专利名称：家蚕生物反应器生产的人类胰岛素生长因子－Ⅰ口服降血糖的方法
技术领域：
本发明涉及基因工程和生物制药领域，具体而言，特指用家蚕生物反应器生产的人类胰岛素生长因子-I口服降血糖的方法，其将人类胰岛素生长因子-I(简称IGF-I)经口服给予动物，经消化系统吸收后，发挥IGF-I的生理功能，降低动物血液中的血糖浓度，以治疗糖尿病。
背景技术：
成熟的IGF-I是由70个氨基酸组成的多肽，分子量约为7.5kD，人体中的IGF-I主要有肝脏合成和分泌。在动物机体中IGF-I主要有两大类重要的生理功能一为胰岛素作用相似的代谢效应，即刺激动物组织吸收葡萄糖，促进糖原和脂肪的合成，降低血液中血糖的浓度；另一个功能主要促进有丝分裂作用，即通过刺激核酸和蛋白质的合成，促进细胞增殖从而促进动物的生长和肌肉的生成(Sehoenle，E et al，Nature.1982，296252)。
最新研究表明IGF-I还有促进淋巴细胞增生，调节T细胞的分化，提高机体的免疫功能的作用(Tritos，NA et al，Am.J.Med 1998，10544-57)，还有报道IGF-I注射可促进骨软化，提高骨钙素生成等机能，提示可用于治疗骨质疏松症(Rosen，CJ et al，Bone.1997，21217-223)。
IGF-I目前最有治疗效果的疾病是糖尿病。IGF-I的功能与胰岛素基本一致，而且IGF-I是通过IGF-I特异性受体进而刺激机体吸收血糖的能力。因此，可以避免胰岛素受体功能的早期缺陷，治疗由胰岛素受体和受体后障碍所引起的极度胰岛素抵抗性的糖尿病。
但是上述治疗均是用IGF-I注射法所进行的，频繁的注射IGF-I不仅给病人造成痛苦，而且极大地增加了由于注射所引起的血液感染及传染病发生的机率。而且针剂产品的纯化及生产所要求的成本和要求均比较高。
IGF-I在大肠杆菌、哺乳动物细胞及昆虫细胞中均有表达的报告，但是在哺乳动物细胞中的表达量低、成本太高。而在大肠杆菌表达系统中，必须采用融合表达并且须在大肠杆菌蛋白酶缺陷菌株中才能检测到免疫学活性(李伯良等，生物化学与生物物理学报。1994，26153-160)。故存在着活性差、表达量低、产物的后加工性不佳等缺点。
发明内容
本发明的目的是提供家蚕生物反应器生产的人类胰岛素生长因子-I口服降血糖的方法。家蚕表达的IGF-I基因工程产品经初步纯化后，口服给予动物，被动物消化系统吸收后，在机体内发挥IGF-I的生理功能，达到降低血糖浓度的目的。
本发明的目的是通过下述方法所实现其特征在于将完整的人类胰岛素生长因子基因克隆于杆状病毒转移载体，制备相应的载体DNA，与亲本病毒DNA在昆虫宿主细胞内进行共转体，产生重组病毒，经筛选获得含类胰岛素生长因子基因的重组病毒并感染家蚕进行表达，用在家蚕中生产的人类胰岛素生长因子-I，经口服给予人类和动物进行降血糖治疗。
本技术方案所述的最优昆虫宿主是家蚕，所述的最优杆状病毒是家蚕杆状病毒BmNPV，最优的感染宿主时期是家蚕五龄期幼虫和蛹期，感染方法为经皮肤穿刺接种。所述的杆状病毒转移载体是pVL1393和pBm030，所述的含类胰岛素生长因子基因的重组病毒为重组家蚕杆状病毒rBmNPV-(IGF-I)。所述的口服治疗的动物为牛、羊、猪、马、鸡等主要的家畜、家禽、鱼类。
本技术方案所述的家蚕生物反应器生产的人类胰岛素生长因子-I经口服后可提高其免疫力，对幼年动物肠道发育有促进作用，对动物还具有促生长和促进肌肉生成的作用。
本发明采用基因表达技术，将来源于各种生物(人、家禽、家畜、鱼、类等)的类胰岛素生长因子基因构建到各种病毒运载载体中，使类胰岛素生长因子基因在杆状病毒的强启动子如多角体蛋白基因启动子、p10基因启动子、IE-1基因启动子或其它病毒基因和真核生物基因启动子的控制之下，通过体内或体外(in vivo/in vitro)重组，将IGF-I基因整合到杆状病毒基因组中，并使之在上述的强启动子的正确控制之下，得到重组病毒。重组病毒可通过经口或各种手段透过表皮，进行血液感染宿主并生产IGF-I基因工程产品，生产的基因工程产品可通过口服途径，在生物机体内发挥IGF-I的正确生理功能。
本发明中的最优化方案是将来源于人的IGF-I的cDNA序列经家蚕杆状病毒BamHI酶解后插入到转移载体pVL1393的BamHI位点，经酶切和PCR反应确证IGF-I基因正确地重组到转移载体pVL1393上，得到重组质粒pVL1393-IGF-I。用脂质体将pVL1393-IGF-I DNA和亲本病毒BmNPV-ZJ8 DNA进行包埋转染BmN细胞，在体内发生重组，替代基因组上的多角体蛋白基因，通过空斑筛选技术和PCR检测技术获得携带IGF-I基因且可进行表达的重组家蚕杆状病毒rBmNPV-(IGF-I)。进行不同的重组病毒株系表达水平比较、筛选，获得和固定可进行高表达的rBmNPV-(IGF-I)。将其感染家蚕细胞系或穿刺接种4-5龄期的家蚕幼虫、预蛹或蛹，可大量繁殖rBmNPV-(IGF-I)。当rBmNPV-(IGF-I)在蚕体复制时，IGF-I基因在多角体蛋白基因启动子控制下进行表达并在蚕体或蛹体内进行正确的表达产物后加工，获得有生物活性的IGF-I产物。表达产物经病毒灭活及其它杂质的去除、纯化后，用模式动物为成年的昆明小鼠进行实验，经口灌注人工诱导的高血糖昆明小鼠，测定灌注经口给予IGF-I与对照及正常昆明小鼠的血液中血糖浓度。证明家蚕生产的人类胰岛素基因产品经口服能在动物体内发挥正确的生理功能。
虽然在本发明所采用的模式生物为小鼠，但由于所用的基因工程产品为人的类胰岛素生长因子，所以它可广泛用于人类的类似治疗。同时，由于人的IGF-I基因与牛、羊、猪、马、鸡等主要的家畜、家禽的IGF-I基因同源性非常高，有些甚至高达90％以上，则IGF-I基因工程产品同样可经口服在上述动物中应用。
综上所述，本发明的优点在于；1.用家蚕生物反应器生产IGF-I基因工程产品表达率高。将IGF-I基因重组进入家蚕杆状病毒，通过比较、固定获得高表达的重组病毒rBmNPV-(IGF-I)感染家蚕或蛹后，IGF-I基因获得高表达，每毫升蚕血淋巴可生产30微克以上的IGF-I，且对细胞刺激生长的活力高于商用标准品，一条蚕(或蛹)可生产高达100微克(60μg)以上的IGF-I。
2.用家蚕生物反应器生产IGF-I基因工程产品生物活性好。家蚕由于本身具有的激素基因之一PTTH与IGF-I基因的结构基本相同及两者的后加工过程完全一致(Atsushi，K et al，Science，1990，2471333-35)，家蚕适于表达这一类基因。因此，本发明中家蚕表达的IGF-I基因的活性比商用的标准品还高。
3.用家蚕生物反应器生产IGF-I基因工程产品成本低，因为家蚕是目前唯一可进行大规模商业化无菌饲养的昆虫物种。
4.本发明的家蚕生产的IGF-I基因工程产品特点在于可经口服在生物体内发挥正确的生理功能。这样不仅可以免除频繁注射所带来的痛苦，减少因针头和药物等引起的感染和血原性疾病的传播，而且可以大大降低IGF-I的生产成本。
本发明通过以下附图和实施例作进一步阐述，但并不限制本发明范围。
四
图1、重组运载转移载体pVL1393(IGF-I)的构建2、重组运载转移载体pVL1393(IGF-I)和重组rBmNPV-(IGF-I)的PCR鉴定图谱Lane1Lamda DNA/Hind III markerLane2pVL1393(IGF-I)DNA模板Lane3-7不同重组斑rBmNPV-(IGF-I)的DNA模板Lane8亲本BmNPV DNA模板图3、rBmNPV-(IGF-I)在家蚕幼虫体内的表达时相图4、rBmNPV-(IGF-I)在家蚕蛹体内的表达时相图5、家蚕生产的IGF-I生物活性测定图Lane1培养基含10％FBSLane2培养基无血清Lane3培养基含25ng/ml商用IGF-ILane4培养基含蚕生产的25ng/ml IGF-ILane5培养基含相应蛋白含量的病蚕血淋巴图6、家蚕生物反应器生产的IGF-I口服降血糖效果Lane1正常小鼠Lane2高糖小鼠1(喂食相应蛋白含量的病蚕血淋巴)Lane3高糖小鼠2(喂食相应蛋白含量的病蚕血淋巴)Lane4高糖小鼠1(喂食蚕生产的6微克IGF-I)Lane5高糖小鼠2(喂食蚕生产的6微克IGF-I)图7、IGF-I口服剂量与降血糖效果的关系五、实施方式实验材料1.菌株、载体、大肠杆菌株E.coli TG1和DH5α购自Promega公司；转移载体pVL1393、家蚕细胞BmN、家蚕核型多角体病毒亲本株BmNPV-ZJ8、家蚕品种JY1由中国农业科学院蚕业研究所农业部家蚕生物技术重点开放实验室保存；人类胰岛素生长因子基因和NIH3T3细胞由中国科学院上海生化所吴祥甫研究员惠赠；本实验所用的昆明小鼠订购自镇江医学院。2.酶与试剂限制性内切酶、连接酶为Boehringer公司产品。3.生化试剂IPTG、X-Gal、为Sigma公司产品。过硫酸铵、TEMED、丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺为Promega公司产品。Lipofectin、低融点琼脂糖LMP、PCR试剂盒、T4DNA连接酶、RNA酶、Proteinase K、细胞培养基TC-100、RMPI1640、胎牛血清、人IGF-I标准品(Cat.No.13245-063)及其他试剂购于GIBCO-BRL公司；人IGF-I ELISA试剂盒订购自DSL公司U.S.A(Cat.No.DSL2800)。4.培养基大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)；家蚕细胞培养基为含10％FBS的TC-100；NIH3T3培养基为补充10％FBS的RMPI1640。实施例一、重组病毒rBmNPV-(IGF-I)的构建及在家蚕中的表达。1.重组转移载体pVL1393-(IGF-I)的构建将IGF-I基因用BamHI酶切pGEM3Z(IGF-I)质粒，得到IGF-I/BamHI片断，将之与用BamHI酶切的pVL1393载体进行连接，转化TGI菌株，从中筛选重组子。进一步用设计的pVL1393载体上的多角体蛋白基因启动子序列上的特异性引物和IGF-I基因上的特异性引物序列进行PCR反应，以验证IGF-I的插入方向，载体的构建和PCR鉴定如图1和2所示。2.重组杆状病毒rBmNPV-(IGF-I)的构建接种大约1×106细胞于15cm2培养瓶中，细胞贴壁后，除去含胎牛血清(FBS)培养基，用不含FBS的培养基洗三次，加1.5ml无FBS培养基。向一灭菌管中依次加入1μg家蚕杆状病毒亲本株BmNPV-ZJ8 DNA，2μg重组转移质粒pVL1393-(IGF-I)DNA和5μl脂质体，用无菌双蒸水补足体积到60μl，轻轻混匀，静置15分钟后，逐滴加入到培养瓶中进行共转染。27℃培养4小时后补加1.5ml无血清培养基和300μl FBS。27℃恒温培养4～5天，收集上清液用于重组病毒的筛选。3.重组家蚕杆状病毒rBmNPV-(IGF-I)的筛选和纯化接种适量细胞(约70～80％)于35mm小平皿中，细胞贴壁后，吸去培养基，将共转染上清进行不同浓度稀释，取1ml共转染稀液加到贴壁细胞中，分布均匀。27℃感染1小时后，吸去感染液，将2％低融点琼脂糖凝胶于60℃水浴中融化，冷至40℃与40℃预热的2×TC-100培养基(含20％FBS)混合均匀，每平皿加4ml胶，待凝固后用Parafilm封口，27℃倒置培养3～5天，显微镜观察。将不含有多角体的空斑挑选出来，重复以上步骤，经过2～3轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rBmNPV-(IGF-I)。4.重组病毒rBmNPV-(IGF-I)在家蚕细胞中的扩增将重组家蚕杆状病毒rBmNPV(IGF-I)感染正常生长的BmN细胞，培养3天后收集上清液，上清液中即含有大量的重组病毒rBmNPV-(IGF-I)。5.重组病毒的鉴定利用PCR方法分析外源基因整合。游离病毒基因组DNA的提取方法如下取病毒上清150μl，加入150μl(0.5mol/L)的NaOH后混匀，再加入20μl(8mol/L)的醋酸铵，混匀后用等体积的酚和氯仿分别抽提一次，酒精沉淀后用20μl的TE溶解DNA。寡核苷酸引物为phF.ID5‘-ACTGTTTTCGTAACAGTTTTGTAAIGF-IIDR5‘-TTGGGCATGTCGGTGTGGCG取上述病毒基因组DNA 1μl进行PCR扩增，反应条件为94℃变性5min、94℃1min、55℃ 1min、72℃ 30s，30个循环，最后72℃延伸5min。取15μl反应产物电泳分析，结果见图2。从鉴定出的rBmNPV-(IGF-I)扩增特异性片断的不同病毒斑中挑选感染家蚕良好、表达量高的斑，作为病毒母种。6.IGF-I基因在家蚕幼虫中的表达。
本实验所用的家蚕高表达品种为JY1(由本实验室保存)。JY1品种家蚕饲养按吕鸿声主编的《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规方法进行。饷食后48h选择平均体重相同的15头家蚕为一组，每头蚕接种约1.0×105rBmNPV(IGF-I)，即5μl接种液中含2.0×105pfu/ml的rBmNPV-(IGF-I)，共14组(含2组对照)，在病毒感染后分别按48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h的时间取血样并用ELISA法标定血淋巴中的IGF-I含量，重复三次。结果由图3所示，从感染病毒60h开始，IGF-I开始表达，随着时间的增加，所表达的酶活也随之增加，在病毒感染后84～96小时间达最高，每ml蚕血淋巴IGF-I含量达33.5-35.9μg/ml，随后IGF-I含量开始下降。7.IGF-I基因在家蚕蛹体中表达本实验所用的家蚕蛹为高表达品种为JY1(由本实验室保存)。JY1品种家蚕饲养按吕鸿声主编的《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规方法进行。结茧七天后选择平均体重相同的15粒蚕蛹为一组，每头蛹接种约1.0×105rBmNPV(IGF-I)，即5μl接种液中含2.0×107pfu/ml的rBmNPV(IGF-I)，共12组(含2组对照)，在病毒感染后按60h、72h、84h、96h、108h的时间取血样并用ELISA法标定蛹血中IGF-I含量，重复三次。结果如图4所示，从感染病毒60h开始，IGF-I开始表达，随着时间的增加，所表达的量也随之增加，在病毒感染后84小时达最高，每ml蚕蛹血淋巴IGF-I含量达37.9μg/ml，随后含量开始下降，从它的表达时相分析IGF-I达到最高表达量的时相，比通常的外源基因要早，而且后期表达量明显下降，说明有某些因子影响了IGF-I含量在宿主体内的继续累积，有可能通过去除这些影响因素获得更高的表达量。8.家蚕表达的IGF-I的生物活性的测定。
本实验所用的细胞系为NIH3T3，所用的培养基为含10％FBS的RMPI1640。选用细胞生长良好，存活率超过92％的细胞，接种到96孔板，每孔的接种密度为5000个细胞，细胞贴壁后，换用无血清培养基培养4小时。
设置以下处理1)含10％FBS的RMPI1640培养基；2)无血清RMPI1640培养基；3)含25ng/ml标准品IGF-I的RMPI培养基；4)含25ng/ml家蚕生产的IGF-I RMPI1640培养基；5)含相应蛋白量的wtBmNPV感染蚕血液的RMPI1640培养基。
继续培养72hr后，用MTT法测定细胞密度，以确定其促细胞生长的生物活性。实验结果如图5所示，表明家蚕生产IGF-I的生物活力远比市售的标准品IGF-I要高。实施例二、家蚕生物反应器生产的IGF-I口服降血糖效果。本实验中所用的实验动物为昆明小鼠。1.高血糖小鼠的制备用含15％的蔗糖水代替蒸馏水喂饲小鼠，其它饲养方法按《医学实验动物学》(魏泓主编，四川科技出版社，1998)的方法进行。2.用高糖水喂饲10天后，用磷钼酸比色法(北大生化教研室编，生物化学实验指导。高教出版社，1979)测定血糖浓度，监测喂饲糖后，小鼠血液中血糖含量的变化。3.连续喂饲高糖水15天后，小鼠的血糖达到一定的浓度后。进行口饲IGF-I的降血糖实验。实验分为5组，每组10只小鼠(5雌、5雄)第一组为未喂饲高糖的正常鼠对照；第2、3组为喂饲高糖，而灌注相应蛋白含量蚕血处理的高糖对照；第4、5组为每只小鼠灌注法口服6μg家蚕生产的IGF-I的IGF-I处理组。4.口服IGF-I16小时后，取所有5组小鼠的血液，分别测定血糖浓度。结果如图6所示。从图6可知经口服灌注每只小鼠6μg的家蚕生产的IGF-I后，血糖浓度平均从405mg/100ml下降到258mg/ml，接近于正常小鼠血糖值的高限，降糖效果十分明显。实施例三、IGF-I口服剂量与降血糖的关系所有实验动物、血糖测定方法、高血糖小鼠的制备同实施例二。
实验分为6组进行，每组小鼠雌雄各5只。实验组1为正常小鼠对照；实验组2为高糖小鼠，灌注法喂饲相应蛋白含量的蚕血为高糖对照；实验组3为高糖鼠灌注法喂饲2μg IGF-I组；实验组4为高糖鼠灌注法喂饲4μg IGF-I组；实验组5为高糖鼠灌注法喂饲6μg IGF-I组；实验组6为高糖鼠灌注法喂饲8μg IGF-I组。IGF-I处理后16小时，取血样测定各组小鼠中血糖浓度。实验结果如图7所示从图7可知，喂饲不同浓度的IGF-I各处理均有明显的降血糖效果，高糖组对照组血糖浓度429mg/ml，而经2μg IGF-I口服灌注组降为364mg/100ml，就有明显的降糖效果。随着IGF-I的用量增加，血糖浓度随之下降，至8μg IGF-I组降为235mg/100ml。
上述实施例说明，家蚕生产的IGF-I基因工程产品能被动物所吸收，并在体内发生正确的IGF-I生理功能。
附表！ 人类胰岛素生长因子-I的DNA序列图GGA TCC TTG AAG GTG AAG ATG CAC ACC ATG TCC TCC TCGCAT CTC TTC TAC CTG GCG CTG TGC CTG CTC ACC TTC ACC AGCTCT GCC ACG GCT GGA CCG GAG ACG CTC TGC GGG GCT GAGCTG GTG GAT GCT CTT CAG TTC GTG TGT GGA GAC AGG GGCTTT TAT TTC AAC AAG CCC ACA GGG TAT GGC TCC AGC AGTCGG AGG GCG CCT CAG ACA GGC ATC GTG GAT GAG TGC TGCTTC CGG AGC TGT GAT CTA AGG AGG CTG GAG ATG TAT TGCGCA CCC CTC AAG CCT GCC AAG TCA GCT CGC TCT GTC CGTGCC CAG CGC CAC ACC GAC ATG CCC AAG ACC CAG AAG GAAGTA CAT TTG AAG AAC GCA AGT AGA GGG AGT GCA GGA AACAAG AAC TAC AGG ATG TAG GAA GAC CCT CCT GAG GAG TGAAGA GTG ACA TGC CAC CGC AGG ATC C附表2 人类胰岛素生长因子-I的氨基酸序列图Met His Thr Met Ser Ser Ser His Leu Phe Tyr Leu Ala Leu Cys Leu Leu ThrPhe Thr Ser Ser Ala Thr Ala Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu ValAsp Ala Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro ThrGly Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu CysCys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro LeuLys Pro Ala Lys Ser Ala Arg Ser Val Arg Ala Gln Arg His Thr Asp Met ProLys Phr Gln Lys Glu Val His Leu Lys Asn Ala Ser Arg Gly Ser Ala Gly AsnLys Asn Tyr Arg Met
权利要求
1.家蚕生物反应器生产的人类胰岛素生长因子-I口服降血糖的方法，其特征在于将人类胰岛素生长因子基因克隆于杆状病毒转移载体，制备相应的载体DNA，与亲本病毒DNA在昆虫宿主细胞内进行共转染，产生重组病毒，经筛选获得含类胰岛素生长因子基因的高表达重组病毒并感染家蚕进行表达，在家蚕中生产的人类胰岛素生长因子-I经口服给予人类和动物进行降血糖治疗。
2.根据权利要求1所述的家蚕生物反应器生产的人类胰岛素生长因子-I口服降血糖的方法，其特征在于，所述的最优昆虫宿主是家蚕，所述的最优杆状病毒是家蚕杆状病毒BmNPV。
3.根据权利要求1所述的家蚕生物反应器生产的人类胰岛素生长因子-I口服降血糖的方法，其特征在于最优的感染宿主时期是家蚕五龄期幼虫和蛹期，感染方法为经皮肤穿刺接种。
4.根据权利要求1所述的家蚕生物反应器生产的人类胰岛素生长因子-I口服降血糖的方法，其特征在于所述的杆状病毒转移载体是pVL1393和pBm030，所述的含类胰岛素生长因子基因的重组病毒为重组家蚕杆状病毒rBmNPV-(IGF-I)。
5.根据权利要求1所述的家蚕生物反应器生产的人类胰岛素生长因子-I口服降血糖的方法，其特征在于所述的口服治疗的动物为牛、羊、猪、马、鸡等主要的家畜、家禽、鱼类。
6.根据权利要求1所述的家蚕生物反应器生产的人类胰岛素生长因子-I口服降血糖的方法，其特征在于将在家蚕中生产的人类胰岛素生长因子-I经口服给予人类和动物后，可提高其免疫力，对幼年动物肠道发育有促进作用，对动物还具有促生长和促进肌肉生成的作用。
全文摘要
本发明涉及家蚕生物反应器生产的人类胰岛素生长因子－I口服降血糖的方法,其利用重组杆状病毒在昆虫体内特别在家蚕内表达、生产重组人类胰岛素生长因子－I(IGF－I),并用所生产的人类胰岛素生长因子－I通过口服给与途径,被动物所吸收而降低动物体内的血糖水平,达到控制高血糖,治疗人类糖尿病的目的以及提高免疫力,促进肌肉生成和生长发育等作用。
文档编号C12N15/866GK1384201SQ0211276
公开日2002年12月11日 申请日期2002年3月15日 优先权日2002年3月15日
发明者张志芳, 何家禄 申请人:江苏恒顺醋业股份有限公司, 镇江可尔健生物制品有限公司