专利名称：一种食品功能因子γ－氨基丁酸的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种食品功能因子γ-氨基丁酸的制备方法，具体涉及微生物生物转化制备γ-氨基丁酸的一种方法，属于食品生物技术领域。
背景技术：
γ-氨基丁酸(GABA)是一种天然存在的活性氨基酸，在动物体的脑、脊髓和肝脏等器官内分布较为集中，植物界也有广泛的分布。动物体内，GABA作为重要的神经递质，具有降血压、改善脑部血液循环、精神安定、健肾利肝和抑制大肠癌变、改善脂质代谢等生理活性。富含GABA的食品具有很好的免疫保健作用，可以作为一种功能性食品，其研究开发也因此受到重视。据报道，日本开发的GABA茶有很好的保健功能，动物实验表明它能安全而显著的降低小白鼠原发性高血压。临床实验也表明，富含GABA米胚芽食品对失眠、焦虑等更年期综合症有突出的改善作用。
GABA的制备方法除化学合成法外，主要是通过微生物酶作用于底物L-谷氨酸的生物转化制备方法。有报道利用黄芪毛根组织培养生产GABA，但产率较低。大肠杆菌具有很高的谷氨酸脱羧酶活性，定量测定谷氨酸就是以大肠杆菌脱羧酶的专一性反应为基础。因而有较多的报道提出利用大肠杆菌细胞固定化生产GABA，能够得到较高生物转化率，但是如果利用大肠杆菌制备GABA用于食品，必然存在安全卫生方面的隐患，不能达到食品卫生的高要求。
最近，有报道指出，乳酸菌、曲霉菌等微生物的耐酸生长机制与他们含有的谷氨酸脱羧酶活力有关，如短乳杆菌、植物乳杆菌、酵母菌等可能具有谷氨酸脱羧酶活力。同时，乳酸菌、酵母菌、曲霉菌是几类广泛用于食品工业的重要微生物，特别是乳酸菌是一类公认为安全的微生物，容易达到食用级的要求，并且这一类菌的免疫疗效和营养功能已经进行了广泛而深入的研究，有肯定疗效和功能，例如乳酸菌对调节人体微循环、提高免疫力有重要作用，对抑制有害菌群的增殖也有显著的效果，等等。因此，利用乳酸菌等进行富含GABA食品的开发，具有很好的前景，国内尚无相关研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种食品功能因子γ-氨基丁酸的制备方法，具体内容涉及利用乳酸菌、酵母菌生物转化制备γ-氨基丁酸的一种方法。
本发明所述一种γ-氨基丁酸的制备方法，是用乳酸菌(Lactobacillusplantarum，Streptococcus lactis，Lactococcus lactis，Lactobaciltuscasei)或乳酸菌和酵母菌(Saccharomyces sp)混用作为菌种，以L-谷氨酸钠(L-MSG)为转化底物，采用适当碳源和氮源以及无机盐组成发酵培养基，发酵法生物转化制备γ-氨基丁酸。
菌种植物乳杆菌Lactobacillus piantarum AS1.550，植物乳杆菌Lactobacillus plantarum AS1.557，植物乳杆菌Lactocbacillusplantarum CNIFFI6003，植物乳杆菌Lactocbacillus plantarumCNIFFI6014，乳酸链球菌Streptococcus lactis CNIFFI6015，乳酸链球菌Streptococcus lactis CNIFFI6016，乳酸链球菌Streptococcuslactis CNIFFI6034，乳酸链球菌Streptococcus lactis CNIFFI6036，乳酸链球菌Streptococcus lactis CNIFFI6048，乳酸链球菌Streptococcus lactis CNIFFI6017，乳酸链球菌Streptococcus lactisCNIFFI6018，乳酸链球菌Streptococcus lactis CNIFFI6021，乳酸链球菌Streptococcus lactis CNIFFI6023，乳酸乳球菌乳脂亚种Lactococcus lactis subsp cremoris AS1.9，干酪乳杆菌干酪亚种Lactobacillus casei subsp casei AS1.539。
酵母菌商品安琪高活性干酵母(高糖型)，湖北安琪酵母股份有限公司。
以上菌种均已公开，AS编号表示(China General MicrobiologicalCulture Collection Center(CGMCC)，Institute of Microbiology，Chinese Academy of Science；中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心)，其后编号代表保藏编号。CNIFFI编号表示(China NationalInstitute of Food & Fermentation Industries；中国微生物菌种保藏委员会工业微生物菌种保藏管理中心)，其后编号代表保藏编号。
有关内容详见2002年3月出版的《食品与发酵工业》第二十七卷(2001年增刊)中国工业微生物菌种目录，第IV页，第11页，第13页。
安琪高活性干酵母，为市售商品，详见湖北宜昌安琪酵母股份有限公司产品目录。
本发明采用的以上菌种在江南大学食品学院食品科学研究室有保藏，对应保藏编号为SYFS1.001，SYFS1.002，SYFS1.003，SYFS1.004，SYFS1.005，SYFS1.006，SYFS1.007，SYFS1.008，SYFS1.009，SYFS1.010，SYFS1.011，SYFS1.012，SYFS1.013，SYFS1.014，SYFS1.015。(注SYFS编号为江南大学食品学院食品科学研究室菌种保藏编号，菌种来源皆为以上提及机构)用单一的乳酸菌作菌种时，选用SYFS1.008，SYFS1.009效果较好。
用乳酸菌和酵母菌混用作菌种，则酵母菌与各乳酸菌种均能配合混用。因酵母菌发酵生长时能水解蛋白产生L-谷氨酸，故发酵时底物L-谷氨酸钠可少用或不用，若仍用相同量的L-谷氨酸钠底物，则转化效果会更好，使用混用菌种时，则其反应机理就较为复杂。
选用混用菌种时，先分别进行种子培养，然后同时接种入发酵培养基中混合进行发酵。
培养基琼脂斜面保藏培养基(％)酵母膏1.0％，葡萄糖1.5％，碳酸钙1.5％，琼脂1.5％。
24#乳酸菌培养基(％)牛肉膏0.5％，酵母膏0.5％，葡萄糖1.0％，乳糖0.5％，蛋白胨1.0％，NaCl0.5％，琼脂2.0％，pH6.8。
PY基础培养基(％)内含蛋白胨0.5％，胰胨(Tryptone)0.5％，酵母提取物1.0％，盐溶液4.0ml/1 00ml，(盐溶液g/1000ml含CaCl2，0.2；MgSO4·7H2O，0.48；K2HPO4，1.0；KH2PO4，1.0；NaHCO3，10.0；NaCl，2.0)，pH6.8。
发酵种子培养基MRS液体培养基。
GYP发酵培养基(％)葡萄糖1.0％，酵母膏1.0％，蛋白胨0.5％，乙酸钠0.2％，L-MSG1.0％，MgSO4·7H2O20ppm，MnSO4·4H2O1ppm，NaCl1ppm，FeSO4·7H2O1ppm，pH6.8。
制备工艺菌种保存所选菌种根据要求分别在琼脂斜面保藏培养基、24#乳酸菌培养基上传代，冰箱4℃保存，2～4周转接一次，使用前活化2次。
种子培养在GYP发酵培养基或者MRS液体培养基中进行，发酵前经2次传代，培养16小时。
发酵培养16小时的种子培养液离心收集菌体，用无菌水制成菌体悬浮液(～109CFU/ml)，以0.2％～2.0％的接种量接入添加不同碳源和氮源的PY培养基中，250ml三角瓶中的装液量为50ml。碳源分别为葡萄糖，麦芽糖，可溶性淀粉，以及它们与L-谷氨酸钠(L-MSG)的混合物，添加水平0.5％～3％。氮源分别为蛋白胨、胰胨、酪蛋白、酪蛋白磷酸肽(CPP)、脱脂豆粕粉、玉米浆、脱脂棉籽饼粉、脱脂花生饼粉、米糠、鱼粉、酵母膏、(NH4)2SO4、NaNO3，添加水平0.5％～5％。25℃～40℃静置培养1～6天，得到γ-氨基丁酸溶液。
所得到的终了发酵液中，γ-氨基丁酸含量可达到300～500mg/100ml，此溶液可中和脱臭后，直接干燥制成粉剂，粉剂中γ-氨基丁酸含量在5％以上。也可进一步精制纯化，用作功能性食品添加剂。
结晶纯化将γ-氨基丁酸溶液用强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂进行离子交换，氨水洗涤、提取，再经树脂纯化、浓缩、结晶、干燥后即得成品γ-氨基丁酸。
实验检测GABA含量的方法如下发酵液中氨基酸定量氨基酸自动分析仪法(日立L-835氨基酸自动分析仪)，25ml发酵液中加入10ml 10％的三氯乙酸(TCA)，震荡均匀，适当稀释后，经0.45μm膜过滤，过滤清液送氨基酸自动分析仪分析。
通过实验，得到了影响γ-氨基丁酸(GABA)收率的主要因素如下不同菌种对GABA收率的影响。
在GYP培养基中添加1％的L-MSG(纯度99.9％以上，上海冠生园)，对初选的一些乳酸菌、乳酸菌和酵母菌混用试样进行发酵实验，发酵后对发酵液进行检测，结果表明SYFS1.008，SYFS1.009的GABA产率较高。不同菌种对GABA的生成有较为显著的区别。
发酵时间的影响了解乳酸菌SYFS1.009的发酵过程，观察其在GYP培养基中的生长曲线，接种量为0.5％，结果显示其发酵速度很快，6小时左右进入旺盛期，14小时后达到生长对数后期，因此作为种子的培养基培养时间确定为14～16小时，以保证发酵过程有旺盛生长的菌体，如图1所示。实验取得了满意的结果。
接种量的影响观察发酵时0.2％～6.0％的接种量的影响，对不同接种量的培养液发酵后的发酵液进行检测，结果显示，接种量对GABA的产率和终了酸度没有显著影响，这可能是由于菌体悬浮液的活菌数基数很大，而且乳酸菌的增殖速度很快，不足以引起显著差别。
碳源及浓度的影响在PY基础培养基中分别添加碳源葡萄糖(6LC)、麦芽糖(Malt)、可溶性淀粉(SS)以及它们与L-MSG的混合物，添加量都为1％，对发酵后发酵液进行检测，结果如图2所示，葡萄糖和L-MSG的混合物对GABA的收率为最好，且葡萄糖成本也不高，因此选定葡萄糖与L-MSG的混合物为碳源，添加水平为0.5％～3％，添加量分别为0.5％和1.0％为较好。
考察葡萄糖浓度的影响，结果如图3所示，在低葡萄糖浓度时，GABA的生成量高，这是因为乳酸菌具有一定的产酸能力，碳源浓度降低，产酸的量减少，这在一定程度上对菌种维持较高的酶活有关。
氮源的影响对实验后发酵液检测表明，蛋白胨(peptone)、胰胨(tryptone)、酪蛋白(casein)、酪蛋白磷酸肽(CPP)、玉米浆、脱脂棉籽饼粉、脱脂花生饼粉、脱脂豆粕粉、米糠、鱼粉、酵母膏、(NH4)2SO4、NaNO3均可作为氮源，添加浓度为0.5％～5％，均能得到较好的GABA产率(图4)。尤以有机氮源作为氮源时，GABA得率更高，比无机氮源的效果要好。在我国，以上提及的有机氮源资源十分丰富，其中如豆粕粉、酪蛋白、花生饼粉等本身就是优良的食用蛋白资源，如用它们为原料通过生物技术提高活性因子GABA的含量，就能制备附加值更高的功能性食品，前景极为广阔。
本发明的优点是提供了一种利用乳酸菌或乳酸菌和酵母菌混用作为菌种的生物转化制备γ一氨基丁酸的方法，表明在25℃～40℃条件下，所选菌种在MRS培养基、PYG培养基中生长良好。通过发酵，GABA的产量达到300～500mg/100ml。发酵培养基采用适宜的碳源为葡萄糖，氮源选用玉米浆、酵母膏、脱脂花生饼粉、脱脂棉籽饼粉、脱脂豆粕粉、米糠、酪蛋白等中的一种或者混合使用。所选菌种已经公认达到食品级的要求，保证了食用的安全，而且实验中采用的乳酸菌类已经证明具有免疫疗效和营养功能，如采用该菌发酵直接制备成生物制剂，将会有更高的生理活性。
图1SYFS1.009的生长发酵进程。图2碳源种类对GABA积累的影响。图3碳源浓度对GABA生成的影响。图4一些氮源对GABA积累的影响。
具体实施例方式
实施例1选用乳酸菌SYFS1.009作为菌种，在GYP发酵培养基中进行种子培养，接种量为0.5％，培养时间为16小时，所得种子培养液离心收集菌体，用无菌水制成菌体悬浮种子液，内含108～109CFU/ml(平板计数)。在250ml三角瓶中装入50ml发酵培养基，接种0.2％悬浮种子液，添加葡萄糖1％和L-谷氨酸钠1％作为碳源，添加酪蛋白1％作为氮源，静置培养24小时，得γ-氨基丁酸溶液，GABA含量约为280mg/100ml。
实施例2选用乳酸菌SYFS1.008，种子培养和发酵条件同实施例1，得γ-氨基丁酸溶液，GABA含量约为200mg/100ml。
实施例3选用乳酸菌SYFS1.009和安琪活性干酵母作菌种，种子培养和发酵条件同实施例1，先分别进行种子培养，然后对悬浮种子液各接种0.2％混合作为种子液进行发酵，得γ-氨基丁酸溶液，GABA含量约为300～350mg/100ml。发酵液经喷雾干燥后的粉剂含γ-氨基丁酸4％～6％。
实施例4选用乳酸菌SYFS1.009作菌种，10％脱脂乳粉中添加0.5％L-谷氨酸钠，0.2％普通酸奶稳定剂，3～6％的糖等，巴氏杀菌。接种后静置发酵，得到含γ-氨基丁酸200mg/100ml的酸奶，风味良好。
实施例5选用乳酸菌SYFS1.009作菌种，5％的米胚芽和0.5％脱脂豆粕粉制成悬浮液，经均质处理后，添加0.5％葡萄糖，0.5％L-MSG，灭菌，接种发酵，得到含γ-氨基丁酸150mg/100ml的制品。
权利要求
1.一种γ-氨基丁酸的制备方法，其特征是用乳酸菌(lactobacillusplantarum，streptococcus lactis，Lactococcus lactis，Lactobacilluscasei)或乳酸菌和酵母菌(Saccharomyces sp)混用作为菌种，以L-谷氨酸钠(L-MSG)为转化底物，采用适当碳源和氮源以及无机盐组成发酵培养基，发酵法生物转化制备γ-氨基丁酸，A.菌种采用单一乳酸菌或乳酸菌和酵母菌混用作为菌种，B.培养基琼脂斜面保藏培养基(％)酵母膏1.0％，葡萄糖1.5％，碳酸钙1.5％，琼脂1.5％，24#乳酸菌培养基(％)牛肉膏0.5％，酵母膏0.5％，葡萄糖1.0％，乳糖0.5％，蛋白胨1.0％，NaCl 0.5％，琼脂2.0％，pH6.8，PY基础培养基(％)内含蛋白胨0.5％，胰胨(Tryptone)0.5％，酵母提取物1.0％，盐溶液4.0ml/100ml，(盐溶液g/1000ml含CaCl2，0.2；MgSO4·7H2O，0.48；K2HPO4，1.0；KH2PO4，1.0；NaHCO3，10.0；NaCl，2.0)，pH6.8，发酵种子培养基MRS液体培养基，GYP发酵培养基(％)葡萄糖1.0％，酵母膏1.0％，蛋白胨0.5％，乙酸钠0.2％，L-MSG1.0％，MgSO4·7H2O20ppm，MnSO4·4H2O1ppm，NaCl1ppm，FeSO1·7H2O1ppm，pH6.8，C.制备工艺菌种保存所选菌种根据要求分别在琼脂斜面保藏培养基、24#乳酸菌培养基上传代，冰箱4℃保存，2～4周转接一次，使用前活化2次，种子培养在GYP发酵培养基或者MRS液体培养基中进行，发酵前经2次传代，培养16小时，发酵培养16小时的种子培养液离心收集菌体，用无菌水制成菌体悬浮液(～109CFU/ml)，以0.2％～2.0％的接种量，接入添加不同碳源和氮源的PY基础培养基中，250ml三角瓶中的装液量为50ml，碳源分别为葡萄糖，麦芽糖，可溶性淀粉，以及它们与L-谷氨酸钠(L-MSG)的混合物，添加水平0.5％～3％，氮源分别为蛋白胨、胰胨、酪蛋白、酪蛋白磷酸肽(CPP)、脱脂豆粕粉，玉米浆、酵母膏、脱脂花生饼粉、脱脂棉籽饼粉、米糠、酪蛋白等，添加水平0.5％～5％，25℃～40℃静置培养1～6天，得到γ-氨基丁酸发酵液，所得到的终了发酵液中，γ-氨基丁酸含量可达到300～500mg/100ml，此溶液脱臭后，可直接干燥制成粉剂，粉剂中γ-氨基丁酸含量在5％以上，也可进一步精制纯化，用作功能性食品添加剂，D.结晶纯化将γ-氨基丁酸溶液用强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂进行离子交换，氨水洗涤、提取，再经树脂纯化、浓缩、结晶、干燥后即得成品γ-氨基丁酸。
2.如权利要求1所述的一种γ-氨基丁酸的制备方法，其特征是选用乳酸菌分别为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum AS1.550，植物乳杆菌Lactobacillus plantarum AS1.557，植物乳杆菌Lactocbacillusplantarum CNIFFI6003，植物乳杆菌Lactocbacillus plantarumCNIFFI6014，乳酸链球菌Streptococcus lactis CNIFFI6015，乳酸链球菌Streptococcus lactis CNIFFI6016，乳酸链球菌Streptococcuslactis CNIFFI6034，乳酸链球菌Streptococcus lactis CNIFFI6036，乳酸链球菌Streptococcus lactis CNIFFI6048，乳酸链球菌Streptococcus lactis CNIFFI6017，乳酸链球菌Streptococcus lactisCNIFFI6018，乳酸链球菌Streptococcus lactis CNIFFI6021，乳酸链球菌Streptococcus lactis CNIFFI6023，乳酸乳球菌乳脂亚种Lactococcus lactis subsp cremoris AS1.9，干酪乳杆菌干酪亚种Lactobacillus casei subsp casei AS1.539，选用酵母菌为商品安琪高活性干酵母(高糖型)，湖北安琪酵母股份有限公司，以上菌种在江南大学食品学院食品科学研究室有保藏，对应保藏编号为SYFS1.001，SYFS1.002，SYFS1.003，SYFS1.004，SYFS1.005，SYFS1.006，SYFS1.007，SYFS1.008，SYFS1.009，SYFS1.010，SYFS1.011，SYFS1.012，SYFS1.013，SYFS1.014，SYFS1.015。
3.如权利要求1、2所述的一种γ-氨基丁酸的制备方法，其特征是选用单一乳酸菌作菌种时，SYFS1.008，SYFS1.009的效果较好，如选用混用菌种时，乳酸菌和酵母菌先分别进行种子培养，然后接种入发酵培养基中混合发酵。
4.如权利要求1所述的一种γ-氨基丁酸的制备方法，其特征是碳源选用葡萄糖和L-谷氨酸钠的混合物为最好，葡萄糖和L-谷氨酸钠的添加量分别为0.5％和1.0％。
5.如权利要求1所述的一种γ-氨基丁酸的制备方法，其特征是氮源选用玉米浆、酵母膏、脱脂花生饼粉、脱脂棉籽饼粉、脱脂豆粕粉、米糠、酪蛋白中的一种或者几种混用，浓度为0.5％～5％。
全文摘要
一种食品功能因子γ－氨基丁酸的制备方法，具体涉及利用微生物生物转化制备γ－氨基丁酸(GABA)的一种方法，属于食品生物技术领域。用乳酸菌或者乳酸菌和酵母菌混用作为菌种，以L－谷氨酸钠为转化底物，添加碳源、氮源以及无机盐组成发酵培养基，利用发酵法生物转化制备γ－氨基丁酸。所选乳酸菌在MRS、PYG培养基中，25℃～40℃条件下培养时，生长良好，可作为种子培养液。发酵生产时，培养基适宜的碳源采用葡萄糖，氮源可选用玉米浆、酵母膏、脱脂花生饼粉、脱脂棉籽饼粉、脱脂豆粕粉、米糠、酪蛋白等中的一种或者几种混用。发酵后经检测，γ－氨基丁酸在发酵液中的浓度高达300～500mg/100ml。本发明所得产品安全可靠，具有很高的生理功能。
文档编号C12P13/00GK1392262SQ02113140
公开日2003年1月22日 申请日期2002年6月8日 优先权日2002年6月8日
发明者江波, 许时婴, 许建军 申请人:江南大学