专利名称：一种双环氧基修饰的生物芯片基片的制备方法
技术领域：
本发明属于生物芯片基片的制备领域，特别涉及一种双环氧基修饰的生物芯片基 片的制备方法。
背景技术：
生物芯片技术是利用微细加工工艺在玻璃、塑料或其他基质材料上加工出用于生 物样品的制备、反应和检测的微结构，在高度并联、低容量的格式下同时进行上千次试验， 可对基因、配体、抗原等生物活性物质进行准确、快速、大信息量的检测和分析，极大地节约 了时间和成本。寡核苷酸、基因片段或蛋白质性质的抗原抗体在基片表面的固定是生物芯片制作 的先决条件，因此提高寡核苷酸、基因片段或蛋白质性质的抗原抗体的固定能力，是制备高 质量生物芯片的关键技术之一。生物芯片基片的表面要有可进行化学反应的活性官能团， 和生物分子进行偶联，基片本身应当有足够的稳定性和生物兼容性。玻璃片因来源丰富，价 格低，具有良好的物理和化学惰性，透明，便于检测，并且有成熟的表面处理方法，而成为生 物芯片基片制作的主要载体之一。以玻璃片为基底的生物芯片，主要是通过表面处理后使用硅烷偶联剂修饰以便与 配基共价结合，早期对玻璃片的修饰多为简单的单层修饰如氨基修饰、醛基修饰、巯基修 饰及聚赖氨酸修饰等。氨基修饰的生物芯片基片是目前使用较多的单层分子修饰的生物芯 片基片之一。但由于单层分子的链接，使得空间位阻较大，非特异性吸附较高，点样均一度 低，结合力较差，信号强度不高，长时间点制高密度芯片时稳定性不佳。随后出现对玻璃片 用硅烷偶联剂修饰后在进行小分子修饰。其中用醛基对氨基修饰的生物芯片基片进行二次 修饰，有一定程度的优化，但没有很好的提高结合力及检测信号强度。这就需要一种键合力 强，非特异性吸附小，信号强度高的生物芯片基片。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种双环氧基修饰的生物芯片基片的制备方 法，所制备得的双环氧基修饰的生物芯片基片，很好地解决了氨基片接点作用力小，点样不 勻，与醛基修饰相比很大程度上提升了芯片的信号强度，可广泛应用在各类生物芯片上。本发明的一种双环氧基修饰的生物芯片基片的制备方法，包括(1)表面处理工艺首先将超声处理过的玻璃片浸泡在体积比为4 1 20的浓 硫酸、过氧化氢和超纯水混合液中，80 130°C下放置30 60分钟，冷却、超纯水冲洗3 5次，然后浸泡于体积比为1 1的浓盐酸和乙醇混合溶液中3 24小时，超纯水清洗3 5次，110 140°C烘干15 30分钟；(2)硅烷偶联剂溶液的配制配制含硅烷偶联剂1 6vol%、冰醋酸0.01 1. 5vol %的无水乙醇溶液，溶液pH = 5 6，磁力搅拌60 90分钟；(3)氨基修饰工艺把经过表面处理的玻璃片迅速放入配制好的硅烷偶联剂溶液中，在25 30°C，相对湿度为30 50%的恒温恒湿箱中放置7 12小时，取出后用无水 乙醇清洗，110 140°C烘干15 30分钟；(4)双环氧基试剂溶液的配制配制含双环氧基试剂1 6vol %的无水乙醇溶液， 磁力搅拌3 5分钟，全过程避光；(5)双环氧基修饰工艺将表面氨基处理过的玻璃片放入双环氧基试剂溶液中， 在25 30°C，相对湿度为30 50%的恒温恒湿箱中放置10 24小时，取出后用无水乙 醇冲洗，110 140°C烘干15 30分钟。所述步骤(2)中的硅烷偶联剂为3-三甲氧基甲硅烷基-1-丙胺。所述步骤(4)中的双环氧基试剂为1，4_ 丁二醇二缩水甘油醚。本发明所使用的试剂(1，4_ 丁二醇二缩水甘油醚)为刚性分子不可以任意扭曲， 其分子式中的两个环氧基只有一个与基片上的氨基反应并开环，另一个则暴露在基片表面 上。由于在简单的氨基修饰后又进行了双环氧基的修饰，增加了基片表面空间，降低了空间 位阻，很大程度上减小了非特异性吸附，键合力强，可以很好固定氨基修饰的核酸探针和蛋 白质性质的抗原抗体等物质，点形饱满、规整，信号强度有很大程度提升。有益效果本发明所提供的生物基片的制备方法简单易行，制备出的生物芯片基片背景低、 表面均一、点样点比较规整、结合力强，非特异性吸附较小，没有拖尾现象，不仅能够很好的 与氨基修饰的核酸结合，还可以与蛋白表面的氨基、羧基、羟基、巯基反应。是一种理想的生 物芯片基片。
图1为环氧基片合成机理图；图2为环氧基片点样试验中点样矩阵示意图；图3为环氧基片点样后的荧光扫描图片；图4为环氧基片的原子力显微镜照片；图5为双环氧基修饰片与醛基修饰片、普通氨基片荧光信号强度对比图，其中 a_普通氨基片；b-醛基修饰片；c-双环氧基修饰片。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。实施例1 (1)分别量取99. 8%无水乙醇115. 7ml，硅烷偶联剂7. 5ml，冰醋酸1. 8ml加入到
三口烧瓶中，室温下磁力搅拌60分钟。(2)将玻璃片放入装有超纯水的染色缸中超声10分钟，超纯水冲洗两次，然后浸 泡于浓硫酸、过氧化氢和超纯水(体积比为4 1 20)的混合液中，在130°C的鼓风干燥 箱中放置30分钟，冷却，用超纯水冲洗3次；然后在浓盐酸和乙醇(体积比为1 1)混合
4溶液中浸泡24小时，超纯水清洗5次，110°C烘干30分钟，冷却至室温。(3)将经过表面处理的玻璃片放入氨基硅烷偶联剂溶液中，然后放入恒温恒湿箱 中，相对湿度控制在50%，温度设定为30°C，分别放置7，12小时，取出后用无水乙醇冲洗3 次，110°C烘干30分钟即得到氨基修饰的生物芯片基片。(4)分别量取99. 8%无水乙醇123. 1ml，双环氧基试剂1. 9ml，加入到烧杯中，磁力 搅拌3分钟，避光；将表面氨基处理过的玻璃片放入其中，在25°C，相对湿度为30%的恒温 恒湿箱中放置10、15、20、24小时，取出后用无水乙醇冲洗，110°C烘干30分钟，即得到双环 氧基修饰的生物芯片基片。实施例2(1)分别量取99. 8%无水乙醇122. 5ml，硅烷偶联剂1. 9ml，冰醋酸0. 5ml加入到
三口烧瓶中，在室温下磁力搅拌90分钟。(2)将玻璃片放入装有超纯水的染色缸中超声5分钟，超纯水冲洗两次，然后浸泡 于浓硫酸、过氧化氢和超纯水(体积比为4 1 20)的混合液中，在80°C的鼓风干燥箱中 放置60分钟，冷却，用超纯水冲洗3次；然后在浓盐酸和乙醇(体积比为1 1)混合溶液 中浸泡3小时，超纯水清洗3次，140°C烘干15分钟，冷却至室温。(3)将经过表面处理的玻璃片放入氨基硅烷偶联剂溶液中，然后放入恒温恒湿箱 中，相对湿度控制在30%，温度设定为25°C，分别放置7，12小时，取出后用无水乙醇冲洗3 次，140°C烘干15分钟即得到氨基修饰的生物芯片基片。(4)分别量取99. 8%无水乙醇117. 5ml，双环氧基试剂7. 5ml，加入到烧杯中，磁力 搅拌5分钟，避光；将表面氨基处理过的玻璃片放入其中，在30°C，相对湿度为50%的恒温 恒湿箱中放置10、12、24小时，取出后用无水乙醇冲洗，140°C烘干15分钟，即得到双环氧基 修饰的生物芯片基片。实施例3双环氧基修饰的生物芯片基片固定能力的检测本实施例所用到的双环氧基修饰的生物芯片基片是按实施例1所述的方法制备 的，本实施例是通过Arrayit SpotBot 2点样仪对环氧基片进行点样试验，点样矩阵设计 示意图如图2所示，然后再通过Axon GenePix 4000B :Cy3 PMT600, PowerlOO扫描仪检测 其荧光信号强度来反映双环氧基修饰的生物芯片基片的固定能力，具体操作如下(1)准备点样样本a.室温下，将 DNA 探针以 0. 05 ii M、0. 1 ii M、0. 5 ii M、1 ii M 的浓度分别到 50 % DMS0/50%H20 的缓冲液中。将抗体探针以 0. 5ii g/iil、lii g/iil、2. 5ii g/iil、5ii g/iil 的 浓度分别到20%甘油/80% H20的缓冲液中；b.将样本根据矩阵设计示意图转移到96孔板或384孔板中，轻敲微孔板使液体流 至孔底，将玻片整齐摆放在点阵仪底盘上；c.启动点阵仪，自上而下在基片的右边点阵5个1号缓冲液5X4的阵列到抽选 的基片上，在基片的左边点阵5个2号缓冲液5X4的阵列到摆放好的基片上。温度控制在 25 °C室温，湿度控制在70%左右。(2)探针与环氧基的结合点样后，将芯片放入芯片盒中，在37°C恒温恒湿箱中静 止24小时。
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(3)洗片a.制备洗涤液 1 (2x SSC/0. 2% SDS)，洗涤液 2 (lx SSC)；b.将芯片置于芯片染色缸中，浸泡在洗涤液1中，室温下轻轻地放下、提起芯片15 下；将芯片转移到盛有洗涤液2的染色皿中，室温下轻轻地放入、提起芯片15下；c.移出染色缸。用去离子水彻底冲洗，冲洗次数不少于2次；用离心法(200Xg for 10s)干燥芯片。(4)扫描a.将一片样本放入扫描仪中，通过专用扫描仪软件将光电倍增管强度调整至 Cy3/PMT600, PowerlOO,点击启动按钮，开始粗扫样本，得到扫描图片如图4所示；b.细扫信号最佳的2个5X4蛋白阵列、2个5X4DNA阵列。读取Cy3背景信号中 值、点信号中值及SD值读数，并计算其差异系数CV值和信噪比S/N值，如表1所示；c.结束扫描，取出样本。表1双环氧基片扫描数据DNA 探针 蛋白探针
权利要求
一种双环氧基修饰的生物芯片基片的制备方法，包括(1)表面处理工艺首先将超声处理过的玻璃片浸泡在体积比为4∶1∶20的浓硫酸、过氧化氢和超纯水混合液中，80～130℃下放置30～60分钟，冷却、超纯水冲洗3～5次，然后浸泡于体积比为1∶1的浓盐酸和乙醇混合溶液中3～24小时，超纯水清洗3～5次，110～140℃烘干15～30分钟；(2)硅烷偶联剂溶液的配制配制含硅烷偶联剂1～6vol％、冰醋酸0.01～1.5vol％的无水乙醇溶液，溶液pH＝5～6，磁力搅拌60～90分钟；(3)氨基修饰工艺把经过表面处理的玻璃片迅速放入配制好的硅烷偶联剂溶液中，在25～30℃，相对湿度为30～50％的恒温恒湿箱中放置7～12小时，取出后用无水乙醇清洗，110～140℃烘干15～30分钟；(4)双环氧基试剂溶液的配制配制含双环氧基试剂1～6vol％的无水乙醇溶液，磁力搅拌3～5分钟，全过程避光；(5)双环氧基修饰工艺将表面氨基处理过的玻璃片放入上述双环氧基试剂溶液中，在25～30℃，相对湿度为30～50％的恒温恒湿箱中放置10～24小时，取出后用无水乙醇冲洗，110～140℃烘干15～30分钟。
2.根据权利要求1所述的一种双环氧基修饰的生物芯片基片的制备方法，其特征在 于所述步骤(2)中的硅烷偶联剂为3-三甲氧基甲硅烷基-1-丙胺。
3.根据权利要求1所述的一种双环氧基修饰的生物芯片基片的制备方法，其特征在 于所述步骤(4)中的双环氧基试剂为1，4_ 丁二醇二缩水甘油醚。
全文摘要
本发明涉及一种双环氧基修饰的生物芯片基片的制备方法，包括表面处理工艺、硅烷偶联剂溶液的配制、氨基修饰工艺、双环氧基试剂溶液的配制、双环氧基修饰工艺。双环氧基试剂中的两个环氧基只有一个与基片上的氨基反应并开环，另一个环氧基暴露在基片表面。本发明所述的双环氧基修饰的生物芯片基片，很好地解决了氨基片接点作用力小，点样不匀，与醛基修饰相比很大程度上提升了芯片的信号强度。其可广泛应用在各类生物芯片上。
文档编号G01N33/552GK101857900SQ20101016783
公开日2010年10月13日 申请日期2010年5月6日 优先权日2010年5月6日
发明者崔博, 张青红, 李耀刚, 王宏志, 马董云 申请人:东华大学