所述突变直接相关。
3.一种用于检测真菌核酸中突变的方法，其中所述突变的存在导致真菌对嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的任何其它化合物的抗性，所述方法包括在合适的核苷酸三磷酸和用于聚合的试剂存在下，使包含真菌核酸的受试样品与一种合适的诊断性引物接触，使得所述诊断性引物或者在所述样品中存在所述突变时得以延伸，或者当存在野生型序列时得以延伸；并且根据诊断性引物延伸产物是否存在而检测所述突变是否存在。
4.一种权利要求2的用于检测真菌核酸中突变的方法，其中所述方法包括在合适的核苷酸三磷酸和用于聚合的试剂存在下，使包含真菌核酸的受试样品与所述特定突变的诊断性引物接触，使得所述诊断性引物在所述样品中存在所述突变时得以延伸；并且根据诊断性引物延伸产物是否存在而检测所述突变是否存在。
5.一种任一前述权利要求的方法，其中在真菌细胞色素b基因中存在所述突变，其中所述突变导致嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的任何其它化合物对于所述细胞色素b蛋白活性位点的抑制，但仍允许呼吸过程发生。
6.一种依照前述权利要求的方法，其中所述真菌核酸中的突变导致在所编码蛋白质中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的甘氨酸残基被选自以下一种氨基酸取代精氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、天冬氨酸和丙氨酸。
7.一种任一前述权利要求的方法，其中所述真菌核酸中的突变导致在所编码的蛋白质中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的甘氨酸残基被丙氨酸取代。
8.一种权利要求2的方法，所述方法用于检测真菌细胞色素b基因中导致所编码蛋白质中G143A取代的突变，其中所述突变导致真菌对嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的任何其它化合物的抗性，所述方法包括检测PCR反应期间产生的扩增子的存在，其中所述PCR反应包括在合适的核苷酸三磷酸和一种用于聚合的试剂存在下，使包含真菌核酸的受试样品与一种引物接触，其中所述扩增子的检测与所述核酸中是否存在所述突变直接相关。
9.一种权利要求3的方法，所述方法用于检测真菌细胞色素b基因中导致所编码蛋白质中G143A取代的突变，所述方法包括在合适的核苷酸三磷酸和一种用于聚合的试剂存在下，使包含真菌核酸的受试样品与对于导致所编码蛋白质中G143A取代的突变的诊断性引物接触，使得所述诊断性引物在所述样品中存在导致所编码蛋白质中G143A取代的突变时得以延伸；并且根据诊断性引物延伸产物是否存在而检测所述突变是否存在。
10.一种任一前述权利要求的方法，其中所述真菌基因存在于选自以下的一种植物致病真菌中葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola)、禾白粉菌小麦/大麦致病变种(Erysiphe graminis f.sp.tritici/hordei)、黑麦喙孢(Rhynchosporium secalis)、圆核腔菌(Pyrenophora teres)、禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)、苹果黑星菌(Venturiainaequalis)、Mycosphaerella fijiensis var.difformis、单丝壳(Sphaerotheca fuliginea)、葡萄钩丝壳(Uncinula necator)、禾生刺盘孢(Colletotrichum graminicola)、瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、盘长孢状刺盘孢(Colletotrichum gloeosporiodes)、番茄粉孢(Oidiumlycopersicum)、Magnaporthe grisea、致病疫霉(Phytophthorainfestans)、鞑靼内丝白粉菌(Leveillula taurica)、古巴假霜霉(Pseudoperonospora cubensis)、立枯链格孢(Alternaria solani)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、Mycosphaerella musicola和落花生尾孢(Cercospora arachidola)。
11.一种用于检测真菌对嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的任何其它化合物的抗性的方法，所述方法包括鉴定真菌核酸中是否存在突变，其中所述突变的存在导致对嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的任何其它化合物的抗性，所述方法包括鉴定发生在编码所述细胞色素b蛋白中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的氨基酸的三联体中一个或多个碱基的对应位置上是否存在单核苷酸多态性。
12.一种权利要求11的方法，其中所述单核苷酸多态性发生在编码与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的氨基酸的三联体中第二位碱基的对应位置上。
13.一种任一前述权利要求的方法，其中所检测的单核苷酸多态性是在编码所述细胞色素b蛋白中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的氨基酸的三联体中第二位碱基的对应位置上发生G碱基变为C碱基。
14.一种编码全部或部分细胞色素b蛋白的真菌DNA序列，其中所述DNA序列在与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上编码甘氨酸残基，并且所述DNA序列可得自选自以下的一种真菌葡萄生单轴霉、禾白粉菌小麦/大麦致病变种、黑麦喙孢、圆核腔菌、禾生球腔菌、Mycosphaerella fijiensis var.difformis、单丝壳、葡萄钩丝壳、禾生刺盘孢、瓜果腐霉、盘长孢状刺盘孢、番茄粉孢、鞑靼内丝白粉菌、古巴假霜霉、立枯链格孢、立枯丝核菌、Mycosphaerella musicola和落花生尾孢。
15.一种权利要求14的真菌DNA序列，所述真菌DNA序列包含选自以下的一种DNA序列的全部序列或部分序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID NO 4、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQID NO 10、SEQ ID NO11、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQID NO 14、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQID NO 18、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO 20和SEQ ID NO 21。
16.一种编码全部或部分细胞色素b蛋白的真菌DNA序列，当所述序列在编码细胞色素b蛋白的相应野生型DNA序列上对齐排列时，可见到所述真菌DNA序列在所述DNA中编码所述蛋白中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的氨基酸的三联体中一个或多个碱基的对应位置上含有单核苷酸多态性突变，所述单核苷酸多态性突变导致所述正常的甘氨酸残基被一种替代的氨基酸取代，前提是所述DNA序列不是乳柄小菇的细胞色素b编码序列。
17.一种权利要求16的真菌DNA序列，其中所述单核苷酸多态性突变发生在编码所述蛋白质中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的氨基酸的三联体中第二位碱基的对应位置上，所述单核苷酸多态性突变导致所述正常的甘氨酸残基被一种替代的氨基酸取代，前提是所述DNA序列不是乳柄小菇的细胞色素b编码序列。
18.一种编码全部或部分细胞色素b蛋白的真菌DNA序列，其中所述DNA序列在与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上编码丙氨酸残基，并且所述DNA序列可得自选自以下的一种真菌葡萄生单轴霉、禾白粉菌小麦/大麦致病变种、黑麦喙孢、圆核腔菌、禾生球腔菌、苹果黑星菌、Mycosphaerella fijiensis var.difformis、单丝壳、葡萄钩丝壳、禾生刺盘孢、瓜果腐霉、盘长孢状刺盘孢、番茄粉孢、Magnaporthe grisea、致病疫霉、鞑靼内丝白粉菌、古巴假霜霉、立枯链格孢、立枯丝核菌、Mycosphaerella musicola和落花生尾孢。
19.一种权利要求18的编码全部或部分细胞色素b蛋白的真菌DNA序列，其中所述DNA序列含有一个单核苷酸多态性，所述单核苷酸多态性导致在编码所述蛋白中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的氨基酸的三联体中第二位碱基的对应位置上所述正常的鸟嘌呤残基被胞嘧啶残基取代，前提是所述DNA序列不是乳柄小菇的细胞色素b编码序列。
20.一种权利要求16-19中任一项的真菌DNA序列，所述真菌DNA包含选自以下的一种序列的全部序列或部分序列SEQ ID NO176、SEQ ID NO 177、SEQ ID NO 178、SEQ ID NO 179、SEQ IDNO 180、SEQ ID NO 181、SEQ ID NO 182、SEQ ID NO 183、SEQ ID NO 184、SEQ ID NO 185、SEQ ID NO 186、SEQ ID NO187、SEQ ID NO 188、SEQ ID NO 189、SEQ ID NO 190、SEQ IDNO 191、SEQ ID NO 192、SEQ ID NO 193、SEQ ID NO 194、SEQ ID NO 195和SEQ ID NO 196。
21.一种赋予真菌对嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的化合物的抗性的真菌细胞色素b蛋白，其中由于在编码所述蛋白的DNA中存在一个突变，而引起在所述蛋白中一个正常的甘氨酸残基被改变，所述突变发生在编码所述蛋白中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的氨基酸的三联体中一个或多个碱基的对应位置上，前提是所述蛋白不是乳柄小菇细胞色素b蛋白。
22.一种权利要求21的真菌细胞色素b蛋白，其中由于在编码所述蛋白的DNA中存在一个突变，而引起在所述蛋白中一个正常的甘氨酸残基被改变，所述突变发生在编码所述蛋白中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的氨基酸的三联体中第二位碱基的对应位置上，前提是所述蛋白不是乳柄小菇细胞色素b蛋白。
23.一种真菌细胞色素b基因中导致在所编码蛋白中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的甘氨酸残基被取代的突变的检测方法，所述方法包括鉴定真菌核酸样品中是否存在所述突变，其中任何(或一种)单核苷酸多态检测方法基于来自在编码或者野生型蛋白质或者突变型蛋白质中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的氨基酸的三联体中一个或多个碱基的对应位置的上游和/或下游约30-90个核苷酸的序列信息。
24.一种权利要求23的方法，其中任何(或一种)单核苷酸多态检测方法基于来自在编码或者野生型蛋白质或者突变型蛋白质中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的氨基酸的三联体中第二位碱基的对应位置的上游和/或下游约30-90个核苷酸的序列信息。
25.一种等位基因特异性寡核苷酸，所述寡核苷酸能够与选自以下真菌的编码野生型细胞色素b蛋白的真菌核酸序列结合葡萄生单轴霉、禾白粉菌小麦/大麦致病变种、黑麦喙孢、圆核腔菌、禾生球腔菌、Mycosphaerella fijiensis var.difformis、单丝壳、葡萄钩丝壳、禾生刺盘孢、瓜果腐霉、盘长孢状刺盘孢、番茄粉孢、鞑靼内丝白粉菌、古巴假霜霉、立枯链格孢、立枯丝核菌、Mycosphaerella musicola和落花生尾孢，其中所述寡核苷酸包含一段识别序列，所述识别序列识别一种在与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上编码甘氨酸残基的核酸序列。
26.一种等位基因特异性寡核苷酸，所述寡核苷酸能够与编码突变型细胞色素b蛋白的真菌核酸序列结合，其中所述寡核苷酸包含一段识别序列，所述识别序列识别一种在与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上编码选自以下的一种氨基酸的核酸序列精氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、色氨酸或丙氨酸。
27.一种诊断性引物或诊断性寡核苷酸，所述引物或寡核苷酸能够与包含突变型真菌细胞色素b核苷酸序列的模板结合，其中所述引物或寡核苷酸3’最后一个核苷酸对应于所述突变型真菌细胞色素b基因中存在的核苷酸，并且所述核苷酸的存在导致真菌对嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的任何其它化合物的抗性。
28.一种权利要求27的诊断性引物，其中所述引物的倒数第二个核苷酸(-2)或(-3)与所述野生型细胞色素b序列中所述相应位置中存在的核苷酸不同。
29.用于检测选自以下的真菌细胞色素b基因中G143A突变的一种或多种诊断性引物SEQ ID NO 22、SEQ ID NO 23、SEQ ID NO24、SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO 27、SEQ ID NO28、SEQ ID NO 29、SEQ ID NO 30、SEQ ID NO 31、SEQ ID NO32、SEQ ID NO 33、SEQ ID NO 34、SEQ ID NO 35、SEQ ID NO36、SEQ ID NO 37、SEQ ID NO 38、SEQ ID NO 39、SEQ ID NO40、SEQ ID NO 41和SEQ ID NO 42以及它们的衍生物，其中所述3’端的最后一个核苷酸与以上给出的序列相同，并且其中在显著影响所述诊断性引物的特性的情况下，所述其余核苷酸的至多10个、例如至多8个、6个、4个、2个、1个可以改变。
30.一种等位基因特异性寡核苷酸探针，所述探针能够检测到在所述DNA中编码所述蛋白质中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的氨基酸的三联体中一个或多个碱基的对应位置的真菌细胞色素b基因多态性。
31.一种权利要求30的等位基因特异性寡核苷酸探针，其中所述多态性位于所述DNA中编码所述蛋白质中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的氨基酸的三联体中第二位碱基的对应位置。
32.一种权利要求31的等位基因特异性寡核苷酸探针，其中所述多态性是鸟嘌呤碱基改变为胞嘧啶碱基。
33.一种诊断试剂盒，所述试剂盒包含一种或多种权利要求27-29的诊断性引物、或一种权利要求25或26的等位基因特异性寡核苷酸、或一种权利要求30-32的等位基因特异性寡核苷酸探针、核苷酸三磷酸、聚合酶和缓冲液。
34.一种检测植物致病真菌对杀真菌剂抗性的方法，所述方法包括用任何(或一种)单核苷酸多态技术检测真菌基因中的突变，其中所述突变的存在导致对于其靶蛋白由线粒体基因编码的杀真菌剂的抗性。
35.一种检测植物致病真菌对杀真菌剂抗性的方法，所述方法包括检测在PCR反应期间产生的扩增子的存在，其中所述PCR反应包括在合适的核苷酸三磷酸和一种用于聚合的试剂存在下，使包含真菌核酸的受试样品与一种引物接触，其中所述扩增子的检测与所述核酸中是否存在所述突变直接相关，其中所述突变的存在导致对于其靶蛋白由线粒体基因编码的杀真菌剂的抗性。
36.一种权利要求34或权利要求35的检测植物致病真菌对杀真菌剂抗性的方法，所述方法包括在合适的核苷酸三磷酸和用于聚合的试剂存在下，使包含真菌核酸的受试样品与存在导致杀真菌剂抗性的特定突变的诊断性引物接触，使得所述诊断性引物在所述样品中存在所述突变时得以延伸；并且根据诊断性引物延伸产物是否存在而检测所述突变是否存在。
37.一种突变频率的检测和定量方法，所述突变导致植物致病真菌对靶蛋白由线粒体基因编码的杀真菌剂的抗性，所述方法包括检测真菌基因中是否存在突变，其中所述突变的存在导致真菌对嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的任何其它化合物的抗性，所述方法包括用任何(或一种)单核苷酸多态检测技术对真菌核酸中是否存在所述突变进行鉴定和定量。
38.一种权利要求37的方法，所述方法包括检测在PCR反应期间产生的扩增子的存在，其中所述PCR反应包括在合适的核苷酸三磷酸和一种用于聚合的试剂存在下，使包含真菌核酸的受试样品与一种合适的引物接触，其中所述扩增子的检测与所述核酸中是否存在所述突变直接相关，其中所述突变的存在导致对于靶蛋白由线粒体基因编码的杀真菌剂的抗性；并且根据是否存在所述PCR反应期间所产生的扩增子而对所述突变的相对存在和不存在进行检测和定量。
39.一种权利要求37或权利要求38的方法，所述方法包括在合适的核苷酸三磷酸和一种用于聚合的试剂存在下，使包含真菌核酸的受试样品与诊断性引物接触，以检测所述核酸中导致对于靶蛋白由线粒体基因编码的杀真菌剂的杀真菌剂抗性的特定突变存在和不存在，使得与所述特定突变不存在和存在相关的所述诊断性引物在所述样品中存在所述合适真菌模板时得以延伸；并且根据是否存在诊断性引物延伸产物而对所述突变的相对存在和不存在进行检测和定量。
40.一种选择施用于作物的有效杀真菌剂及其最适施用水平的方法，所述方法包括分析能够感染所述作物的真菌样品，并且检测和/或定量来自所述真菌的基因中突变存在/和不存在，其中所述突变的存在可以导致对于靶蛋白由线粒体基因编码的杀真菌剂的抗性，然后选择有效的杀真菌剂及其最适施用水平。
41.一种权利要求40的方法，其中所述检测方法使用任何(或一种)单核苷酸多态检测技术。
42.一种权利要求40或权利要求41的方法，其中所述检测方法包括在合适的核苷酸三磷酸和用于聚合的试剂存在下，使包含真菌核酸的受试样品与所述特定突变的诊断性引物接触，使得所述诊断性引物在所述样品中存在所述突变时得以延伸；并且根据诊断性引物延伸产物是否存在而检测所述突变是否存在。
43.一种防治作物的真菌感染的方法，所述方法包括将杀真菌剂施用于所述作物，其中所述杀真菌剂根据权利要求40-42中任一项进行选择。
44.一种权利要求34-43中任一项的方法，其中所述杀真菌剂是嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的任何其它化合物。
45.一种用于检测真菌对嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的任何其它化合物的抗性的方法，所述方法包括鉴定真菌核酸中是否存在突变，其中所述突变的存在导致对嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的任何其它化合物的抗性，所述方法包括鉴定是否存在在所述DNA中编码所述细胞色素b蛋白中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的氨基酸的三联体中一个或多个碱基的对应位置上发生的单核苷酸多态性。
46.一种权利要求45的用于检测真菌对嗜球果伞素类似物抗性的方法，所述方法包括鉴定是否存在在所述DNA中编码所述细胞色素b蛋白中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的氨基酸的三联体中第二位碱基的对应位置上发生的一个单核苷酸多态性。
47.一种任一前述权利要求的方法，其中所述检测和/或定量方法基于对诊断性引物延伸产物的荧光检测。
48.一种任一前述权利要求的方法，其中所述检测方法涉及应用ScorpionTM检测系统。
49.一种权利要求34-48中任一项的方法，其中所述突变发生在所述DNA中编码所述细胞色素b蛋白中与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上的氨基酸的三联体中第二位碱基的对应位置上。
50.一种权利要求34-49中任一项的方法，其中所述突变是导致所编码蛋白质中G143A取代的鸟嘌呤变为胞嘧啶的改变，其中在与酿酒酵母细胞色素b残基143相应位置上，一个野生型甘氨酸残基被丙氨酸残基取代。
51.一种存储有任一前述权利要求中任一序列的计算机可读媒介，所述序列包括本文所述的编码突变型细胞色素b蛋白的全部或部分DNA序列或蛋白质序列，其中所述突变的存在导致真菌对嗜球果伞素类似物或同一交叉抗性组中的任何其它化合物的抗性；得自选自以下一种真菌的编码野生型细胞色素b序列的全部或部分的DNA序列或蛋白质序列葡萄生单轴霉、禾白粉菌小麦/大麦致病变种、黑麦喙孢、圆核腔菌、禾生球腔菌、苹果黑星菌、Mycosphaerella fijiensisvar.difformis、单丝壳、葡萄钩丝壳、禾生刺盘孢、瓜果腐霉、盘长孢状刺盘孢、番茄粉孢、Magnaporthe grisea、致病疫霉、鞑靼内丝白粉菌、古巴假霜霉、立枯链格孢、立枯丝核菌、Mycosphaerellamusicola和落花生尾孢；或按照任一权利要求的任何等位基因特异性寡核苷酸、等位基因特异性引物、等位基因特异性寡核苷酸引物、共用引物或诊断性引物。
52.一种诊断试剂盒，所述诊断试剂盒用于权利要求1-13、21或34-50中任一项的方法。
53.一种权利要求52的诊断试剂盒，所述试剂盒包含一种或多种以下组分诊断性寡核苷酸引物、野生型寡核苷酸引物、对照寡核苷酸引物和/或共用寡核苷酸引物、等位基因特异性寡核苷酸探针、合适的核苷酸三磷酸例如dATP、dCTP、dGTP、dTTP、一种合适的聚合酶和一种缓冲液。
全文摘要
本发明公开了对于检测线粒体所编码基因(例如细胞色素b基因)中低频率突变特别灵敏的方法、使这些方法成为筛选用于产生杀真菌抗性植物致病真菌的特别有用并且在商业上重要的方法,其中所述抗性是由于线粒体所编码基因中的突变引起的。所公开的方法包括单核苷酸多态检测技术,特别是PCR检测方法。也公开了许多植物致病真菌的编码野生型和突变型细胞色素b序列部分的DNA序列以及应用所述序列信息检测导致杀真菌剂抗性的突变。也公开了等位基因特异性寡核苷酸和寡核苷酸探针、诊断性引物和诊断试剂盒。
文档编号C12N9/02GK1359425SQ0080981
公开日2002年7月17日 申请日期2000年4月26日 优先权日1999年4月30日
发明者J·D·温达斯, S·P·赫尼, A·伦维克, D·M·怀特坎贝, S·利特勒, N·J·吉布森, J·特克, C·P·斯坦格尔 申请人:曾尼卡有限公司