专利名称：具有特异结合性质的β－折叠蛋白质的设计的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有新的或改变的特异结合性质或者新的或改变的催化活性或者新的或改变的荧光性质的新的β-折叠蛋白质，并且还涉及以这样一种方法改进制备蛋白质的方法。
在人和兽医治疗诊断和监测的很多领域使用抗体及其衍生物。使用天然存在的抗体的一个问题是其制备。仍然在动物细胞培养系统中生产抗体，这是一个成本非常高的方法。在一些应用中，例如，融合蛋白的制备或者要求快速血液清除率和好的组织穿透性的治疗用途，天然存在的抗体分子的大小代表另一个问题(Colcher等，1998)。重组抗体分子例如scFvs(Bird等，1988)，小抗体(Pack和Plückthun，1992)或者双特异性抗体(Holliger和Winter，1993)主要只是由抗体的抗原结合区(VH和VL)组成。由于它们的长度显著降低，它们表现出改善的组织穿透性，并且与完整的抗体相比它们更适合与其它蛋白质融合。与后者相比，尽管重组抗体片段常常更不稳定，但是由于形成二硫键，所以它们具有低的亲合性并且难以以重组体形式制备。重组抗体片段的稳定和改进亲和性的方法其中包括测试各种接头多肽并且引入二硫键(Glockshuber等，1990，Cumber等，1992，Brinkmann，1997)。
接头肽的序列和长度能影响抗蛋白酶的稳定性和抗体片段的亲和性(Pantoliano等，1991)。向可变区的保守构架区引入另外的二硫键能导致对热(Young等，1995)和变性剂的提高的抗性并且导致异源表达产率提高。但是，一般情况下，很多scFvs表现出低稳定性并且趋向于在37℃就已经凝聚。通过使用常规的能够导入新的不稳定突变的Fv-片段克隆引物也可能导致不稳定性。通过输出到壁膜间隙中主要在细菌体系中产生抗体片段，优化确定的氧化还原态和同步表达折叠辅助因子在这里也是可能的。
本发明的一个目的是提供具有新的或改变的结合性质例如抗体样性质，但是，同时，不表现出完整或重组抗体分子的上述缺点的新的蛋白质。
本发明的进一步目的是提供表现出新的或改变的酶学性质或催化性质的蛋白质。
本发明的再一个目的是形成上述蛋白质的制备方法。
通过具有权利要求1特征的蛋白质实现上述目的。制备本发明的蛋白质的方法是权利要求21。本发明的优选实施方案见从属权利要求和下面的说明书。
β-折叠蛋白质的表面的改变产生以前蛋白质中不存在的新的结合性质。通过诱变β-折叠区产生这些结合性质。除了从头结合性质外，该新的β-折叠蛋白质就结构和稳定性来说类似于起始蛋白质。用于设计新的结合分子的起始蛋白质是具有优势β-折叠结构的蛋白质，例如，Y-结晶，眼晶状体结构蛋白。根据结晶结构，通过例如计算机方法，选择暴露在表面上并且因此可接触溶剂或可能的结合配偶体的该起始蛋白质的β-折叠区和氨基酸。使用基因工程方法在编码起始蛋白质的基因中诱变这些区或氨基酸位置。因此，在DNA水平制备多种编码不同的β-折叠蛋白质突变体的突变基因(库或文库)。借助合适的筛选系统，例如噬菌体展示系统，分离具有新的期望的结合性质的突变体。在噬菌体展示中，所有制备的蛋白质突变体都暴露在噬菌体表面(噬菌体展示文库)。对这些重组噬菌体研究它们与期望的靶分子的结合。通过反复筛选浓缩并分离与靶分子特异性结合的在它们的β-折叠突变体表面上暴露的噬菌体。从噬菌体获得编码结合β-折叠突变体的基因并且在合适的表达系统例如大肠杆菌中表达。使用描述的方法出人意料地可能从不具有特异性结合性质的β-折叠蛋白质制备特异性结合蛋白质，并且通过应用合适的筛选方法从该文库分离具有期望的特异性的突变体。根据起始蛋白质的性质，用所述系统产生的β-折叠突变体具有关于大小，稳定性和在异源的优选细菌系统中产生功能活性等方面与例如抗体和重组抗体片段相比有优点。该新的β-折叠突变体的这些改进的性质使其可能代替例如抗体，催化抗体的重组抗体片段，并且开辟了完全新的应用领域。
例如，通过设计蛋白质能够根据本发明解决如上所述使用抗体的问题，所述设计的蛋白质各自具有特异结合性质和抗低pH，变性剂和高温度的高稳定性，即其耐受抗体在那些条件下不稳定的条件。但是，产生具有β-折叠结构和抗体样结合性质的蛋白质只是本发明应用领域的一种可能性。例如，通过产生具有新的催化性质例如阻抗性质和荧光性质的β-折叠蛋白质开放了另一种可能的应用。荧光性质能够被改变的蛋白质的一个例子是GFP。天然高度稳定的小蛋白特别适合用于设计。根据本发明在保持其稳定下产生其表面的改变，例如使蛋白质有新的特异结合性质。
举例来说，根据本发明挑选的可能的一类稳定的蛋白质是结晶体。属于眼晶状体结构蛋白质的结晶体通常不经细胞代谢，因此，也具有非常不一般的稳定性(Mandal等，1987，Rudolph等，1990)。γ-结晶，脊椎动物中的一类结晶体，是分子量大约是22kDa的单体蛋白质。γ-结晶的主要结构基元是反平行β-折叠(Hazes和Hol，1992，Richardson等，1992，Hemmingsen等，1994)。γ-结晶由两个非常相似的球形区N-和C-末端区组成，这两个区通过V-型接头肽相互连接。γ-结晶的折叠模式特征(”greek-key“基元Slingsby，1985，Wistow和Piatigorsky，1988)最可能是考虑热稳定性和抗变性剂稳定性的原因(Mandal等，1987)。来自小牛眼的γ-II-结晶是大小为21kDa蛋白质，不寻常地具有若干(7)半胱氨酸，它们在生理条件下处于还原态。
在其正常折叠状态下，凡是γ-II-结晶都没有结合性质。本发明在由β-折叠结构基元组成的该蛋白质的选择的溶剂暴露区进行的改变(诱变)令人惊奇地导致该蛋白质的表面结构和电荷模式的变化，因此导致新的结合性质的产生。与此相联系，只在保持该蛋白质结构中作用不明显的区或氨基酸位置进行反应。对小β-折叠蛋白质的诱变(Riddle等，1997)已经表明，高百分比的蛋白质能正确形成天然β-折叠结构，尽管在该序列中有相当的变化。
对于重组抗体片段(Nissim等，1994，Kruif等，1995)，对于具有确定结合性质的蛋白质(受体，抑制蛋白，DNA0结合蛋白)和对于肽库(Cortese等，1995，Haaparanta和Huse 1995，McConell等，1996)已经存在目的在于分离具有改进的或新的结合性质的分子的诱变特定蛋白质区的努力。在抗体的情况下，只诱变作为环区存在的抗原结合区。在大多数其它蛋白质例如tendamistat(McConell和Hoess，1995)或细胞色素b562(Ku和Schultz，1995)的情况下也是如此。这里还诱变环状区。A-螺旋中诱变的例子是蛋白质A的Z-区(Nord等，1997)和锌指蛋白结构域CP-1(Choo和Klug，1995)。先前的诱变只是改变结合的特异性并且总是从具有已经确定的结合性质的蛋白质起始。从来不使用没有结合性质的蛋白质，也没有使用特异改变的β-折叠结构基元。在这里描述的方法中，第一次在没有任何结合性质的蛋白质的刚性β-折叠区中进行特异性诱变。这出人意料地导致与抗体分子相比具有相当稳定性和特异结合性质的蛋白质。
用于分离具有从头结合性质的诱变的β-折叠蛋白质的合适的系统是噬菌体展示系统。该系统使得可能非常有效地对大量所有组成成分蛋白质变体筛选特异结合性质(Smith，1985)。与此相关，蛋白质变体在各种情况下存在于丝状噬菌体的表面上并且能够与固相上固定的靶分子相互作用。通过洗脱噬菌体能够获得结合靶分子的蛋白质。分离噬菌体DNA之后，可以测定特异性结合蛋白质变体的DNA序列。除了噬菌体展示系统外，也可以应用其它筛选系统，例如细菌表面展示(Stahl和Uhlen，1997)或者核糖体展示(Hanes等，1997)。
应用上述本发明，令人惊奇地通过在表面上β-折叠中定向定点诱变能改变例如非常稳定的β-折叠蛋白γ-II-结晶，这样从非结合蛋白质产生具有特异结合性质的蛋白质。将八个氨基酸位置随机化这样第一次导致蛋白质的相对刚性区内支架分子中的诱变。这样从β-折叠蛋白γ-II-结晶制备就其特异结合性质来说是“抗体样”的蛋白物质。γ-II-结晶或者其它小的稳定的β-折叠蛋白一般能在所述方法中用作用于设计新的结合性质的新的支架分子。该模型化β-折叠蛋白质在各种应用中能代替例如重组抗体。由于它们的大小相对较小(20kDa)，它们适合作为其它功能蛋白质的融合配偶体(多功能蛋白质的制备)。进一步可能的应用是在基因治疗中，其中它们可以被用作基因治疗载体细胞特异性定向和细胞内免疫的模型。此外，可以在酶应用领域使用具有催化性质的β-折叠突变体。该新的结合蛋白的稳定性使得可能有另外的现在使用重组抗体不能进行的应用，例如对人和兽医医学诊断和治疗中和在生物传感器和生物分离方法中。其它应用领域一般是制药和化妆业以及有害物质的分析和去除。
下文中，描述本发明的一些优选的实施方案。
根据本发明，筛选用来诱变的具有β-折叠结构的蛋白质即没有结合性质也没有催化或酶活性或荧光性质，或者它们的活性，荧光性质或结合性质是期望如此改变的，特别是改进。
具有β-折叠结构的蛋白质是已知的。一类具有β-折叠的蛋白质的例子是结晶体，特别是α-，β-和γ-结晶。原则上能使用来自几乎所有类型的动物的结晶体，例如来自脊椎动物，啮齿动物，鸟类和鱼。具有β-折叠结构并且根据本发明能被诱变的蛋白质的其它例子是内孢囊素，热激蛋白，冷激蛋白，β-螺旋蛋白，lipocalins，certins或转录因子，纤连蛋白，GFP，NGF，tendamistat或溶菌酶。例如，根据本发明诱变具有β-折叠结构的所述蛋白质例如结晶体的各亚基或区。
结晶体中，特别优选提到的必需由γ结晶组成，其能根据本发明以举例的方式证明那个β-折叠结构可以被修饰，即诱变，因此形成与例如抗体分子可比的新的特异结合性质或者新的催化活性。γ-结晶的例子是γ-II-结晶。
其中在下面文献中可以发现β-螺旋蛋白质的例子Jenkins J.等，结构生物学杂志(J.Struct.Biol.)1998，122(1-2)236-46，Pickersgill，R.等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)1998，273(38)，24600-4和Raetz C.R.等，科学(Science)1995，270(5238)，997-1000。
β-折叠结构定义为基本上折叠样的和几乎完全平面的。与多肽链的连续形成的α-螺旋相反，β-折叠可以由多肽链的各个区组成。这使得在一级结构中相对较远的区有可能位置直接相邻。β-链长度一般是5-10个氨基酸并且几乎完全是平面的。β-链彼此是如此之近，以至可在各条链的C＝O和NH基团之间形成氢键，反之亦然。β-折叠可以由多条链组成并且具有折叠样结构。C-α原子交替位于该折叠样平面之上或之下。氨基酸侧链也依此模式并且因此交替向上和向下。根据β-链的取向，平行和反平行折叠之间是截然不同的。根据本发明，两者都可以诱变并且用来制备权利要求的蛋白质。
对于β-折叠结构的诱变，选择那些与该平面接近的该蛋白质中的β-折叠区。在可获得的X-射线结晶结构的基础上可以鉴定表面上暴露的氨基酸。如果不可获得结晶结构，利用计算机分析能试图预测平面上暴露的β-折叠区，并且在可获得的一级结构的基础上(www.embl-heidelberg.de/predictprotein/predictprotein.html)或者在3D蛋白质结构模拟的基础上(www.expasy.ch/swissmo/SWISS-MODEL.html)预测各氨基酸位置的可能性，从而获得关于该表面上暴露的氨基酸的可能的信息。
但是，不经费时地预选要诱变的氨基酸位置，也可能诱变β-折叠。编码β-折叠结构的那些DNA区被从它们的DNA环境分离出来，对之进行随机诱变并且接着重新整合到先前从中取出它们的编码该蛋白质的DNA中。这之后是筛选具有期望的结合性质和/或催化性质和/或荧光性质的突变体的方法。
在本发明的另一个实施方案中，正如上文已经描述的，选择接近表面的β-折叠区，并且在这些选择的区内鉴定要诱变的氨基酸位置。然后在DNA水平上诱变用这种方法选择的这些氨基酸位置，或者通过定向，即编码不同的预先选择的特定氨基酸的密码子置换编码特定氨基酸的密码子，或者该变化在要改变的氨基酸位置被确定的随机诱变的构架中进行，而不是编码该新的迄今为止没有确定的氨基酸的密码子。
该表面上暴露的氨基酸可接触周围的溶剂。如果蛋白质中这种氨基酸可接触性与模型三肽Gly-X-Gly中氨基酸的可接触性相比超过8％，这些氨基酸就称为该表面上暴露的氨基酸。这些蛋白质区或各氨基酸位置也是优选的要根据本发明筛选的可能的结合配偶体的结合位点。所述结合配偶体可以是，例如，抗原或底物或底物过渡态类似物。
根据本发明，基本上能诱变所有的位于表面上展示β-折叠结构并且可接触溶剂或结合配偶体的蛋白质。结论是，合适的蛋白质主要是特别稳定的即例如有抗变性性或者足够“小”的那些。
根据本发明，“诱变”指改变具有β-折叠结构的多肽链中表面上暴露的一个或多个氨基酸的改变。这包括，例如用具有不同性质的氨基酸置换就其极性，电荷，溶解性，疏水性或亲水性来说具有特殊性质的氨基酸的取代作用，例如极性氨基酸取代非极性疏水氨基酸，带正电荷氨基酸取代带负电荷氨基酸等等。术语“诱变”也包括一个或多个氨基酸的插入和缺失。条件是，所述突变体包括表面上暴露的至少一个β-折叠的表面上暴露的至少两个β-链中的表面上暴露的氨基酸。在该β-折叠中或者在该β-折叠的选择的区中的各氨基酸位置处优选并且特异性导入突变。诱变作用可以发生在该β-折叠结构的一个区或多个区。改变可以包括相邻氨基酸或相对远离β-折叠的氨基酸。改变还可以包括多种β-折叠即多于两种的β-折叠中的氨基酸。表面上暴露的至少一个β-折叠的表面上暴露的至少两个β-链中有一个或多个氨基酸的插入，缺失或取代。与此相关，在该表面上暴露的一条β-链中的一个或多个氨基酸有可能被取代，缺失或插入，即如果该表面上暴露的至少两条β-链被诱变，则在该表面上暴露的一条β-链能有多个突变体。在另一个实施方案中，各种情况下诱变了该表面上暴露的至少两个β-折叠的表面上暴露的一条β-链，即各种情况下该表面上暴露的一条β-折叠至少具有一条在该表面上暴露的诱变的β-链。在本发明另一个实施方案中，该表面上暴露的诱变的β-折叠被安排成彼此反平行，并且优选至少两个反平行排列的β-折叠。
根据本发明，优选，例如，诱变该表面上暴露的两条或三条β-链。根据本发明，诱变该表面上暴露的四条或多条β-链也是可能的。此外，能诱变至少两个β-折叠中至少两条β-链，优选诱变两个反平行折叠中的三条β-链。
在本发明的一个实施方案中，通过装配具有氨基酸密码子NNK的DNA寡核苷酸进行诱变。当然也可以使用其它密码子(三联体)。
进行诱变使得保持β-折叠结构。一般情况下，诱变发生在该蛋白质表面上暴露的稳定β-折叠区之外。包括定点和随机诱变两者。利用购自Stratagene(QuickChange)或Bio-Rad(Muta-Gene噬菌粒体外诱变试剂盒)的试剂盒能够进行包括一级结构中相对小的区(大约3-5个氨基酸)的定点诱变(参见US-A-5,789,166；US-A-4,873,192)。
如果对较大的区进行定点诱变，则一定要制备DNA盒，通过装配包含突变的和没有改变的位置的寡核苷酸获得要诱变的区(Nord等，1997；McConell和Hoess，1995)。通过在增变株中增殖所述DNA或者通过PCR扩增(易错聚合酶链式反应)(例如Pannekoek等，1993)能够导入随机诱变。在这种情况下，使用具有提高的易错率的聚合酶。为了提高导入的诱变的程度或者组合不同的突变，能够利用DNA改组(Stemmer，1994)组合PCR片段中的突变。Kuchner和Arnold(1997)的综述提供了对于酶的这些诱变策略的综述。为了在选择的区进行所述所述随机诱变，这里也构建了用于诱变的DNA盒。
在合适的表达系统中表达在该诱变步骤中获得的DNA分子。优选的表达系统是有利于接着的具有期望的结合性质和/或期望的催化或酶活性的突变体的筛选和分离的那些表达系统。这样的表达载体和表达系统是技术人员公知的，并且上文已经更详细地描述过。当然，也可以使用对突变体筛选具有特异性质或活性的其它表达系统。
优选使用这样的表达和筛选系统，其中DNA水平产生的所有的突变体被克隆到噬菌粒中并且在噬菌体表面表达。在包含还原的半胱氨酸蛋白质的情况下，在本发明特别优选的实施方案中，为了改善突变体的暴露性和筛选性，有可能加入GSH。
本发明包括诱变的蛋白质，编码具有诱变的β-折叠结构并且能以新的或改变的方式结合期望的结合配偶体或者能具有对于底物的新的或改变的催化活性或新的或改变的荧光性质的蛋白质的DNA分子，其衍生的RNA分子及其功能部分。术语“功能部分”涉及具有β-折叠结构的蛋白质的亚基，区和表位，其已经根据本发明进行了诱变并且具有期望的结合性质和活性或者为此是部分原因。
以本身已知的方法筛选和分离具有期望的结合性质和/或期望的催化活性和/或荧光性质的突变体。具有新的或改变的结合性质和新的或改变的催化活性的突变体的筛选方法和分离方法的例子如下所述当筛选期望的结合性质时，使诱变的蛋白质或者其功能部分与它们的结合配偶体接触。合适的检测方法筛选具有期望的结合性质的突变体。
当筛选催化活性时，使诱变的蛋白质或者其功能部分与底物连接，然后通过合适的检测方法筛选期望的酶活性。
用几种方法能筛选催化活性1.噬菌体展示过渡态类似物与固相偶联并且对所述类似物筛选突变体库。这些物质是底物过渡态的类似物，其一般在底物向产物的酶促转化过程中产生(底物-过渡态产物)。但是，为此，该底物的过渡态必须是已知的。也可以对底物结合进行筛选。2.无噬菌体展示将突变体克隆到细菌表达载体中并且平板接种该重组细菌以形成各菌落。通过向营养培养基中加入诱导物(例如IPTG)能够在细菌中表达突变蛋白。该营养培养基还必须含有其转化要被筛选的底物。该底物在转化过程中必须形成一个可鉴定的例如有色的产物。在营养培养基中表达转化底物的突变体的那些细菌需要不同的颜色。一个例子是筛选β-半乳糖苷酶活性和X-Gal的转化(蓝色染色)(Zhang等，1997)。3.技术人员知道的其它检测方法除了形成颜色的变体，也能筛选，例如，介导新的抗性(向营养培养基中加入抗生素)或者使得在“正常”细菌在其上不生长的基本营养培养基上生长成为可能的蛋白质突变体。这里能利用包含新的蛋白质突变体的选择性生长的优点(Crameri等，1997)。4.突变蛋白的表达和分泌例如在细菌中，获得上清液，并且测定要筛选的期望的酶活性(You和Arnold，1996)。因此本发明解决了通过诱变在其结构基序中具有β-折叠结构的蛋白质产生具有新的结合性质或新的催化性质的蛋白质的问题。筛选这些蛋白质使其具有期望的新的或改变的优选改进的结合性质或者期望的新的或改变的优选改进的酶活性或催化活性。本发明的系统甚至可能在β-折叠诱变之后改变不具有结合性质或者不具有酶学性质的β-折叠蛋白，使其获得结合性质或催化性质。
根据本发明，“结合性质”指，例如，抗原对抗体的特异亲和性。根据本发明进行诱变之后，该β-折叠蛋白具有抗体样性质，并且集和了抗体的高结合特异性的优点和β-折叠蛋白稳定性质的优点。根据本发明制备的具有抗体样性质的β-折叠蛋白也具有催化功能。
但是，根据本发明的解决方案也使得可能产生具有新的或改变的催化活性的具有β-折叠结构的蛋白质。其它蛋白质的性质例如GFP的荧光性质的改变也是可能的。
根据本发明，结合性质、催化活性或荧光性质的改变指所述性质的退化或改进，优选改进。
根据本发明，“具有新的特异性质的蛋白质”或者“具有新的催化活性的蛋白质”指先前不具有任何特异结合性质或催化活性，而现在由于该表面上暴露的至少一个β-折叠的表面上暴露的至少两条β-链中表面上暴露的氨基酸的特异诱变而具有特异结合性质或催化活性或者两者的组合。但是，也包括在诱变之前已经具有特异结合性质或催化活性，并且在β-折叠中诱变之后具有另一种特异结合性质和/或催化活性的蛋白质。当然，具有特异结合性质的蛋白质现在具有催化活性也是可能的，反之亦然。
本发明进一步包括在诱变之前已经具有特异结合性质和/或酶促或催化活性和/或荧光性质，并且在该表面上暴露的一个或多个β-折叠的表面上暴露的至少两条β-链中表面上暴露的氨基酸的诱变之后，获得改进的、或者更一般的术语，它们的特异结合性质和/或它们的催化活性和/或它们的荧光性质的改变的蛋白质。
在这方面，本发明的方法和通过该方法制备的蛋白质不同于现有技术的蛋白质和方法，其中通过随机诱变改变β-折叠结构，所述随机诱变不指向β-折叠结构而是指向整个蛋白质，并且其特别不指向在该表面上暴露的至少一个β-折叠的表面上暴露的至少两条β-链中表面上暴露的氨基酸或者其涉及该表面上暴露的这样的氨基酸。
在本发明优选的实施方案中，下面将举例描述，作为具有β-折叠结构的蛋白质的例子，γ-结晶，被选作诱变的起始点。向该末端，通过结构研究选择表面上暴露的第一个氨基酸的位置，并且通过本身已知的诱变方法诱变。获得的突变体在合适的也是已知的表达系统中表达。这项筛选朝着表现出其γ-结晶的β-折叠中表面上暴露的氨基酸对抗原BSA-雌二醇17-半琥珀酸酯的特异结合的那些突变体。尽管分离出多种具有期望的结合性质的突变体，但是只有一个携带预期的氨基酸改变。因此，获得抗体样非免疫球蛋白分子，其以起始蛋白γ-结晶为基础。
本发明的方法使得有可能制备大量的突变体。仅八个氨基酸位置的诱变就可能形成2.6×1010种不同的蛋白质物质，对它们可以分析期望的结合性质和催化活性。
根据本发明，进一步证明通过该表面上暴露的氨基酸的诱变能改变具有β-折叠结构的蛋白质的荧光性质。
获得的突变基因能够在合适的系统中增殖并且能表达该蛋白质。合适的表达系统是原核生物系统或真核生物系统。将编码突变蛋白的DNA转移到，例如合适的载体中，例如表达载体中，并且通过转化、转染或感染导入宿主细胞中。当然，与特异性控制异源突变DNA表达的调控序列连接是有利的。
可以使用的宿主细胞是高级真核生物的宿主细胞，例如哺乳动物细胞，或者低级真核生物的宿主细胞，例如酵母细胞，或者原核生物细胞，例如细菌细胞。可能的细菌宿主细胞的例子是大肠杆菌或枯草芽胞杆菌。通过使用从本发明的DNA衍生的RNA制备蛋白质的无细胞翻译系统也是可能的。合适的克隆和表达系统描述于分子生物学，生物技术和基因技术的各种教科书中。例子包括Sambrook等，1989和Ausubel等，1994。
下面以例示的实施方案和附图为基础更详细地说明上面一般术语描述的本发明。该实施例要理解为是本发明的一种可能形式，并且本发明不局限于该特定的实施方案。
图1用于装配γ-结晶突变体的寡核苷酸。
图2在链霉抗生物素负载的磁珠(MB)上装配寡核苷酸和接着PCR的示意图。X标记的位置指示随机氨基酸位置。
图3γ-II-结晶的非诱变区扩增的示意图。
图4用于扩增的非诱变区的寡核苷酸。
图5pCANTAB 5E-γ-II-结晶表达盒的示意图。g3-SS噬菌体蛋白质G3的信号肽序列G3；E-tag用于免疫检测的11个氨基酸；fd Gen 3丝状噬菌体M13的小包被蛋白3。
图6三次淘选之后使用浓缩噬菌体的多克隆噬菌体ELISA。用BSA-β-雌二醇17-半琥珀酸酯偶联物包被微量滴定板或者只用BSA包被作为对照。接下来给出的另一个是γ-II-结晶野生型噬菌体(GC-WT)与特定抗原的结合，来自起始文库的噬菌体(GCUC-1)与特定抗原的结合和通过反复淘选浓缩的噬菌体(E-17噬菌体)与特定抗原的结合。
图7分别是噬菌粒pGCKT 8-3中BSA-β-雌二醇17-半琥珀酸酯-结合γ-II-结晶突变体12A(Mu 12A)的部分DNA序列和pCANTAB 5E中γ-II-结晶野生型(WT)的部分DNA序列。用斜体和下划线指示导入的切割位点Sfi I(5’)和Bst EII(3’)。随机化氨基酸位置的密码子用黑体表示。
图8在噬菌粒中表达并且去除信号肽之后BSA-β-雌二醇17-半琥珀酸酯-结合γ-II-结晶突变体12A(Mu 12A)的衍生的氨基酸序列和γ-II-结晶野生型(WT)的衍生的氨基酸序列。随机化氨基酸位置用黑体表示。用黑体和下划线指示实际上已经改变的氨基酸。通过Sfi I切割位点在N-末端另外导入氨基酸，并且用斜体和下划线给出C-末端融合体。
图9用于将Mu 12A和γ-II-结晶克隆到载体pET-20b中的引物的序列。
图10在pET-20b中表达之后BSA-β-雌二醇-17-半琥珀酸酯-结合γ-II-结晶突变体12A的衍生的蛋白质序列和γ-II-结晶的衍生的蛋白质序列。随机化氨基酸位置用黑体表示。用黑体和下划线指示实际上已经改变的氨基酸。通过克隆另外导入C-末端氨基酸，包括用斜体和下划线给出的6组氨酸。
图11分析突变体12A与BSA-β-雌二醇17-半琥珀酸酯偶联物的浓度-依赖性结合。突变体(12A)与偶联物(BSA-Estr.17)的结合和γ-II-结晶(WT)与偶联物的结合，以及作为对照，与BSA的结合图12突变体12A抗变性剂胍的稳定性。该图表示纯化的突变体12A和γ-II-结晶蛋白与各种浓度的胍温育不同时间之后的最大发射。
图1350mM磷酸钠，pH6.5中野生型γ-II-结晶和突变体12A的荧光发射光谱。在激发波长280nm下测定荧光信号(图13A)。蛋白质浓度是100μg/ml，图13B给出用于荧光测定的蛋白质样品的吸收光谱。用1厘米通径长度测定吸收度。
实施例制备与雌二醇激素特异性结合的γ-结晶突变体在分离特异性结合雌二醇激素的牛γ-B-结晶(γ-II)的基础上给出了具有抗原—结合性质的新的β-折叠蛋白的设计。该表面上暴露的β-折叠的选择的氨基酸位置的特异改变产生了具有β-折叠结构和特异结合性质的新的稳定蛋白质。选择了适合诱变的氨基酸β-折叠区之后，在DNA水平进行定点诱变，并且在噬菌粒中制备β-折叠突变体文库，其使得在噬菌体展示系统中表达和接着筛选突变体的新的结合性质成为可能。关于其新的性质方面，将分离的突变体与起始蛋白γ-II-结晶相比较。选择合适的区用于γ-结晶中的诱变以γ-II-结晶的X-射线结构为基础(Wistow等，1983)，选择γ-II-结晶的N-末端区(Acc.M16894)进行诱变。在那里鉴定了形成表面片段的总共8个氨基酸。该选择的氨基酸是β-折叠的一部分并且基本上对保存该结构没有贡献。它们是可接触溶剂并因此也可接触可能的结合配偶体的氨基酸位置。这8个氨基酸Lys2，Thr4，Tyr6，Cys15，Glu17，Ser19，Arg36和Asp38包括该蛋白质总表面面积的大约6.1％的面积。制备诱变的γ-II-结晶基因的库通过定点诱变将这8个氨基酸的位置随机化。这使可能产生2.6×1010种不同的蛋白质物质。通过装配各寡核苷酸在DNA水平获得要诱变的区。接着克隆到构建用于在噬菌体展示系统中筛选的噬菌粒中。寡核苷酸装配对于诱变，在固相上装配具有8个随机的氨基酸位置还有合适的限制性酶切位点的包含γ-结晶突变体的5’区的227bp。总共为此使用了10个单独的寡核苷酸，其中三个包含随机的氨基酸位置(图1)。在引物合成中，在要诱变的8个位置处使用核苷酸混合物NN(T/G)，理论上在每个位置得到32种不同的密码子(参见Nord等，1997)。在装配开始时，使生物素化寡核苷酸接触购自Dynal(M-280)的链霉抗生物素负载的磁珠(MBs)。几次接触、连接和聚合步骤之后，通过PCR有可能扩增在固相上装配的γ-结晶的诱变区的库。长度大约250bp的PCR产物包含Sfi I切割位点5’和Bst EII切割位点3’。
将用于装配的所有的寡核苷酸调节至100pmol/μl的浓度。首先，装配引物GCLIE1B和GCLIE2P。为此，每次向4μl引物加入36μl洗涤和缓冲液(WB缓冲液1M NaCl，10mM Tris-HCl pH7.5，1mM EDTA)，并且将该混合物在70℃下温育5分钟。装配两个引物之后进一步在70℃下温育5分钟，将该引物混合物缓慢冷却到室温。4μl的GCLIE1B/GCLIE2P引物杂合物与56μl的WB缓冲液混合，并且加载到事先用洗涤和结合缓冲液洗涤过的300μg链霉抗生物素负载的磁珠(MB)上。在室温下温育15分钟之后用WB缓冲液和TE缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.5，1mM EDTA)洗涤MB。将一引物接头片段加给偶联了第一引物杂合物的MB，该片段如下制备4μl引物GCLIB4P或GCLI5P与36μl购自GIBCO BRL的1×连接缓冲液(50mMTris-HCl pH7.6，10mM MgCl2，1mM ATP，1mM DTT，5％(w/v)聚乙二醇-8000)混合。在70°温育5分钟之后，合并两种混合物，在70℃又温育5分钟并且冷却到室温。加入12单位的T4 DNA连接酶(GIBCO BRL)和8μl of 1×连接缓冲液之后，该反应混合物在室温下温育1小时。12μl的该GCLIE3P/GCLIB4P/GCLI5P桥接片段与54μl的1×连接酶缓冲液和6单位的连接酶混合，并且将该混合物加给含有第一引物杂合物的洗涤过的MB并且在室温下温育1小时。连接反应之后，用TE缓冲液洗涤MB两次，并且溶解于64μl的含有8微升连接酶的1×连接缓冲液中。然后向MB加入8μl的装配的引物混合物GCLI6P/GCLIB7P，其引物事先已经类似于GCLIB4P/GCLI5P进行了装配。将该连接反应在室温下又进行1小时。在TE缓冲液中洗涤MBs两次之后，加入12μl二次桥接片段GCLIB8P/GCLIEgP/GCLIE10，并且该混合物被连接1小时。类似于第一桥接片段制备第二桥接片段，首先装配GCLIE9P和GCLIE10，然后在第二步骤中与GCLI8P连接。然后再次用TE缓冲液洗涤带有固定化引物的MB。接着DNA-聚合酶和连接酶填补第二条链中的缺口。该MB在37℃下在下面的缓冲混合物中温育30分钟52.5μl的H2O，6μl购自Boehringer的缓冲液L(100mM Tris-HCl pH7.5，100mM MgCl2，10mM二硫赤藓糖醇)，0.5μl的dNTPs(25mM各dNTP)和1μl(2单位)的Klenow片段(Boehringer)。用TE缓冲液洗涤MB两次，接着在室温下进行连接反应1小时。100μl混合物含有10单位的连接酶。用TE缓冲液洗涤两次步骤之后，通过用40μl of 0.1MNaOH处理30秒去除与MB非共价键结合的DNA链，并且将MB重新悬浮于60μl的TE中。使用MB作为模板进行扩增该文库的PCR。如下制备PCR反应混合物(50μl)6μl的MB，5μl购自Stratagene的10×PCR反应缓冲液(100mM KCl，100mM(NH4)2SO4，200mM Tris-HCl pH8.75，20mM MgSO4，1％TritonX-100，1mg/ml BSA)，1μl(2，5单位)的Pfu DNA聚合酶(Stratagene)，0.5μl的dNTPs(25mM的各dNTP)，0.35μl的GCLIE1B，0.35μl的GCLIA11B和36.8μl的H2O。将PCR进行下面35次循环使用引物在55℃退火1分钟，聚合酶反应在72℃进行1.5分钟，95℃下变性1分钟，最后聚合酶反应在72℃进行5分钟。噬菌粒pGCKT 8-3的制备从噬菌粒pCANTAB 5E(购自Pharmacia Biotech的PRAS试剂盒)起始，这样构建用于克隆γ-II-结晶突变体带的噬菌粒衍生物。利用PCR使用质粒pGll(Mayr等，1994)作为模板和使用引物GCFORNOT和GCBACKSfiBst(图.3，4)扩增γ-II-结晶(C-末端结构域)的整个3＇和没有诱变的5＇区。
通过引物导入Sfi I(GCBACKSfiBst)和Not I(GCFORNOT)切割位点使得将该PCR产物插入噬菌粒(GCFORNOT)pCANTAB 5E成为可能。和GCBACKSfiBst引物一起，Bst EII切割位点另外整合到γ-结晶基因中，这使得克隆诱变的γ-结晶DNA片段。从头导入切割位点不改变γ-II-结晶中的氨基酸序列。测序之后，将PCR产物克隆为进入用pCANTAB 5E切割的噬菌粒Sfi I/Not I中的Sfi I/Not I片段。用这种方法构建的噬菌粒pGCKT8-3是用于制备γ-II-结晶噬菌体展示文库的起始点。γ-II-结晶突变体文库的制备和野生型γ-II-结晶的克隆用Bst EII和Sfi I限制酶切割噬菌粒pGCKT 8-3，并且进行磷酸酶处理(购自USB的shrimps磷酸酶)。各自切割之后，通过凝胶电泳将DNA分级分离，切下切割的载体级分并且利用电洗脱从琼脂糖分离。通过苯酚/氯仿萃取和用糖原沉淀DNA进行任何进一步的酶处理。用Sfi I和Bst EII限制酶切割利用PCR扩增的并且包含γ-II-结晶的突变区的DNA片段集合。总共使用440ng噬菌粒和110mg的PCR产物用来使PCR产物与制备的pGCKT 8-3噬菌粒连接。用总共44单位的T4 DNA连接酶(GIBCO BRL)在20微升混合物中在16℃下进行连接反应过夜。70℃下使连接酶灭活20分钟之后，通过点滴透析1小时将连接反应脱盐。在各种情况下，用各15微升透析过的连接液转化30微升电感受态大肠杆菌TG1细胞。根据PRAS-试剂盒手册的描述制备和转化电感受态细胞。将转化细胞制备成含有葡萄糖-和氨苄青霉素-(100μg/ml)的SOBAG板(参见购自Pharmacia-Biotech的PRAS-试剂盒手册)，并且在30℃培养过夜。制备包括250000个原始克隆的GCUC-1库。用含有1％葡萄糖和20％甘油的2×YT培养基(参见PRAS-试剂盒手册)洗涤这些克隆，分成等份并且在-80℃下贮存。测定该库的扩增系数达到7×106。GCUC-1库中重组克隆的比例是97％。对随机选择的克隆的测序表明使用的密码子就是随机化氨基酸位置处的期望的突变体。利用Western-印迹分析测得该库中表达率是30-60％。
在对照实验中，使用下面的引物扩增γ-II-结晶DNAGCFORNOT(5’GAGTCATTCTGCGGCCGCATAAAAATCCATCACCCGTCTTAAAGAACC 3’)和GCBACKSFI(5’CATGCCATGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGGGAAGATCACTTT TTACGAGGAC 3’)，使用质粒pGII(Mayr等，1994)作为模板。用Not I和Sfi I限制性内切酶切割之后，将测过序的PCR产物克隆到同样用pCANTAB 5E切割过的Sfi I/Not I噬菌粒中。噬菌体展示设计和对新的结合性质的筛选使用购自Pharmacia-Biotech的商售噬菌体展示系统PRAS来对Y-II-结晶筛选结合性质。在使用的pCANTAB 5E(野生型Y-II-结晶)和pGCKT 8-3(Y-结晶突变体)噬菌粒中，Y-结晶N-末端融合G3信号肽并且C-末端融合E-tag，这使得对该蛋白质的免疫检测成为可能(图5)。根据使用的细菌株，E-tag之后的琥珀(amber)中止密码子也被识别(大肠杆菌HB 2151)，切割信号肽之后是大肠杆菌细胞的分泌或超阅读。加入辅助噬菌体之后，能形成重组噬菌体，其在它们的表面上暴露Y-II-结晶突变体。对GCUC-1和Y-II-结晶野生型噬菌体进行培养条件的优化在PRAS手册描述的培养条件下，利用Westerb-印迹分析不可能检测任何重组噬菌体期望的融合蛋白(Y-II-结晶/蛋白质3)。只有在噬菌体形成期间加入还原的谷胱甘肽(GSG)会改变细菌细胞的周质中的氧化还原态，并且因此提供更有利的噬菌体装配条件。当使用Y-II-结晶克隆时，只加入GSH能检测携带融合蛋白的重组噬菌体。提高GSH浓度也提高Y-II-结晶噬菌体的比例。测得最佳GSH浓度是8mM。不存在GSH下，噬菌体表面上Y-结晶表达不好的一个原因可能是Y-结晶中高的还原的半胱氨酸(7)的浓度。当部分未折叠的Y-结晶进入周质时，在那里占优势的氧化条件下，可能会由于形成二硫桥而错折叠并形成凝集物。这可能抑制噬菌体装配。当在噬菌体展示系统中使用带有还原的半胱氨酸的蛋白质时，一般通过加入GSH可能会增加重组噬菌体的形成。使用GCUC1噬菌体展示库的筛选方法为了筛选GCUC-1库，在220℃下将使用的所有的玻璃装置灭菌4小时并且用Helipur将塑料材料灭菌1小时。使用BSA-β-雌二醇17-半琥珀酸酯(Sigma)作为抗原并且微量滴定板(Maxisorp，购自NUNC)作为固相，进行GCUC-1库淘选。在3轮淘选中，洗涤步骤的严格性增加。对于第一次培养，用50μl的GCUC-1库接种含有2％葡萄糖和氨苄青霉素(100μg/ml)的100ml的2×YT培养基。细菌在37℃和300rpm下生长至OD600为0.4。向10毫升该细菌培养物加入800μl M13KO7辅助噬菌体(1×1011pfu/ml，GIBCOBRL)。之后，在37℃培养30分钟，没有或者有进一步的30分钟的轻微搅动(50rpm)。通过室温下和1500rpm(Sorvall SS 34 Rotor)离心20分钟获得细菌沉积物，并且溶于含有8mM GSH，100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的100ml的2×YT培养基中。通过在30℃和300rpm下培养过夜产生重组噬菌体。通过两次10800g离心，每次15分钟，并且接着过滤(孔径0.45μm)，获得含有重组噬菌体的上清液。通过向该上清液加入1/5的PEG/NaCl溶液(20％PEG-8000，2.5M NaCl)，在冰上孵育1小时，并且在4℃和3300g两次离心，每次30分钟，来浓缩噬菌体。将获得的噬菌体沉积物悬浮于4ml的PBS pH7.2中，并且通过离心(10分钟，11600g，室温)去除残留的细胞成分。对于筛选过程(淘选)，将1ml浓缩的噬菌体与1ml的6％强度BSA溶液(6％BSA于PBS中，pH7.2)混合并且在室温下温育10分钟。在各种情况下，向如下制备的包被抗原的微量滴定板孔加入用该方法处理的100μl噬菌体。用抗原BSA-β-雌二醇17-半琥珀酸酯包被NUNC-Maxisorp微量滴定板。各种情况下向10个孔共加入100μl抗原溶液(100μg/ml于PBS pH7.6)。室温下包被过夜的孔用PBS，pH7.6洗涤三次。通过在室温下用3％强度BSA/PBS溶液，pH7.2装入孔中2小时将自由的结合位点饱和。加入BSA-处理过的噬菌体之前，用PBS溶液(pH7.2)洗涤孔两次。通过轻轻搅动(20rpm)微量滴定板30分钟，接着不摇动下在室温下孵育90分钟进行淘选。通过用PBS，pH7.2/0.1％ Tween-20洗涤10次并且用PBS，pH7.2洗涤10次来去除非特异性结合的噬菌体。通过每次每孔加入100μl的100mM三乙胺(新鲜制备)并且在室温下温育10分钟来洗脱结合的噬菌体。通过加入500μl的1M Tris-HCl pH7.4中和碱洗脱的噬菌体(1ml)。用750μl这样的噬菌体感染在基本培养基板上培养的并且具有0.4-0.5OD600的9ml TG-1细胞。为此，37℃下细菌与噬菌体培养30分钟。通过三乙胺处理通过TG-1细胞的定向感染，有可能获得与微量滴定板特定地紧密结合并且没有从微量滴定板去除的噬菌体。为此，向孔中各加入100μl培养的TG-1细胞。37℃下温育30分钟之后，去除感染的TG-1细胞并且与来自用洗脱的噬菌体感染的那些细胞合并。将感染的细菌制成16×16cmSOBAG板并且30℃培养过夜。每次用1μl的浓缩的洗脱的噬菌体测定滴度。用12.5ml的2×YT，20％甘油从SOBAG板洗下获得的细菌克隆。类似于第一次淘选进行第二次和第三次淘选，有下面的变化。在20毫升培养基中用20微升洗出库反复进行噬菌体培养。2ml培养的细菌培养物被用于用辅助噬菌体的感染(细菌/噬菌体重量比1/20)。在第二次淘选中，首先用PBS/Tween-20洗涤15次，然后用PBS洗涤10次洗涤微量滴定板，在第三次淘选中，首先用PBS/Tween-20洗涤20次，然后用PBS洗涤10次。检验浓度和特异结合的ELISA利用多克隆噬菌体ELISA测定与抗原特异性结合的噬菌体的浓度。除了洗脱噬菌体之外，比较分析起始库GCUC-1的噬菌体和野生型Y-II-结晶的噬菌体。室温下用100μl的BSA-雌二醇17-半琥珀酸酯或BSA的2μg/ml浓度的PBS pH7.6溶液包被NUNC-Maxisorp板过夜。用PBS，pH7.6将孔洗涤三次，接着用3％干奶粉(Glücksklee)/PBS，pH7.2在37℃封闭2小时，再用PBS，pH7.6洗涤三次。首先室温下将噬菌体培养后分离的没有浓缩的重组噬菌体封闭1小时(与6％强度干奶粉(Marvel)/PBS pH7.6的1∶1的混合物)。每孔加入100μl封闭的噬菌体并且在37℃培养1小时。各自用PBS/Tween-20和PBS将孔洗涤三次，接着与抗-M13抗体-POD偶联物(Pharmacia-Biotech，在3％ Glücksklee/PB中稀释1∶5000)在37°孵育1小时。洗涤板之后，使用100μl免疫纯TMB底物(Pierce)检测酶-结合的抗体。通过加入100μl的2M H2SO4中止显色反应，并且在450nm测定吸光度。图6给出了第三次淘选之后与BSA-雌二醇偶联物结合的噬菌体的浓度的结果。与偶联物特异结合的各噬菌体的分离和表征从第三次淘选之后获得的细菌克隆筛选80个克隆。从克隆中分离噬菌体并且在单克隆噬菌体ELISA中分别测定其抗原结合。在聚丙烯微量滴定板(NUNC)中在含有2％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的100μl的2×YT培养基中在轻微搅动(100rpm)下将各细菌克隆培养过夜。在相同的培养基中将这样的细菌培养物2μl稀释1∶100并且以100rpm在37℃下培养至OD600为0.4。将所述获得的噬菌体用于筛选过程。使用购自TECAN的深孔聚丙烯板来进行噬菌体培养。对于ELISA，室温下用40μl的6×PBS/18％将离心(没有浓缩)之后获得的200μl噬菌体上清液封闭1小时。测定80个克隆，其中30个表明重组噬菌体与BSA-雌二醇-17明显结合但是与平行测定的BSA不结合。在对照实验中，具有野生型Y-II-结晶的噬菌体表明与BSA-雌二醇-17不结合。使用IRD 800-标记的引物pCANR1LAB(5’CCATGATTACGCC-AAGCTTTGGAGCC 3’)and GCLISEQ(5’CTGAAAGTGCCGGTGTGTTGC 3’)对14个选择的结合噬菌体测序。只有在一例中，测序揭示了在8个随机化氨基酸位置专有突变的Y-结晶突变体(Mu12A)。很多克隆表现出可读框中的移位，尽管理论上编码一种功能蛋白，但是它们的改变在期望的Y-结晶区中不是专有性的。没有进一步研究这些读框移位。β-折叠突变体12A的特征通过Western-印迹分析，分别使用抗-G3P和抗-E-Tag抗体(Pharmacia-Biotech)，检测重组噬菌体的表面上融合蛋白Mu 12A-小包被蛋白3的表达和Mu 12A在大肠杆菌菌株HB 2151中的表达。图7给出了噬菌粒pGCKT 8-3中突变体12A的DNA序列和Y-II-结晶野生型的DNA序列。DNA序列在起始噬菌粒pCANTAB 5E中已经存在的Sfi I切割位点处起始，在pGCKT 8-3情况下，在第一次被导入Y-II-结晶野生型基因中的Bst EII位点中止，并且在Y-II-结晶野生型基因情况下，在起始序列处中止。图8给出了从其衍生的氨基酸序列。氨基酸位置36处的密码子随机化作用不改变该位置处的精氨酸。突变体12A的计算机模拟表明氨基酸改变不引起蛋白质结构与起始蛋白相比的大的改变。但是，静电荷变得更偏向正值。pET-20b中Mu 12A的表达为了详细描述突变体12A的特征，将DNA再次克隆到质粒pET-20b(Novagen)中。该质粒使得重组DNA在大肠杆菌菌株BL 21中的高效表达和外源蛋白质的简单纯化成为可能。在没有信号肽和有6个组氨酸残基的C-末端融合下表达基因。利用PCR使用合适的噬菌粒DNA和引物扩增突变体12A的DNA和Y-II-结晶野生型的DNA，对于20b对于突变体12A使用引物GC 20bback12A/GC，对于20b对于野生型使用引物(图9)。用限制性内切酶Nde I和Bam HI切割PCR片段，并且克隆到用Nde I/Bam HI切割的载体pET 20b中。图10分别给出了在pET-20b中表达之后突变体12A的理论氨基酸序列和Y-II-结晶的理论氨基酸序列。通过N-末端蛋白质测序证实突变体12A的头10个N-末端氨基酸。pET-20b中突变体和野生型的培养和纯化为了详细研究该突变体的结合性质和稳定性，制备大量的突变体12A和野生型蛋白质。分别用质粒pET-20b/Mu 12A和pET-20b/Y-II-结晶转化BL21细胞。通过用LB培养基/100μg/ml氨苄青霉素将预培养物稀释1∶100并且以200rpm和在37°下搅动培养物将克隆培养至OD600为0.5。通过加入IPTG(终浓度1mM)诱导Y-结晶的表达。在30℃和在200rpm下继续培养过夜。通过4℃，60000rpm(Sorvall GS3转子)离心10分钟收获细菌细胞。将细胞沉积物悬浮于30ml的2×PBS，加入150μl的200mM PMSF和10μl的DNAse(Boehringer)。然后用Gaulin压碎器以800-1000 PSIG破碎细胞两次。该细胞悬浮液在4℃和20000rpm(Sorvall SS 34转子)离心1小时之后获得含有可溶性蛋白质的上清液。通过4℃下亲和层析纯化与6个组氨酸残基融合的Y-结晶。用50ml的2×PBS/10mM咪唑平衡8ml的Ni-NTA。然后在间歇式方法中在转动摇瓶机上将含有可溶性蛋白质的上清液与平衡过的柱材料缓慢搅动过夜。将该悬浮液加给层析柱之后用2×PBS/10mM咪唑/300mM NaCl冲洗。用2×PBS/250mM咪唑洗脱结合的蛋白质。DTT(终浓度10mM)被加给洗脱的蛋白质。接着是两次4℃下的透析步骤，每次8小时第一次用100mM磷酸钠缓冲液pH6.0/1mM EDTA/1mMDTT，第二次用10mM磷酸钠缓冲液pH6.0/1mM EDTA。最后离心(4℃，30分钟，20000rpm，Sorvall SS 34转子)之后获得的上清液含有纯化的蛋白质(Mu 12A或Y-II-结晶)，其被用于结合研究和稳定性研究。
通过进行ELISA测定突变体12A对BSA-雌二醇-17-半琥珀酸酯偶联物的特异性结合，使用渐增的纯化突变体12A-His-Tag蛋白质浓度。使用渐增量的Y-II-结晶野生型(同样有His-Tag)作为对照，测试两种纯化的蛋白质对BSA的结合。使用NUNC-Tm板进行浓度-依赖性ELISA。室温下用BSA-雌二醇-17-半琥珀酸酯偶联物或BSA对抗原包被过夜。在各种情况下用浓度为20μg/ml的PBS pH7.6的100微升抗原进行包被。洗涤(2×PBS pH7.6)和封闭平板之后(3％ Marvel/PBS，37℃，2小时)，在各种情况下，向总共100微升的反应溶液(PBS，3％Marvel，xμl的蛋白质)中加入1-13μl的纯化的Mu 12A或Y-II-结晶的蛋白质贮液(浓度0.63mg/ml)，并且在孔中在37℃培养2小时。使用的二抗是购自Qiagen的1∶3000稀释的四-His抗体和1∶2000稀释的抗小鼠POD抗体(Sigma)。用3％强度Marvel/PBS溶液稀释该抗体并且向孔中加入100微升，并且在37℃各温育1小时。如对多克隆噬菌体ELISA的描述进行底物反应。图11中该项ELISA的结果清楚地表明只有用渐增浓度的突变体12A才测得渐增的消光度。使用Y-II-结晶没有测得增加。同样，没有观察到与BSA的反应。这表明与起始蛋白质相比突变体12A的特异性结合。通过记录由于突变体12A和由于Y-II-结晶的胍变性来研究稳定性。为此目的，以20μg/ml的终浓度使纯化的蛋白质与渐增浓度的胍在20℃下孵育一天和三天。将总共15个胍盐浓度在1mM DTT/0.1M磷酸钠缓冲液pH6.0溶液中调节在0-5.5M的范围内。一天和三天之后，分别记录各混合物的300-400nm荧光发射光谱。激发波长是280nm。图12给出测定的最大发射对胍盐浓度的函数。一天和三天之后Y-II-结晶的稳定性比突变体12A的稳定性高。但是，与抗体分子相比，突变体12A的稳定性高得多。突变体12A的荧光性质的变化为了测定突变体12A的荧光性质与野生型蛋白质相比是否有了改变，记录荧光光谱。为此目的，在280nm激发各100μg/ml的野生型蛋白质或者突变体12A(于50mM磷酸钠中，pH6.0)，并且在1厘米通径长度的小池中在300至400nm波长范围内测定荧光。激发和发射的狭缝宽度都是5nm。
对于野生型和突变体12A，检测的荧光信号都具有最大329nm值。但是，只有86％信号强度的突变体12A的荧光强度比Y-结晶野生型(100％)低得多(参见图13A)。
突变体12A和野生型具有相同数目的荧光团。但是，突变体中序列的改变(8位处Y-＞K和15位处C-＞Y)引起荧光信号的改变。不同的荧光强度可能归因于8位和15位的酪氨酸残基分别具有不同的荧光性质的事实。
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序列表<110>乌尔丽克.菲德勒博士赖纳.鲁道夫教授<120>具有特异结合性质的β-折叠蛋白质的设计<130>P12389<140><141><150>DE 199 32 688.6<151>1999-07-13<160>22<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>1cgcgcgcgtc tcacaaagat acatgccatg actcgcggcc cagcc 45<210>2<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>2gccgcaggaa gtactggtga ccctggtagt tggggcgctc atacagcatc50<210>3<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>3ccatcagccc catcagcgaa ctttgccgca ggaagtactg g 41<210>4<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>4gagtcattct gcggccgcat aaaaatccat cacccgtctt aaagaacc 48<210>5<211>59<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>5gcggcccagc cggccgctgc tggatgctgt atgagcgccc caactaccag ggtcaccag 59<210>6<211>55<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>6catgccatga ctcgcggccc agccggccat ggggaagatc actttttacg agac 55<210>7<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>7ccatgattac gccaagcttt ggagcc 26<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>8ctgaaagtgc cggtgtgttg c 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20<210>16<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>16gatggagtta cagcggctga aatagggctg caggttgggg cagtcgc 47<210>17<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>17tgtaactcca tcnnkgtgnn kagcggctgc tggatgctgt atgag 45<210>18<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸<400>18cgccccaact accagggtca ccagtacttc ctgcggc 37<210>19<211>198<212>PRT<213>Bos sp.<400>19Ala Ala Gln Pro Ala Met Gly Arg Ile Lys Phe Lys Glu Asp Arg Gly1 5 10 15Phe Gln Gly His Tyr Tyr Ser Cys Asn Ser Asp Cys Pro Asn Leu Gln20 25 30Pro Tyr Phe Ser Arg Cys Asn Ser Ile Arg Val Leu Ser Gly Cys Trp35 40 45Met Leu Tyr Glu Arg Pro Asn Tyr Gln Gly His Gln Tyr Phe Leu Arg50 55 60Arg Gly Asp Tyr Pro Asp Tyr Gln Gln Trp Met Gly Phe Asn Asp Ser65 70 75 80Ile Arg Ser Cys Arg Leu Ile Pro Gln His Thr Gly Thr Phe Arg Met85 90 95Arg Ile Tyr Glu Arg Asp Asp Phe Arg Gly Gln Met Ser Glu Ile Thr100 105 110Asp Asp Cys Pro Ser Leu Gln Asp Arg Phe His Leu Thr Glu Val His115 120 125Ser Leu Asn Val Leu Glu Gly Ser Trp Val Leu Tyr Glu 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170 175Asp Pro Asn Ser Ser Ser Val Asp Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His180 185 190His His His His His19权利要求
1.具有β-折叠结构的蛋白质，特征在于特异性诱变表面暴露的至少一个β-折叠的表面上暴露的至少两个β-链的表面上暴露的氨基酸，使得该蛋白质具有新的或改变的特异结合性质或者新的或改变的催化活性或者新的或改变的荧光性质。
2.根据权利要求1的蛋白质，特征在于其包括在由结晶体，内孢囊素，热激蛋白，冷激蛋白，β-螺旋蛋白，lipocalins，certins，纤连蛋白或转录因子构成的组中，或者为GFP，NGF，tendamistat或溶菌酶。
3.根据权利要求1或2的蛋白质，特征在于诱变该表面上暴露的三条β链。
4.根据权利要求1或2的蛋白质，特征在于诱变该表面上暴露的四条或多条β链。
5.根据前面权利要求的一项或多项的蛋白质，特征在于诱变至少两个β折叠中的至少两条β链。
6.根据前面权利要求的一项或多项的蛋白质，特征在于诱变两个反平行β折叠中的三条β链。
7.根据前面权利要求的一项或多项的蛋白质，特征在于其是脊椎动物，啮齿动物，鸟类或鱼的结晶。
8.根据前面权利要求的一项或多项的蛋白质，特征在于其是α-，β-或γ-结晶。
9.根据前面权利要求的一项或多项的蛋白质，特征在于其是γ-II-结晶蛋白质。
10.根据前面权利要求的一项或多项的蛋白质，特征在于在可接触溶剂或者可接触结合配偶体的β-折叠区的一个区诱变该蛋白质。
11.根据前面权利要求的一项或多项的蛋白质，特征在于在该蛋白质的一个结构域或亚基的β-折叠结构中进行诱变。
12.根据前面权利要求的一项或多项的蛋白质，特征在于其是通过诱变γ-II-结晶中的氨基酸Lys2，Thr4，Tyr6，Cys15，Glu17，Ser19，Arg36和Asp38中的一个或多个氨基酸获得的γ-II-结晶。
13.根据前面权利要求的一项或多项的蛋白质，特征在于该蛋白质在β-折叠中已经被诱变，使得其具有抗体样结合性质或酶(催化)活性。
14.根据权利要求12或13的蛋白质，特征在于其对雌二醇或者其偶联物，BSA-β-雌二醇-17-半琥珀酸酯具有结合特异性。
15.根据前面权利要求的一项或多项的蛋白质，特征在于其对雌二醇或者其偶联物，BSA-β-雌二醇-17-半琥珀酸酯具有结合特异性，并且其具有下面的氨基酸序列参见图8和10。
16.根据前面权利要求的一项或多项的蛋白质，特征在于其与另外的蛋白质或非蛋白质物质组合。
17.根据前面权利要求的一项或多项的蛋白质，特征在于其具有改进的结合性质和/或改进的催化活性和/或改进的荧光性质。
18.编码根据前面权利要求的一项或多项的蛋白质的DNA。
19.根据权利要求18的DNA衍生的RNA。
20.包含根据权利要求18或19的DNA或RNA或者其编码该蛋白质的功能区的部分的原核或真核载体或细胞。
21.根据前面权利要求的一项或多项的蛋白质的制备方法，包括下面步骤a.在编码表面上暴露的β-折叠的表面上暴露的至少两条β链的那些区中诱变编码具有β-折叠结构的蛋白质的DNA；b.在合适的表达系统中表达步骤(a)中获得的突变体；和c.筛选和分离具有期望的结合性质和/或期望的催化活性的突变体；任选地d.表达和纯化β折叠-诱变的蛋白质。
22.根据权利要求21的方法，特征在于所述诱变包括β折叠中特异氨基酸位置(定点诱变)或非特异氨基酸位置(随机诱变)的诱变。
23.根据前面权利要求的一项或多项的方法，特征在于步骤b)中的突变体在原核细胞或真核细胞中，在无细胞系统作为与核糖体的复合体，或者在植物或动物细胞，酵母细胞或噬菌体，病毒或细菌的表面上表达。
24.根据前面权利要求的一项或多项的方法，特征在于通过使这些突变体接触结合配偶体并且分离具有期望的结合亲和性的那些突变体来筛选具有期望的结合性质的突变体。
25.根据前面权利要求的一项或多项的方法，特征在于通过使这些突变体接触它们的底物并且分离具有期望的催化活性的那些突变体来筛选具有期望的催化性质的突变体。
26.根据前面权利要求的一项或多项的蛋白质在诊断和治疗中，在化妆品中，在生物分离和生物传感器和有害物质的减少中的用途。
全文摘要
本发明描述了具有特异结合性质和催化性质的新的β－折叠蛋白质,也描述了这些蛋白质的制备方法。
文档编号C12N1/19GK1371415SQ00811969
公开日2002年9月25日 申请日期2000年7月13日 优先权日1999年7月13日
发明者乌尔丽克·菲德勒, 赖纳·鲁道夫 申请人:希尔蛋白质有限公司