专利名称：细菌集合体ebc1000及用该细菌集合体ebc1000对工业废水、废物和土壤中含有的难分解 ...的制作方法
通过使用物理或化学的方法如焚烧、垃圾掩埋法、化学制品、电解、膜分离或其它类似的方法，尝试处理通常倒入海里的工业废水或有害废物中的难分解有毒物质。但这些传统方法存在经济上和环境上的问题。而生物学处理方法是满足环境学、卫生学、生态学和经济学各方面要求的最有效，最安全的方法。已对生物学方法进行了许多研究，如在河口处使用自然生态系统，如淤泥。但这些方法不能解决大量工业废物的处理问题。
本发明涉及一种新型细菌集合体EBC1000及一种用该细菌集合体EBC1000对包含于工业废水，废物，土壤或类似物中的难分解有毒化学物质和含氯化合物进行生物处理的方法。更具体说，本发明涉及一种新型的细菌集合体EBC1000，它能够显著降解高浓度含氯化合物及从土壤和废水中分离的、CODMn为20,000到100,000ppm的废酸性或废碱性难分解有毒化学物质，如倒入海里的制药工业废水中的化学物质，例如连二亚硫酸钠、丁二烯、烷基芳基萘磺酸钠、丙烯氰、乙二胺四乙酸四钠二水合物、七水硫酸铁、叔十二烷基硫醇、对甲烷氢过氧化物、N-二乙基羟基胺和CH3CN。
本发明人分离到一种新型的细菌集合体EBC1000(KCTC 0652 BP)，它具有快速降解包含在准备倒入海里的土壤和废水中的高浓度的难分解废物及含氯化合物的特性，所用的土壤和废水是在韩国蔚山工业厂区和石化工业厂区收集的。细菌集合体EBC1000包括9株菌，每株均有降解难分解废物的能力。而且发现细菌集合体EBC1000以一种好氧方式降解准备倒入海里的、制药和石油工业废水中的、化学耗氧量(CODMn)为20,000到100,000ppm的废酸性或废碱性难分解废物，7天内可降解80％，10天内可降解90％，240小时内可降解至少80％到90％。包含在制药工业废水中的废酸性或碱性(例如pH 3或pH 14)难分解废物的例子包括异丙醇(IPA，10,000到20,000ppm)，亚甲基氯(MC，100到7,000ppm)，NaOH(可变(changeable))，硫酸钠(可变)，二甲胺(DMA，70到2,500ppm)、甲醇(MeOH，27,000到54,000ppm)，有机物和抗生素残余物(40,000到100,000ppm)及氯离子(4,000到33,000ppm)。包含在石油工业废水中的废酸性或碱性(例如pH 1.2，3.0或5.0)难分解废物的例子包括连二亚硫酸钠(SHS，(NaSO2)2，30ppm)，丁二烯(BD，可变)，烷基芳基萘磺酸钠(Tamol-SN，4,000到20,000ppm)，丙烯氰(AN，可变)，乙二胺四乙酸四钠二水合物(EDTA，20到200ppm)，七水硫酸铁(FES，60ppm)、叔十二烷基硫醇(TDDM，4,000ppm)，对甲烷氢过氧化物(PMH，400ppm)、N-二乙基羟基胺(DEHA，200ppm)和CH3CN(可变)。
因此，本发明提供一种新型的可降解难分解有毒化学物质和含氯化合物的细菌集合体EBC1000，及一种用该细菌集合体EBC1000对污染工业废水，废物和土壤的难分解有毒化学物质和含氯化合物进行生物处理的方法。
发明的优选实施方案下面对分离，鉴定和测定新型细菌集合体EBC1000活性进行描述。
1.分离新型细菌集合体EBC1000(1)从样品的振荡培养物中分离40株菌。
将取自蔚山工业厂区的土壤(1克)和废水(10毫升)接种到废酸性和碱性废物液体培养基(制备如下K2PO4(0.65g)，KH2PO4(0.17g)，MgSO4(0.1g)，NaNO3(0.5g)及10％制药和石油工业废液中包含难分解化学物质的废酸性和碱性废水，溶于1升去离子水中，pH 0到14)和含氯化合物液体培养基(制备如下K2PO4(0.65g)，KH2PO4(0.17g)，MgSO4(0.1g)，NaNO3(0.5g)及五氯苯酚(PCP，50ppm)，溶于1升去离子水中，pH7.2)中，然后在20到30℃振荡培养5天以上。
收集1毫升振荡培养物并接种到废弃的酸性或废弃的碱性固体培养基(制备如下在废弃的酸性或碱性液体培养基中仅加入1.5％琼脂，pH7.0)及含氯化合物固体培养基(制备如下在含氯化合物液体培养基中加入20毫克BTB和1.5％琼脂)中，然后在20到30℃振荡培养10天。
将分离到的每个纯菌落进一步接种到上述培养基中，然后振荡培养，这样分离到40株有用的细菌，它们各自形成不同的菌落形式，而且连续转接培养后有相同的菌落。
(2)将步骤(1)中分离到的细菌在浓度递增的难分解废水培养基中进行培养，从而分离出9株能力更高的菌株。
步骤(1)中分离到的细菌各自顺次接种到基本培养基中，该培养基包含50％粗废水和80％含有制药和石油废水中的难分解化学物质的废水，及包含500ppm五氯苯酚化合物，然后重复步骤(1)中同样的流程，这样分离到9株可生长在含有更高含量难分解化学物质的废水中的，能力更高的菌株。
这9株细菌，分别被命名为EBC100，EBC101，EBC103，EBC104，EBC105，EBC106，EBC107，EBC108和EBC109，组成一个名为“EBC1000”的细菌集合体。
该新型的细菌集合体EBC1000于1999年8月12日保藏在韩国生物科学与生物技术研究所的韩国典型培养物保藏中心，保藏号为KCTC 0652BP。
2.细菌集合体EBC1000生长条件的优化在Luria-Bertani营养培养基(在1升去离子水中含有10克细菌用胰蛋白胨，5克细菌用酵母培养物及10克氯化钠)中、pH 5到8、25到35℃、50到100rpm/min振荡培养24到48小时，细菌集合体EBC1000生长最好。在同样的条件下，细菌集合体EBC1000连续转接培养后，生长也很好。
3.鉴定细菌集合体EBC1000被命名为EBC100、EBC101、EBC103、EBC104、EBC105、EBC106、EBC107、EBC108和EBC109的组成细菌集合体EBC1000的各株细菌，是革兰氏阴性和阳性细菌的混合物，并有不同的形状和大小。当在Luria-Bertani培养基中培养24小时后，EBC100形成一直径1毫米的圆形菌落，EBC101形成一大的直径约2毫米的圆形菌落，EBC103形成一厚的直径约2毫米的圆形菌落，EBC104和EBC105形成一小的直径约0.5毫米的圆形菌落，EBC106形成一厚的直径约3毫米的圆形菌落，EBC107形成一直径约1.2毫米的褐色菌落，EBC108形成一直径约1毫米的黄色菌落，EBC109形成一直径约2毫米的双环菌落，这9株菌均为好氧的通气的细菌。EBC100，EBC101，EBC103，EBC106，EBC107和EBC108在pH 3到4的强酸条件下和pH 9到11的强碱条件下均有较高的成活性。EBC104，EBC105和EBC109生长较慢，而EBC100，EBC104，EBC105和EBC109表现出运动性。
关于细菌集合体EBC1000中各组成株的属的描述如下EBC100，EBC101和EBC103是克雷伯氏菌属的菌株，EBC105是普罗威登斯菌属的菌株，EBC104和EBC109是埃希氏菌属的菌株，EBC106是芽孢杆菌属的菌株，EBC107是革兰氏阴性菌，EBC108是革兰氏阳性菌。
各菌株的特征列于表1和2中。
此外，每个菌株都通过气相色谱对脂肪酸甲酯(FAMEs)进行了分析。
FAMEs的测定是用Hewlett Packard系列II的色谱模型S890A(Micorbial ID.Inc.，Delaware，USA)进行的，它具有一个25cm×0.22mm×0.33的色谱分离柱，如用甲基苯基硅胶融合的毛细管气相色谱柱(HP 19091 B-102)。
气相色谱是在以下条件下进行的载气为氢气，柱头压为10psi，分流比为100∶1，分流流量为50ml/min，隔片净化流量为5ml/min，FID(火焰电离检测器)氢气流量为30ml/min，FID氮气流量为30ml/min，FID空气流量为30ml/min，起始温度为170℃，程序升温速度为5℃/min，最终温度为270℃，FID检测器温度为300℃，进样口温度为250℃，进样体积为2微升。
利用微生物鉴定系统软件(Microbial ID，Inc.，Delaware，USA)获得FAME图谱。通过与标准校准混合物比较及测定持留时间，峰区域和峰的百分比可以对色谱峰进行鉴定。
通过对EBC100，EBC101和EBC103三株菌分别进行FAMEs测定，发现它们的胞内脂肪酸组成如下EBC100为C120，C140，C160，C161，C170 cyclo，C140 3OH；EBC101为C120，C140，C150，C160，C170cyclo，C140 3OH；EBC103为C140，C150，C160，C170 cyclo，C1403OH。
4.分离细菌集合体EBC1000的组成菌株通过以下流程从细菌集合体EBC1000分离单个菌株。
当培养在Luria-Bertani固体琼脂营养培养基(在950毫升去离子水中含有10克细菌用蛋白胨，5克细菌用酵母培养物，10克氯化钠及1.5％琼脂)中，EBC106(Bacillus)的特征为形成厚的Bacillus特定的皱褶，EBC107(革兰氏阴性菌)形成褐色菌落，EBC108(革兰氏阳性菌)形成黄色菌落。
对于其它菌株，可通过将细菌集合体EBC1000稀释涂布在去氧胆酸盐琼脂上对其菌落进行鉴定，该去氧胆酸盐琼脂是在1升去离子水中含10克细菌用蛋白胨，10克细菌用乳糖，1克去氧胆酸钠，5克氯化钠，2克磷酸氢二钾，1克柠檬酸铁，1克柠檬酸钠，15克细菌用琼脂及0.03克中性红(Difco manual，1984)。当在去氧胆酸盐琼脂上培养24小时后，EBC100，EBC101和EBC103形成有黏度的红白斑，且其大小略有不同，EBC104形成无黏度的红白斑，EBC105形成有黏度的褐色斑，EBC106和EBC107形成有黏度的淡褐色斑，EBC108形成有黏度的无色斑，EBC109形成有黏度的红色斑(参考Dictionary of Microbiology and MolecularBiology，2nd，Paul Singleton Dian Sainsbury，1987)。
5.细菌集合体EBC1000的特征(1)细菌集合体EBC1000对烷基芳基萘磺酸钠(Tamol-SN)的降解速度将浓度递增的500ppm、1000ppm、2000ppm和4000ppm Tamol-SN加入到基本培养基中(pH7.2)，该培养基的制备是将0.065g K2HPO4、0.017gKH2PO4、0.1g MgSO4和0.5g NaNO3溶于1升去离子水中而得到的。接种细菌集合体EBC1000后，通过消逝时间测定Tamol-SN的浓度和吸收值，结果列于表3中。
如表3所示，当Tamol-SN的浓度为500ppm时，Tamol-SN每小时的降解速度为1.3mg/l/h，当Tamol-SN的浓度为4000ppm时，降解速度为4.0mg/l/h。
(2)细菌集合体EBC1000对五氯苯酚化合物的降解速度将浓度递增的200ppm，500ppm，1000ppm和2000ppm五氯苯酚化合物加入到培养基中，该培养基的制备是将20mg BTB溶解在(1)中所描述的基本培养基中。接种细菌集合体EBC1000后，每小时测定五氯苯酚的浓度和吸收值，结果列于表4中。
6.用细菌集合体EBC1000处理难分解工业废水实验例1用细菌集合体EBC1000处理包含在石油工业废水中的难分解特殊乳化剂。
将1％石油加工厂所用的，典型的难分解化学物质烷基芳基萘磺酸钠(Tamol-SN)的粗液加入到50ml基本培养基(pH7.2)中，该培养基的制备是将0.065g K2HPO4、0.017g KH2PO4、0.1g MgSO4和0.5g NaNO3溶于1升去离子水中而得到的。接种2.0×104/ml细菌集合体EBC1000后，在25到30℃，100rpm振荡培养10天。结果列于表5中。
如表5所示，培养4天后，Tamol-SN的浓度为850ppm，细菌数为2.5×107CFU/ml。
实验例2用细菌集合体EBC1000处理石油加工厂中难分解粗废水。
从蔚山工业厂区石油加工厂中收集准备倒入海里的，废弃的酸性和碱性难分解废水。该废水包含4000ppm烷基芳基萘磺酸钠(Tamol-SN)，连二亚硫酸钠[(NaSO2)2]，丁二烯(BD)、丙烯氰(AN)、乙二胺四乙酸四钠二水合物(EDTA)、七水硫酸铁(FES)、叔十二烷基硫醇(TDDM)、对甲烷氢过氧化物(PMH)、N-二乙基羟基胺(DEHA)和CH3CN等。将1.2×107/ml细菌集合体EBC1000接种到200ml粗废液中，25到30℃，80rpm振荡培养10天。结果列于表6中。
如表6所示，培养10天后，粗废液的COD值降到750ppm，降解效率为80％。TOC和BOD值和COD值一样，有一个下降的趋势，而且细菌数至少增加100倍，达到5.1×109CFU/ml。
本发明的实验例中所用的分析方法如下所述，作为参考1)COD(Mn)分析化学耗氧量(COD)是根据正式的水污染和废物处理检测方法(OfficialNo.1993-42，the Ministry of Environment)及标准方法(APHA，AWWA，WPCF，18thed.)通过COD Mn方法进行测定。向水浴中加入硫酸和0.025NKMNO4后，加入10ml准备倒入海里的粗废液或废物质，及有害物质用微生物降解处理后的废水，加热到100℃，保持30分钟。然后加入0.025NNa2C2O4，用KMNO4滴定混合物，以测定COD的实际消耗。
2)BOD分析生物耗氧量(BOD)的测定是根据正式的水污染和废物处理检测方法及标准方法，在20℃生物反应5天后测定消耗的溶解氧的量。
3)TOC分析根据标准方法，将粗废物，废水和不同时间的取样进行离心，用TOC分析仪(TOC-5000 A，Shimadzu com.)分析所得的上清液中总有机碳(TOC)的含量。
4)CFU检验根据细菌检验的标准方法，通过平板计数法分析集合体中的天然细菌和处理后的各接种样品。测定试验开始时细菌的生长和有害物质降解的消耗时间。
5)提取和分析含氯化合物按照韩国专利No.154295或韩国专利申请No.98-20706的内容及本发明人的文献(Journal of Applied Microbiology 85-1-1-8，1998；Journal of KoreaSoil Environment Sociey，1-1-39-46，1996)，提取和分析含氯化合物。
实验例3用细菌集合体EBC1000处理制药加工厂中难分解废水。
收集蔚山工业厂区和中北部地区制药加工厂中准备倒入海里的，废弃的酸性和碱性难分解废水。该废水包含药品残余物及异丙醇(IPA)、亚甲基氯(MC)、氢氧化钠、硫酸钠、二甲胺(DMA)和甲醇，它们的CODMn值较高，在20,000ppm到10,000ppm。在每200ml废水中接种2.0×107/ml细菌集合体EBC1000，20到25℃，通风培养14天。结果列于表7中。
如表7所示，培养10天后，粗废水的COD值降到4000ppm，降解效率为90％。TOC和BOD值和COD值一样，也有一个下降的趋势，而且细菌数至少增加1000倍，达到1.6×1010CFU/ml。
7.对被含氯化合物污染的土壤和木材的检验实验例4用细菌集合体EBC1000处理被含氯化合物污染的土壤。
将600g被五氯苯酚化合物(PCP)污染的土壤分散到5升自来水中，持续分散1天，然后加到一个盛泥浆的装置中。与Bu34菌株+11株降解菌(一株韩国专利申请No.98-20706所介绍的菌株Bu1和10株可降解五氯苯酚的未鉴定菌株)+1株天然的未鉴定菌株(通过相对比较分离而得，考虑到天然菌株的分布，作为除降解株之外的对照)对五氯苯酚化合物的降解效率相比较，该新型的细菌集合体EBC1000表现出稍高的降解效率，如表8所示。例如，培养14天后，Bu34菌株降解含氯化合物的效率为96％，而细菌集合体EBC1000的效率为98％。
实验例5将每5g废弃木材的碎片和锯屑加入到65ml基本培养基中，接种EBC1000，然后在30℃，90到100rpm振荡培养90小时。结果列于表9中。如表9所示，接种培养80小时后，五氯苯酚(PCP)的降解效率为98％，EBC1000的细菌数目增加100倍。
实验例6将200g废弃木材的锯屑加入到250ml基本液体培养基中，接种2.0×108/g(木材)的EBC1000，然后将湿气和菌株加到锯屑中，混合物在室温下放置200天(参考“composting Method”，McBain etal.，Biodegradation 6，47-55，1995)。结果列于表10中。如表10所示，新型细菌集合体EBC1000在更短的时间内表现出比Bu1或Bu34更高的降解效率。
从上面的实验例可看出，新型细菌集合体EBC1000可用来有效降解含氯化合物和包含在准备倒入海里的废水中的，高浓度的难降解有毒化学物质。
8.通过EBC1000中单个组成菌株对难分解废水[COD(Mn方法)]和五氯苯酚化合物进行降解的分析实验将分离到的EBC100、EBC101、EBC103、EBC104、EBC105、EBC106、EBC107、EBC108和EBC109的纯菌落接种到20ml废酸性或碱性废水液体培养基(制备如下用1升去离子水稀释10％废酸性和碱性废水，并包含0.65g K2PO4、0.17g KH2PO4、0.1g MgSO4、0.5g NaNO3及制药和石油工业废水中难分解化学物质，pH 0到14)和20ml含氯化合物液体培养基(制备如下0.65g K2PO4，0.17g KH2PO4，0.1g MgSO4，0.5g NaNO3及50ppm五氯苯酚，溶于1升去离子水中，pH7.2)中。在20到30℃振荡培养10天以上，测定COD值和PCP浓度。结果如下，平均来说，EBC100使COD和PCP浓度降低85％，EBC101和EBC103使COD和PCP浓度降低67％，EBC106，EBC107和EBC108使COD和PCP浓度降低50到55％，EBC104，EBC5和EBC109使COD和PCP浓度降低约20％。结果表明，细菌集合体EBC1000中的单个组成菌株具有降解难分解有毒化学物质和含氯化合物的能力，但细菌集合体EBC1000比单个的组成菌株有更高的生长量和更高的降解效率。
如上所述，新型的细菌集合体EBC1000具有快速降解包含在准备倒入海里的工业废水和有害废物中的高浓度难分解化学物质，及纯化被含氯化合物污染的土壤、木材、地表水和地下水的能力，从而可很好地预防和修复环境污染。
另外，细菌集合体EBC1000可通过通气方式用于处理准备倒入海里的高浓度难分解废物，或被含氯化合物污染的土壤、木材、地表水和地下水，并可以回收被污染的木材。本发明还提供一种用于回收被污染的木材或土壤的假单胞菌Bu34菌株(韩国专利No.154295)和克雷伯氏菌属的Bu1菌株(韩国专利申请No.98-20706)的混合物。
权利要求
1.一种细菌集合体EBC1000(KCTC0652 BP)，其在Luria-Bertani营养培养基上、pH 5到8、温度25到35℃、振荡50-100rpm/min的条件下培养24到48小时，最适于生长，其中所述Luria-Bertani营养培养基是指在1升去离子水中含有10克细菌用胰蛋白胨，5克细菌用酵母培养物及10克氯化钠的培养基，细菌集合体EBC1000在相同条件下连续转接培养，生长很好。
2.一种用细菌集合体EBC1000处理准备倒入海里的制药或石油工业废水中含有的废酸或碱性难分解有毒化学物质、或含氯化合物的方法，其中制药工业废水所含有的难分解有毒化学物质包括异丙醇，亚甲基氯，NaOH，硫酸钠，二甲胺和甲醇，石油工业废水中所含有的难分解有毒化学物质包括连二亚硫酸钠[(NaSO2)2]，丁二烯，烷基芳基萘磺酸钠，丙烯氰，乙二胺四乙酸四钠二水合物，七水硫酸铁、叔十二烷基硫醇，对甲烷氢过氧化物、N-二乙基羟基胺和CH3CN，含氯化合物包括五氯苯酚(PCP)。
3.如权利要求1中所要求的细菌集合体EBC1000，其包含克雷伯氏菌属的一种菌株EBC100。
4.如权利要求1中所要求的细菌集合体EBC1000，其包含克雷伯氏菌属的一种菌株EBC101。
5.如权利要求1中所要求的细菌集合体EBC1000，其包含克雷伯氏菌属的一种菌株EBC103。
6.如权利要求1中所要求的细菌集合体EBC1000，其包含埃希氏菌属的一种菌株EBC104。
7.如权利要求1中所要求的细菌集合体EBC1000，其包含普罗威登斯菌属的一种菌株EBC105。
8.如权利要求1中所要求的细菌集合体EBC1000，其包含埃希氏菌属的一种菌株EBC109。
9.如权利要求2中所要求的方法，其中细菌集合体EBC1000包含克雷伯氏菌属的一种菌株EBC100。
10.如权利要求2中所要求的方法，其中细菌集合体EBC1000包含克雷伯氏菌属的一种菌株EBC101。
11.如权利要求2中所要求的方法，其中细菌集合体EBC1000包含克雷伯氏菌属的一种菌株EBC103。
12.如权利要求2中所要求的方法，其中细菌集合体EBC1000包含埃希氏菌属的一种菌株EBC104。
13.如权利要求2中所要求的方法，其中细菌集合体EBC1000包含普罗威登斯菌属的一种菌株EBC105。
14.如权利要求2中所要求的方法，其中细菌集合体EBC1000包含埃希氏菌属的一种菌株EBC109。
全文摘要
本发明涉及一种新型细菌集合体EBC1000(KCTC 0652 BP)和一种用该细菌集合体EBC1000对含氯化合物及包含在工业废水、废物和土壤中的难分解有毒化学物质进行生物处理的方法。新型细菌集合体EBC1000(KCTC 0652 BP)由易培养的好氧细菌组成,可用于降解含氯化合物和包含在工业废物中的,高浓度的废弃的酸性或碱性难分解有毒化学物质,如IPA,MC,DMA,AN,SHS,BD,Tamol－SN,EDTA,FES,TDDM,PMH,DEHA,MeOH,NaOH和CH
文档编号C12R1/01GK1370227SQ00811835
公开日2002年9月18日 申请日期2000年7月11日 优先权日1999年8月20日
发明者李性器 申请人:李性器