在含乙酸的环境中快速利用五碳糖的混菌体系的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及发酵技术领域，具体设及在抑制剂存在下五碳糖、六碳糖共发酵的混 菌体系，尤其是在含乙酸的环境中快速利用木糖的混菌体系。
【背景技术】
[0002] 由于化石资源的过度使用产生了严重的环境问题和社会问题，迫切需要开发清 洁、环保的可再生能源，逐步替代传统的化石资源，W保证现代社会的可持续发展。纤维素 乙醇是一种具备W上特性的新能源，成为最有发展潜力的能源替代品之一。纤维素乙醇的 生产工艺是先将纤维素原料转化为可发酵的糖类，再通过酵母发酵将糖类转化为乙醇的过 程。由于木质纤维素的致密结构具有顽抗性，必须对纤维素原料进行预处理来提高水解过 程的效率。然而，多数高效的预处理会有一些副产物的产生，如乙酸。乙酸对后续的微生物 发酵过程有非常严重的抑制作用。增强酵母对乙酸耐受性是突破限制因素的有效途径，可 W增强酵母在运些抑制剂存在下的乙醇生产能力。
[0003] 目前，主要是通过基因工程和进化工程等手段提高酵母的耐受性。进化工程是利 用细胞自身的进化适应能力获得目标性状。近几年，基于已报道的细胞对单一抑制剂的耐 受机制，利用基因工程策略获得了一些对单一抑制剂耐受能力增强的酵母菌株。
[0004] 木糖是木质纤维素水解液中含量第二高的单糖。在W木质纤维素水解液为原料的 纤维素乙醇生产中，高效、充分的利用木糖是发酵菌株的必备特性。在酿酒工业中广泛使用 的菌株酿酒酵母因其较高的木质纤维素水解液抑制剂耐受性、乙醇耐受性成为纤维素乙醇 生产中的首选微生物，但是天然酿酒酵母不能代谢木糖。因此，通过工程化改造酿酒酵母， 获得能够高效代谢木糖的酵母菌株是纤维素乙醇生产中的一个关键问题。通过将能天然代 谢木糖的微生物中的木糖还原酶途径或木糖异构酶途径引入到酿酒酵母中，目前已经构建 了很多能较好发酵木糖产乙醇的菌株，但是木糖的发酵效率还有待提高。
[0005] 目前，基于基因工程、进化工程或者诱变等技术，可W获得一株对乙酸有耐受性的 酿酒酵母或者一株可W较快的代谢木糖的菌株，但是很难得到一株既可W较快代谢木糖又 耐受乙酸的酿酒酵母。在同一株菌内实现耐受性和木糖代谢能力的提高，对于菌株代谢负 担过重。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明目的是针对现有技术的缺陷，提供一种在含乙酸的环境中快速 利用木糖的混菌体系，W解决酵母在乙酸抑制的情况下的木糖快速利用的问题，实现酵母 在抑制剂存在条件下五碳糖、六碳糖的共发酵。
[0007] 为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
[000引一种混菌体系，包括酵母菌株SyBEOOe和酵母菌株SyBE0036。
[0009]本发明所述混菌体系由乙酸耐受菌Sy邸0036和另一株木糖利用菌Sy肥006组成， 将混菌发酵引入纤维素水解液发酵中，将耐受性和木糖利用的功能分配到不同的菌株，减 轻了每株菌株的代谢负担，实现了相互合作，功能互补。在解决纤维素预处理水解液中副产 物乙酸对酵母发酵的抑制的同时通过木糖利用菌实现五六碳糖的共利用。
[0010] 在一个具体实施方案中，本发明采用酵母菌株SyBEOOe、酵母菌株SyBE0036按不同 比例混合培养在乙酸抑制的情况下发酵，结果显示虽然Sy肥0036单独培养也可快速消耗葡 萄糖和快速生长，但是不能代谢木糖，不可实现五六碳糖的共利用。而酵母菌株SyBEOOe与 酵母菌株SyBE0036混菌培养明显加快了发酵进程，提前利用木糖，都在30-40小时左右进入 稳定期，消耗尽全部葡萄糖，与单独培养的Sy肥0036利用情况接近。混合培养的菌株，消耗 尽葡萄糖后，30-40小时左右开始立即代谢木糖。而单独培养的Sy肥006需要将近100小时才 可W进入稳定期，消耗尽葡萄糖，开始利用木糖。表明酵母菌株Sy肥0036的添加可W明显加 快发酵进程，缩短发酵时间，完成乙酸抑制下的混糖发酵。而混菌培养的比例不是固定的， 混合比例范围非常宽泛的。即使添加极少量的SyBE0036都可W明显加快发酵进程，缩短发 酵时间。
[0011] 作为优选，所述菌株Sy邸006与菌株Sy邸0036的浓度比为1:49~49:1。
[0012] 更优选的，所述菌株Sy邸006与菌株Sy邸0036的浓度比为1: 1。
[0013] 本发明还提供了所述混菌体系在抑制剂存在下五碳糖、六碳糖共发酵中的应用发 酵木质纤维素水解液中的应用。
[0014] 其中，作为优选的，所述抑制剂为乙酸。
[0015] 作为优选的，所述五碳糖为木糖，所述六碳糖为葡萄糖。
[0016] 本发明还提供了一种在抑制剂存在下五碳糖、六碳糖共发酵的发酵方法，接种上 述混菌体系于含抑制剂的五碳糖与六碳糖混合液中发酵。即接种包括酵母菌株SyBEOOe和 酵母菌株SyBE0036的混菌体系。
[0017] 其中，所述抑制剂为乙酸。所述乙酸的浓度优选为3.5g/L-5.0g/L。所述抑制剂为 乙酸，乙酸的浓度为3.5g/L-5. Og/L
[0018] 本发明所述的发酵方法中所述五碳糖为木糖，所述六碳糖为葡萄糖。
[0019] 在一些实施方案中，所述混菌体系中所述菌株Sy邸006与菌株Sy肥0036的浓度比 为1:49~49:1。
[0020] 在一些优选实施方案中，所述混菌体系中所述菌株Sy邸006与菌株Sy肥0036的浓 度比为1:1。
[0021] 本发明所述在抑制剂存在下五碳糖、六碳糖共发酵的发酵方法中所述混菌体系的 接种浓度为初始菌体浓度0D600 = 0.1~1.0。
[0022] 本发明所述发酵方法中所述发酵为30°C、150rpm条件下培养。
[0023] 由上述技术方案可知，本发明提供了一种混菌体系包括酵母菌株SyBEOOe和酵母 菌株SyBE0036。酵母菌株SyBEOOe和酵母菌株SyBE0036混合发酵在解决纤维素预处理水解 液中副产物乙酸对酵母发酵的抑制的同时通过木糖利用菌实现五六碳糖的共利用。本发明 通过混菌发酵成功解决了纤维素乙醇生产过程中存在条件下的木糖利用的问题，实现在酵 母抑制剂存在条件下五六碳糖共发酵。此外，通过酵母菌株SyBEOOe和酵母菌株Sy肥0036混 菌发酵，加速了发酵进程，缩短发酵周期，提高效率，降低成本。
【附图说明】
[0024] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0025] 图1示实施例葡萄糖为单一碳源下乙酸对菌株SyBE0036的抑制作用图，其中， 图a为葡萄糖浓度曲线、图b为乙醇浓度曲线、图C为乙酸浓度曲线、图d为菌体生长曲线；
[0026] 图2示实施例2葡萄糖为单一碳源下乙酸对菌株SyBEOOe的抑制作用图，其中，图a 为葡萄糖浓度曲线、图b为乙醇浓度曲线、图C为乙酸浓度曲线、图d为菌体生长曲线；
[0027] 图3示实施例2木糖为单一碳源下乙酸对菌株SyBEOOe的抑制作用图，其中，图a为 木糖浓度曲线、图b为乙醇浓度曲线、图C为乙酸浓度曲线、图d为木糖醇浓度曲线、图e为菌 体生长曲线；
[002引图4示实施例35.Og/L乙酸浓度抑制下等比例混菌利用葡萄糖、木糖结果图，其中， 图a为葡萄糖浓度曲线、图b为木糖浓度曲线、图C为乙醇浓度曲线、图d为菌株SyBEOOe菌体 生长曲线；为菌株SyBEOOe与菌株SyBE0036比例为0:1、:秦为菌株SyBEOOe与菌株 SyBE0036比例为0.02:0.98、雌为菌株SyBEOOe与菌株SyBE0036比例为0.5:0.5、为菌株 SyBEOOe与菌株Sy邸0036比例为0.98:0.02、-为菌株Sy邸006与菌株Sy邸0036比例为1:0;
[0029] 图5示实施例4乙酸抑制下不同比例混菌利用葡萄糖、木糖结果图，其中，图a为葡 萄糖浓度曲线、图b为木糖浓度曲线、图C为乙醇浓度曲线；
[0030] 图6示实施例5 3.75g/L乙酸浓度抑制下等比例混菌利用葡萄糖、木糖结果图，其 中，图a为葡萄糖浓度曲线、图b为木糖浓度曲线、图C为乙酸浓度曲线、图d为乙醇浓度曲线。
【具体实施方式】
[0031] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。
[0032] 为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。其中所述 酵母菌株Sy肥006的构建方法参见《模块化构建高效利用木糖的酿酒酵母的研究》（查健， [D]，天津大学，2013年）；所述酵母菌株SyBE0036的构建方法参见《酿酒酵母耐受抑制剂的 性能强化》(王昕，[D]，天津大学，2015年）。
[0033] 实施例1:菌株SyBE0036在乙酸抑制下W葡萄糖为单一碳源的发酵
[0034] 1、实验材料:菌株SyBE0036
[0035] 2、试验方法：
[0036] Sc-Ura培养基：葡萄糖20g/L，酵母氮源6.7g/L，氨基酸粉末2g/L，不添加尿喀晚， 115 °C灭菌15min。对照组不添加乙酸，实验组添加1.25g/L乙酸。
[0037] 挑取Sy肥0036单菌落，接种于装有5mLSC-化a培养基的试管中，在30°C、200巧m条 件下培养24h，取0.5mL接种于装有lOOmLSC-化a培养基的250血锥形瓶中，在30°C、200rpm条 件下培养2地。然后，W初始菌体浓度0D6日日= 0.1接种于装有lOOmLSC-Ura培养基的250mL锥 形瓶中，于30°C、150rpm条件下培养，使用722型分光光度计测定菌体生长曲线。葡萄糖浓 度、乙醇浓度、乙酸浓度用高效液相色谱(Watersl515)测定，色谱柱为Aminex HPX-87H，柱 溫:65°C，检测器:Waters示差检测器2421，流动相为5mM硫酸溶液，流速0.6mL/min，进样量 为lOyL。每组实验重复3次。结果见图1。
[0038] 3、实验结果：
[0039] 如图1所示，菌株SyBE0036在W葡萄糖为单一碳源情况下，添加乙酸的实验组与未 添加乙酸的对照组的生长速率，葡萄糖消耗速率和乙醇生产速率保持一致，曲线完全重合。 由此可知，在W葡萄糖为单一碳源情况下，乙酸对Sy邸0036基本没有抑制作用，Sy肥0036表 现出对乙酸较好的耐受性。
[0040] 实施例2:菌株SyBEOOe在乙酸抑制下分别W葡萄糖和木糖为单一碳源发酵
[0041 ] 1、实验材料:菌株SyBEOOe
[0042] 2、实验方法：
[0043] Yra培养基:木糖20g/L，酵母浸粉lOg/L，蛋白腺20g/L，121°C灭菌20min。木糖单独 115°C灭菌 15min。
[0044] SC培养基：葡萄糖20g/L，酵母氮源6.7g/L，氨基酸粉末2g/L，115°C灭菌15min。对 照组不添加乙酸，实验组添加1.25g/L乙酸。
[0045] SX培养基:木糖20g/L，酵母氮源6.7g/L，氨基酸粉末2g/L，115°C灭菌15min。木糖 单独115°C灭菌15min。对照组不添加乙酸，实验组添加1.25g/L乙酸。
[0046] 挑取Sy邸006单菌落，接种于装有5血YPX培养基的试管中，在30°C、200rpm条件下 培养2地，取0.5mL接种于装有lOOmLYPX培养基的250mL锥形瓶中，在30°C、200巧m条件下培