专利名称：一种乙酸渗漏型丙酮酸高产菌及其选育方法和用该菌发酵法生产丙酮酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种乙酸渗漏型丙酮酸高产菌及其选育方法和用该菌发酵法生产丙酮酸，属于生物工程技术领域。
背景技术：
丙酮酸(Pyruvic acid)是糖代谢中的重要的中间产物。丙酮酸是合成多种氨基酸、维生素及其它有用物质的重要前体，广泛应用于医药、日化、农用化学品、饲料食品等工业。虽然作为一种化工产品，丙酮酸早已实现了工业化生产，但化学法生产的丙酮酸仍沿用酒石酸脱水脱羧法，其主要缺点是丙酮酸产率低、污染严重、且因原料价格昂贵而造成丙酮酸产品价格居高不下，推广应用自然也受到了限制。发酵法生产丙酮酸具有原料成本低、来源广泛、产品纯度高、反应条件温和等许多优点，引起了研究者广泛的兴趣。
《微生物学报》2000，40(5)528～534；《生物工程学报》2000，16(2)225～228；《工业微生物》2001，31(2)10～13；等均有报道，在以前的研究中，本实验室(江南大学教育部工业生物技术重点实验室)经多次改良获得一株光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)WSH-IP303，是硫胺素(B1)、生物素(Bio)、烟酸(NA)和吡哆醇(B6)的营养缺陷型，即需要这些维生素菌体才能维持生长和积累高水平的丙酮酸，能以氯化铵为唯一氮源。还研究了营养条件、维生素、供氧控制模式等对发酵生产丙酮酸的影响以及Torulopsis glabrata WSH-IP303过量合成丙酮酸的代谢特征。在摇瓶实验(48h)和300L发酵罐(68h)中丙酮酸积累水平分别为38.3g/l和55.8g/l，对葡萄糖转化率分别为0.525g/g和0.553g/g，但发酵液中副产物乙醇的含量较高而丙酮酸产率不高，可能是因为控制丙酮酸到乙醛的代谢支路的丙酮酸脱羧酶(PDC)的酶活比较高而使丙酮酸到乙醛的代谢比较活跃，从而导致丙酮酸的降解和副产物乙醇的产生。
发明内容
本发明的目的是提出一种乙酸渗漏型丙酮酸高产菌及其选育方法和用该菌发酵法生产丙酮酸本发明提出一种名称称之为光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)WSH-LQ307，已保藏在武汉中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCC NO.M202019，本菌株是以光滑球拟酵母(Torulops glabrata)WSH-IP303为出发菌株，经亚硝基胍(NTG)诱变处理后再在培养基中添加乙酸作为补充碳源，经培养筛选和复筛而得，对其进行维生素营养缺陷型验证，确证仍为NA、B1、B6和Bio四种维生素的营养缺陷型。是丙酮酸脱羧酶(PDC)酶活降低的乙酸渗漏缺陷型丙酮酸高产突变株。
光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)WSH-LQ307菌株的选育方法，其特征是经亚硝基胍(NTG)诱变处理，培养基中添加乙酸作为补充碳源。
出发菌株光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)WSH-IP303，是烟酸(NA)、硫胺素(B1)、吡哆醇(B6)和生物素(Bio)四种维生素的营养缺陷型。
培养基斜面和种子培养基葡萄糖30g，蛋白胨10g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0.5g，琼脂20g(斜面用)，自来水定容至1L，pH5.5；发酵培养基葡萄糖100g，氯化铵7g，KH2PO45g，MgSO4·7H2O 0.8g，KCl 5g，微量元素液5ml，盐酸硫胺素20μg，生物素10μg，烟酸4mg，盐酸吡哆醇100μg，核黄素50μg，CaCO340g(摇瓶时添加)；乙酸钠添加量为0～10g视实验而定，最佳添加量为6g，自来水定容至1L，pH5.0；基本培养基(MM)葡萄糖10g，NH4Cl 3g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O0.5g，微量元素液5ml，盐酸硫胺素20μg，生物素10μg，烟酸4mg，盐酸吡哆醇100μg，自来水定容至1L，pH5.0；筛选培养基(CM)在MM培养基的基础上添加6g乙酸钠。又称完全培养基。
配制固体平板培养基时添加2％琼脂。
微量元素液CaCl2·2H2O 2g，FeSO4·7H2O 2g，CuSO4·5H2O 0.05g，ZnCl20.5g，MnCl2·4H2O 0.2g，2mol/L的HCl溶解后定容至1L。
突变株的诱变和分离筛选从新鲜斜面上接一环WSH-IP303菌种入种子培养基(50mL/500mL锥形瓶)，在30℃、200r/min下培养12h后，离心收集细胞，用无菌生理盐水和0.1mol/L磷酸钾缓冲液(pH7.0)各洗涤一次后，将打散的细胞悬浮于20ml含有10g/L亚硝基胍(NTG)的0.1mol/L磷酸钾缓冲溶液(pH7.0)中，30℃下振荡处理1h。取10mL处理后的菌悬液用0.16mol/L硫代硫酸钠溶液稀释10倍终止反应，离心收集细胞，用无菌生理盐水洗涤后将其接入种子培养基中作中间培养24h，而后稀释涂布CM平板，30℃下培养48h。挑取CM平板上菌落圈大的菌落，对应点种CM和MM平板。挑取CM平板上生长良好而MM平板上不生长或生长很弱的菌落，接种斜面，30℃培养24h后，每株接一环入发酵培养基，根据丙酮酸产量高低和其丙酮酸脱羧酶活力的高低来确定复筛用菌株。在进行复筛前，对复筛用菌株的维生素营养缺陷型遗传标记进行了确认。复筛时，将每株菌在斜面上连续传代三次，考察每一代的丙酮酸合成能力(每株接3瓶发酵培养基)。根据丙酮酸产量高低、丙酮酸脱羧酶活力大小及产酸稳定性，来筛选确定菌株。
通过重复诱变条件，能得到相同的WSH-LQ307乙酸渗漏型丙酮酸高产菌。用该菌已通过摇瓶水平、5L发酵罐水平和300L发酵罐水平的发酵法生产丙酮酸的试验，具有工业实用性价值。
分析方法将含有4mL发酵液的塑料离心管置于台式高速离心机(TGL-16G)中，于10000r/min下离心5min，取上清液备用。
丙酮酸和葡萄糖浓度分别用乳酸脱氢酶法和3，5-二硝基水杨酸法测定。
丙酮酸脱羧酶(PDC)活性用高效液相色谱测定。
乙醛脱氢酶(ADH)用紫外分光光度计测定。
菌体浓度用OD660测定，1OD660＝0.23g干菌体(摇瓶样品还需加2mL 2mol/L盐酸溶解CaCO3)。
培养基中的乙酸用高效液相色谱法测定。
细胞中蛋白质的测定用改进的Folin-酚法测定。
在摇瓶水平上考察原种与突变株的丙酮酸发酵性能和它们的PDC活性，结果列于表1。从表1中看出，突变株的PDC活性要比出发菌株低，丙酮酸产量要高出许多，PDC活性越低，丙酮酸产量越高，产率也越高。对突变株进行传代实验，发现突变株WSH-LQ307在传代过程中丙酮酸产生能力强且稳定。
表1 原种与突变株发酵丙酮酸的性能比较菌号丙酮酸脱羧酶 丙酮酸产量 糖酸转化率菌体浓度活性 (g/L) (g/g)(g/L)(×10-3μmolpyr/min/mg/protein)出发菌 15.38 38.3 0.46 9.1株LQ3079.12 46.2 0.6510.8
在基本培养基中添加乙酸钠来考察乙酸对出发菌株和突变株生长的影响。从图1A可以看出突变株T.glabrata WSH-LQ307在基本培养基中菌浓要比原种低28％，而从图1B中可以看出，WSH-LQ307在添加了6g/L乙酸钠后的完全培养基中菌浓比原种高出21％，即LQ307在完全培养基中的菌浓要比在基本培养基中的菌浓高出49％。这表明，菌株WSH-LQ307能利用乙酸作为补充碳源来生长，并且生长得要比出发菌株要快。说明乙酸作为它的补充碳源促进了菌体的生长。
考察出发菌株和突变株的PDC、ADH(乙醇脱氢酶)活性与丙酮酸产量的关系。测试结果如表2所示。表明丙酮酸的积累来自于PDC酶活水平的降低，而且PDC活性越低，丙酮酸的积累水平越高。而出发菌株和突变株之间的ADH的酶活水平变化不大，说明ADH并没有影响到丙酮酸的进一步代谢。因此，突变株WSH-LQ307积累丙酮酸水平的提高只能是PDC酶活水平降低的结果，因为PDC酶活的降低，使丙酮酸到乙醛这条代谢支路的通量减少，使丙酮酸得以积累。突变株WSH-LQ307能有效地利用乙酸作为能源，并能比原种更高效地将葡萄糖转化为丙酮酸，从而实现丙酮酸的高产。
表2原种与突变株的PDC、ADH活性比较菌株 PDCADH(μ(μmol/min/mg-protein)mol/min/mg-protein)出发菌株15.38×10-31.41×10-1WSH-LQ3079.12×10-31.34×10-1突变株WSH-LQ307的传代实验对突变株WSH-LQ307进行反复传代，在摇瓶水平上测定其积累丙酮酸的能力和PDC活性，结果发现如图2所示。WSH-LQ307的遗传、发酵性能稳定，是一支较好的丙酮酸产生菌，添加乙酸作为补充碳源积累丙酮酸产量比出发菌株提高了21％。
考察WSH-LQ307发酵生产丙酮酸的特性乙酸钠浓度对WSH-LQ307积累丙酮酸的影响5g乙酸钠中的碳含量相当于5.5g葡萄糖中的碳含量。在基本培养基中添加0～10g乙酸钠时菌株WSH-LQ307积累丙酮酸的能力和产率如图3所示。当添加6g/L乙酸钠时，WSH-LQ307转化葡萄糖为丙酮酸的转化率最高(0.586g/g)，比没有添加乙酸钠时(0.514g/g)高出14％。故在发酵培养基中般添加6g/L的乙酸钠作为补充碳源更佳。
WSH-LQ307菌株5L发酵罐实验图4为LQ307在5L发酵罐中的丙酮酸发酵过程曲线，所用培养基为添加了6g/L乙酸钠的发酵培养基。如图4所示，培养基中乙酸钠的浓度从开始时的6g/L经发酵30h后降为0，说明菌株LQ-307优先利用乙酸钠进行生长，在乙酸钠利用完后再利用葡萄糖来生长，从图中可以看出在乙酸钠完全消耗后，葡萄糖的消耗速率明显加快，葡萄糖除部分用来生长菌体外大部分则是积累丙酮酸。LQ-307在16h后开始积累丙酮酸，20～56h丙酮酸对葡萄糖的转化率基本维持在0.6g/g以上，64h丙酮酸产量(68.7g/L)和丙酮酸对葡萄糖的转化率(0.651g/g)分别比出发菌株高出24％和17％。所以WSH-LQ307是发酵法生产丙酮酸的优良菌株。
本发明优点是从T.glabrata WSH-IP303选育的乙酸渗漏缺陷型菌株T.glabrata WSH-LQ307，表现出积累高水平丙酮酸的能力，这是由于相对于出发菌株来说其PDC酶活被降低了许多，在培养基中添加了乙酸钠，不以葡萄糖为唯一碳源，而是添加乙酸钠作为补充碳源。突变株优先利用乙酸进行生长，并且提高了葡萄糖转化为丙酮酸的转化率。通过重复诱变条件，能得到相同的WSH-LQ307乙酸渗漏型丙酮酸高产菌。用该菌已通过摇瓶水平、5L发酵罐水平和300L发酵罐水平的发酵法生产丙酮酸的试验，具有工业实用性价值。
图1乙酸钠对菌株生长的影响(A为MM培养基，B为CM培养基)。
图2传代次数对LQ307丙酮酸产量及PDC活性的影响。
图3乙酸钠浓度对丙酮酸的积累和产率的影响。
图4LQ-307在5L发酵罐中的丙酮酸发酵过程曲线。
具体实施例方式
实施例1以WSH-LQ307发酵法生产丙酮酸从新鲜斜面上接一环LQ-307菌种入种子培养基(50ml/500ml锥形瓶)，在30℃，200rpm下培养24h后，以10％接种量(v/v)接入发酵培养基。种子培养基和发酵培养基组成如本说明书所述，发酵培养基中添加6g/L乙酸钠。
摇瓶培养500ml锥形瓶内发酵培养基的装液量为50ml，转速200rpm。发酵时间为48h，丙酮酸产量为46.2g/L。
实施例2以WSH-LQ307在5L发酵罐合成丙酮酸斜面种子培养和发酵接种条件均同实施例1，5L发酵罐中发酵培养基(添加6g/L乙酸钠)体积为3L。通气量为3L/min，搅拌转速前16h为700rpm，16h后降止500rpm，用5mol/LKOH或者5mol/L NaOH控制pH在5.0左右，发酵温度为30℃，发酵设备为韩国发酵罐公司生产的型号为KBT-5L的全自动发酵罐。发酵时间为64h。丙酮酸产量为68.7g/L，对葡萄糖的转化率为0.651g/g。
实施例3以WSH-LQ307在300L发酵罐合成丙酮酸斜面种子培养和发酵接种条件均同实施例1，种子培养用30L全自动发酵罐(常州曙光化工厂)为韩国发酵罐公司生产的KF-30L全自动发酵罐。发酵用的反应器为300L上部机械搅拌罐(常州曙光化工厂)，装液量为200L，通气量保持1L/L·min，搅拌转速0～16h为250rpm，16h后为220rpm，用工业碱(质量浓度为300g/L左右)控制pH为5.0，发酵温度为30℃。发酵时间为65h。丙酮酸产量为63.8g/L，对葡萄糖的转化率为0.588g/g。
权利要求
1.一种光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)，其特征是名称称之为光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)WSH-LQ307(现已保藏于武汉中国典型培养物保藏中心，编号CCTCC NO.M202019)，本菌株是以光滑球拟酵母(Torulopsisglabrata)WSH-IP303为出发菌株，经亚硝基胍(NTG)诱变处理、在培养基中添加乙酸作为补充碳源选育得到，本菌株仍然是烟酸(NA)、硫胺素(B1)、吡哆醇(B6)和生物素(Bio)四种维生素的营养缺陷型，是丙酮酸脱羧酶(PDC)酶活降低的乙酸渗漏缺陷型丙酮酸高产突变株。
2.光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)WSH-LQ307的选育方法，其特征是经亚硝基胍(NTG)诱变处理，在培养基中添加乙酸作为补充碳源，A出发菌株出发菌株为光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)WSH-IP303，是烟酸(NA)、硫胺素(B1)、吡哆醇(B6)和生物素(Bio)四种维生素的营养缺陷型，B培养基斜面和种子培养基葡萄糖30g，蛋白胨10g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0.5g，琼脂20g(斜面用)，自来水定容至1L，pH5.5；发酵培养基葡萄糖100g，氯化铵7g，KH2PO45g，MgSO4·7H2O0.8g，KCl 5g，微量元素液5ml，盐酸硫胺素20μg，生物素10μg，烟酸4mg，盐酸吡哆醇100μg，核黄素50μg，碳酸钙40g(摇瓶时添加)，乙酸钠添加量为0～10g，自来水定容至1L，pH5.0；基本培养基(MM)葡萄糖10g，氯化铵3g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0.5g，微量元素液5ml，盐酸硫胺素20μg，生物素10μg，烟酸4mg，盐酸吡哆醇100μg，自来水定容至1L，pH5.0；筛选培养基(CM)在MM培养基的基础上添加6g乙酸钠；配制固体平板培养基时添加2％的琼脂；微量元素液CaCl2·2H2O 2g，FeSO4·7H2O 2g，CuSO4·5H2O 0.05g，ZnCl20.5g，MnCl2·4H2O 0.2g，用2mol/L的HCl溶解后定容至1L；C突变株的诱变和分离筛选从新鲜斜面上接一环WSH-IP303菌种入种子培养基中(50ml/500ml锥形瓶)，在30℃、200rpm的条件下培养12h后，离心收集细胞，用无菌生理盐水和0.1mol/L磷酸钾缓冲液(pH7.0)各洗涤一次，将打散的细胞悬浮于20ml含有10g/L亚硝基胍(NTG)的0.1mol/L的磷酸钾缓冲溶液中，30℃下振荡处理1h，取10ml处理后的菌悬液用0.16mol/L硫代硫酸钠溶液稀释10倍终止反应，离心收集细胞，用无菌生理盐水洗涤后将其接入种子培养基中作中间培养24h，而后经稀释后涂布CM平板，在30℃下培养48h，挑取CM平板上菌落圈大的菌落，对应点种CM和MM平板，挑取CM平板上生长良好而MM平板上不生长或生长得比较微弱的菌落。接种斜面培养基，于30℃培养24h后，每株接一环入发酵培养基，根据丙酮酸产量的高低和其丙酮酸脱羧酶(PDC)活性的高低来确定复筛用的菌株，复筛前，对复筛用菌株的维生素营养缺陷型遗传标记要进行确认。
3.光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)WSH-LQ307的用途，其特征是用WSH-LQ307作为发酵法生产丙酮酸的菌株，在发酵培养基中添加0～10g/L的乙酸钠作为补充碳源。
4.如权利要求3所述的光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)WSH-LQ307的用途，其特征是用作发酵法生产丙酮酸的菌株，在发酵培养基中添加6g/L乙酸钠作为补充碳源更佳。
全文摘要
一种乙酸渗漏型丙酮酸高产菌及其选育方法和用该菌发酵法生产丙酮酸，属于生物工程技术领域。本发明的菌种为一种光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)WSH－LQ307，它由WSH－IP303为出发菌株，经亚硝基胍(NTG)诱变，在培养基中添加以乙酸为补充碳源选育而得到。与出发菌株相比较，其丙酮酸脱羧酶(PDC)活性降低了很多。LQ－307生产丙酮酸的能力强且稳定，以乙酸为补充碳源时，摇瓶培养48小时，丙酮酸产量为46.2g/L，比出发菌株提高了21％。5L发酵罐发酵64小时，丙酮酸的产量达到了68.7g/L，对葡萄糖的转化率为0.651g/g。300L发酵罐发酵65h，丙酮酸产量为63.8g/L，对葡萄糖的转化率为0.588g/g。
文档编号C12N1/16GK1392246SQ0211314
公开日2003年1月22日 申请日期2002年6月8日 优先权日2002年6月8日
发明者陈坚, 刘立明, 李寅, 堵国成, 伦世仪 申请人:江南大学