抗生素化合物的制作方法

专利名称：抗生素化合物的制作方法
背景技术：
本发明涉及一种具有抗菌活性的新天然产物。
由于许多细菌对各种常见抗生素产生抗药性，因此对这类病原体所引起的感染的关注不断增加。所述细菌包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌、酿脓链球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌、乙酸钙不动杆菌、大肠杆菌和嗜麦芽寡养单胞菌。本发明的抗生素是对治疗那些对各种已知抗生素产生了抗药性的感染的一项重要贡献。综述参见F.D.LowyThe Journal of Clinical Investigation 2003，111(9)，1265。
本发明中公开了一类从链球菌的真细菌发酵产物中分离出来地新型天然产物。此类化合物对多种病菌显示出抗菌活性，其中许多病菌对现用的抗生素显示抗药性。
发明概述
本发明公开了式I所示的新天然产物和其作为抗菌剂的应用:
或一种其药学上可接受的盐，该盐可有效地治疗细菌感染。
本发明也涉及通过发酵链球菌属的真细菌制备化合物I的方法。本发明也涉及从发酵液培基中分离式I化合物的方法。
附图的简要说明


图1是化合物I在C5D5N中的13CNMR光谱。
图2是化合物I在C5D5N中的1HCNMR光谱。
发明详述
本发明公开了如结构式I的化合物
或一种其药学上可接受的盐。
本发明化合物的药学上可接受的盐包括由非毒性的无机碱或有机碱生成的平常的非毒性盐。例如，所述的平常的非毒性盐包括那些来源于无机碱的盐(无机碱指碱金属或碱土金属如钾、钠、锂、钙或镁之类的氢氧化物)以及由有机碱制备的盐，有机碱指二苄乙烯-二胺、三甲胺、哌啶、吡咯烷、苄胺等胺类，或季铵的氢氧化物如氢氧化四甲铵之类。
这些药学上可接受的盐可从本发明化合物通过常规化学方法合成。这些盐通常可用与化学计算量的游离酸反应制备，或用过量的所需盐形式的无机碱或有机碱在适当的溶剂或者各种组合溶剂中制备。
本发明的化合物I显示的抗生素活性在治疗细菌感染中是有用的。它对金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、枯草杆菌、大肠杆菌等各种菌株具有抗菌活性，包括对许多已知的抗生素有抗药性的菌株，如抗甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)，抗万古霉素的肠球菌(VRE)、抗多种药物的粪肠球菌、抗大环内酯类药物的金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌，以及抗利耐唑酮类药物的金黄色葡萄球菌和粪肠球菌。
本发明的化合物可通过将化合物I与一种药学上可接受的载体混合而配制成药物成分。上述载体可说明如下。
化合物可以粉末、晶体、溶液或悬液形式使用。可通过各种方式给药；主要包括局部给药、口服和通过注射(静脉内或肌内注射)的非肠道途径给药。
做为一种给药途径的注射用组分可制成单一剂量的安瓿，或制成多次剂量的瓶装药。注射用组分可制成悬浮液、溶液、油乳剂或水乳剂，可以包含各种配制药剂。或者，活性成分可以是粉末(亲水性的或非亲水性的)形式，能够在给药时与一种适当的载体重新配制，典型的载体包括无菌水、盐水或其它可用于注射的液体，如用于肌肉注射的花生油。同样，也包括各种缓冲剂、防腐剂等。
局部给药可用载体配制，如用疏水碱或亲水碱制成的药膏、软膏、药水，或用水、油或酒精配成的涂剂，或用干燥稀释剂制成的粉末。
口服组分可以采取下述形式，如片剂、胶囊、口服悬浮液和口服溶液。口服组分的可用载体，如常规配伍剂载体，也包括有缓释性能的和速释形式的载体。
给药剂量在很大程度上依赖于治疗对象的状态和规模、给药途径和给药次数、细菌对化合物的敏感度、病原体的毒力大小及其他因素。然而，这些问题可以由医师依据医务界众所周知的治疗原则，按常规甄酌处理即可。
用于人体的每单位剂量组分，无论液体或固体，可包含从约0.01％到高达约99％的化合物I，一种实际的范围为约10-60％。组分通常包含从约15毫克到约2.5克的化合物I，一种实际的范围约为250毫克到1000毫克。非肠胃给药时，典型的单位剂量包括在无菌水中的纯化合物I或可配制成溶液的可溶性粉剂形式，其可调节成中性的pH和等渗溶液。
本发明同样包括一种在需要时治疗哺乳动物细菌感染的方法，该方法包括给动物投以有效量的化合物I以治疗感染。
用化合物I给药方法的实例包括口服和非肠道途径给药，如静脉点滴，静脉灌注和肌肉注射。
对于成人，最好按每公斤体重约5-50毫克的化合物I，每日一到四次给药。优选剂量是250毫克到1000毫克的抗菌药，每天给药一到四次。更具体地说，对于轻度感染，推荐剂量为约250毫克，每日二或三次给药。对于中度感染，抗高敏感性革兰氏阳性菌的推荐剂量为约500毫克，每日三或四次给药。对于危及生命的重度感染，以对该抗菌素的敏感性为上限，推荐剂量为约1000-2000毫克，每日三到四次给药。
对于儿童，优选以约5-25毫克/公斤体重的剂量给药，每天2、3或4次；一般推荐10毫克/公斤剂量。
本发明的另一个方面是生产化合物I的流程，包括在适宜的营养培基中培养一种链球菌属的细菌，然后从该发酵液体培基中分离出本发明的化合物。此处所说的包括两种细ATCC#PTA-5316(MA7327)和ATCC#PTA-5317(MA7331)依分类学研究将其鉴定为链球菌属的真细菌，存放在Merck菌种库中。
这两种细菌随后被永久保存在美国模式种菌种库中(ATCC)，(12301Parklawn Drive，Rockville，马里兰，20852)，登录号为ATCC#PTA-5316(Merck#MA7327)和ATCC#PTA-5317(Merck#MA7331)。
随着专利的公布，任何限制公众接触这些微生物的规定都该完全取消。虽然本发明公开了这些特定菌种的应用，但用其它种和变种的细菌也可能生产化合物I，可以期待用这些细菌来进行本发明的工艺流程。
结构式I的化合物是在控制条件下，通过将链球菌属的真细菌接种到一种适当的培基上进行需氧发酵产生的。优选含有可吸收的碳、氮和无机盐等营养成分的液态培基。
用于发酵链球菌属细菌的培基主要是众所周知的Difco胰蛋白酶大豆肉汤培基，可以单用这种培基，也可让技术人员在其中添加通常所用的营养成分。
应当注意，可用的培基范围很广，此处所说的培基仅是说明性的，并不意味着以任何方式对本发明范围的限制。
发酵在从约10℃到40℃的温度下进行；优选28℃下发酵可得到最佳效果。在发酵期间，该营养培基的pH值可以是约5.5到约7.5。
应当理解，对于本发明化合物的发酵制备，本发明不局限于使用ATCC登录号为ATCC#PTA-5316(Merck#MA7327)和ATCC#PTA-5317(Merck#MA7331)的特定的链球菌属细菌。在本发明范围内特别需要和想要包括使用由所述培养物产生或衍生出的其他的天然或人工突变株，或链球菌属中可产生本发明化合物的其它种或变种的细菌。登记号为ATCC#PTA-5316(Merck#MA7327)和ATCC#PTA-5317(Merck#MA7331)的链球菌突变种或突变株的人工制备可通过常规的、物理的或化学诱变剂来进行，例如用紫外线照射所述的培养物或用亚硝基胍处理等。重组DNA技术，如细胞融合、质粒结合、染色体片段联接等，也证明是有用的。
实施例1
化合物I的制备-对ATC#PTA-5316(MA7327)和ATCC#PTA-5317(MA7331)使用相同的方法
培养基组分
接种培基 g/L
可溶性淀粉 20.0
葡萄糖 10.0
E型NZ胺 5.0
牛肉提取物 3.0
酵母提取物 5.0
蛋白胨 5.0
(pH调节至7.0)
碳酸钙 1.0
CLA(玉米粉乳糖ardamine)(生产培基，每L)
Amberx pH 5.0克
黄玉米粉40.0克
乳糖40.0克
P-2000(消泡剂) 1.0毫升
将2.0mLATCC#PTA-5316(MA7327)链球菌的冷冻悬液接种到含50ml接种培基的250ml导流烧瓶中。烧瓶在28.0℃下以每分钟220转的搅速培养48小时。第二阶段，将10mL的第一阶段的培养物接种到装有500毫升接种培基的非导流摇瓶中。烧瓶在28.0℃下以每分钟180转的搅速培养48小时。将1.5升第二阶段的培养物接种到装有50升CLA生产培基的75升大小的Chemap发酵器中。该发酵器的工作参数是温度＝28.0℃，搅速＝300r/min，气流＝30slpm，压力＝5psig。经9天培养从发酵器中可获得43升液体培养物。
化合物I的分离43升发酵液体培养物加入29升甲醇并且酸化到pH3.0，最终容积为72升。过滤提取，滤液直接装入1.5升的琥珀色色谱柱，并用40-100％的含水甲醇洗脱，以每600毫升为单位梯度收集。合并主要含化合物I的11-13部分，并浓缩至200毫升，其中大部分是水，用300毫升水稀释至最终容积500ml。加入固体碳酸氢钠，以提高pH值至9.0。该溶液用等体积二氯甲烷提取三次。水层用6N HCl(盐酸)酸化至pH 2.0，用等体积二氯甲烷提取四次，合并后的提取液(1900cc)浓缩成2.6克半纯化的化合物I。
将半纯化的原料溶于少量乙酸乙酯，以80∶20的比例装入500cc硅胶柱；己烷-乙酸乙酯。该柱以四倍柱体积的己烷-乙酸乙酯(8∶2)洗脱，继之以四倍柱体积的80∶20∶0.5∶0.5∶0.5的乙酸乙酯∶己烷水冰醋酸∶甲醇洗脱，每200毫升为单位收集一次。将6-10部分合并，减压浓缩，得到1.24g的化合物I。
大量分离化合物I的方法用4N HCl酸化5升发酵液体培基，再用2.5升乙酸异丙酯提取，乙酸异丙酯是以300毫升的5％碳酸氢钠水溶液提取的。将碳酸氢钠层装入150毫升的琥珀色色谱柱，以水洗脱至洗脱液pH为中性。该柱以一倍柱体积的0.1N HCl洗脱，再用水洗脱至洗脱液的pH变成中性。该柱再以两倍柱体积的20％，40％，60％，80％，90％和100％的甲醇溶液洗脱。化合物I在90％和100％甲醇溶液部分中被洗脱下来。合并的部分减压浓缩至主要是水，以等量的二氯甲烷(乙酸异丙酯和乙酸乙酯同样有效)提取。有机层浓缩至干，生成193毫克无定形粉末状的化合物I，该化合物可从热的硝基甲烷、乙酸异丙酯、乙酸乙酯或乙腈-水中结晶。
化合物I的物理学数据从硝基甲烷中结晶，呈米色针状体，熔点220-223℃(分解温度230℃)，UV(CH3OH)λmax227(ε28，167)，296(4，825)nm，[α]23D-51.1°(c0.135，CH3OH)，
FTIR(ZnSe)3400，2964，1713(W)，1650，(br，强)，1535，1446，1378，1296，1240，1153，1105，1091，1024，953，828，791，608厘米4，
HEESIFTMSFound442.1853；calcd for C24H27NO7+H442.1866，
1HNMR(500MHz)C5D5NδH1.14(3H，s)，1.40(3H，s)，1.48(3H，d，J＝11Hz)，1.57(1H，dd，J＝11.5，6.511z)，1.73(1H，dd，J＝10.5，3Hz)，1.81(2H，brd，J＝11.5Hz)，1.90(1H，m)，2.0(1H，m)，2.20(1H，t，J＝6.5-Hz)，2.45(1H，brs)，2.68(1H，m)，2.75(1H，ddd，J＝14.5，11.5，5)，2.83(1H，ddd，J＝14.5，11.5，5.5Hz)，4.49(1H，t，J＝3.5Hz)，5.94(1H，d，J＝10Hz)，6.37(1H，d，J＝10Hz)，6.87(1H，d，J＝9Hz)，8.12(1H，d，J＝9Hz)，10.5(1H，s)；
13CNMR(125MHz)C5D5NδC23.9，25.1，32.4，32.8，41.4，43.7，45.7，46.8，47.2，47.4，55.6，77.1，87.5，107.8，110.5，115.9，127.9，130.1，154.6，158.5，159.1，175.0，175.2，203.8
培养物特性
依据Shirling和Gottlieb(Int.J.Syst.Bacteriol，(1996)16313-340)的方法，对培养物的生长、一般培养特点和碳的利用情况进行观察。培养物的染色用Mtehud色彩手册(A.Kornerup和J.H.Wauscher，第三版，1978)中的颜色标准对照确定。
细胞的化学组分用Lechebalier和Lechebalier(1980)方法测定。
脂肪酸成分用修改的样例制备法(Sasser，1990)测定。
甲基脂肪酸酯(FAMEs)的分析，通过使用Hewlett Packard Model 6890N气相色谱/微生物鉴定系统软件(MIDI，Inc.，Newar，Del)的毛细管气相色谱进行，用苯基甲基硅酮柱(0.2毫米x 25米)装柱。单体脂肪酸的鉴定通过微生物识别系统软件确定。
用27f和1525r引物(Lane，1991)扩增，从1500bp PCR扩增片段测定完整的16S rDNA序列。PCR产物作模板，用ABT PRISMTM染料终止剂循环测序试剂盒(Perkin Elmer)测序。部分序列用GCG片段拼接系统(WisconsinPackage，第8版)拼接，序列以CLUSTALW程序(Intelligenetics公司)排序。用4.0版简化程序的系统分析(PAUP)拆分-归纳算法(Swofford，1993)，以最大化-简化分析法对排序的序列进行系统分析。
来源
菌株ATCC#PTA-5316(MA7327)株采自南非东海角的土壤中。在海岸地带的硬叶灌木丛和沙丘地带，采集粘连在倒杯长腋草(Manulea obovbata)根源上的土壤。土样连续稀释后分离菌株，置于含有20微克/毫升的茶啶酮酸的淀粉酪蛋白琼脂上。
菌株ATCC#PTA-5317(MA7331)从采自西班牙巴利阿里群岛的马略卡岛的土壤中分离得到。将土壤用0.01％氯化苄乙胺预处理后分离菌株，置于添加了20微克/毫升新生霉素的腐殖酸琼脂上。
一般生长特征。
菌株ATCC PTA-5316(MA7327)在28℃下在诸如酵母麦芽提取物、燕麦片、甘油天冬素、无机盐淀粉和胰蛋白酶大豆琼脂等琼脂培基上生长良好。其菌落形态肉眼观察为典型链霉菌，表1记录了它们在不同的琼脂培基上的生长特征，包括孢子团的颜色，底物中菌丝体的着色，以及产生的不同色素。
菌落形态学(在酵母麦芽提取物琼脂上，ISP2)培育21天后，底物中菌丝体由最初的黄白色变为桔黄色(5C6)。最初的白色气生菌丝体在培育21天中逐渐变成黄灰色，最终变成灰色(5D2)，带褐色微滴渗出物。
微观形态用放大400倍和1000倍的光学显微镜直接观察放在玻片上的孢子链形态。在酵母麦芽提取物琼脂上培养7、14和21天后观测。从底物中大量的分支菌丝生出气生菌丝体。稀疏的分支气生菌丝最初分化为短而不规则的致密的螺旋状孢子链。在陈旧的培养物中，随着时间的推移，暗色的粘稠孢子团渐趋联合，由10-20个孢子形成了子实体。在大多数其它试验培基中也观察到类似的形态学变化，但孢子联合的程度不同。相反，在甘油天冬素琼脂培基中，菌株生长成不育的营养型菌丝体。
菌株ATCC#PTA-5317(MA7327)在试验的琼脂培基上于28℃下生长良好，琼脂培基包括酵母麦芽提取物、燕麦片、甘油天冬素、无机盐淀粉和胰蛋白酶大豆琼脂等琼脂培基。其菌落形态肉眼观察为典型链霉菌，其在不同琼脂培基上的生长特征如表1所示。
菌落形态(在酵母麦芽提取物琼脂上，ISP2)培养21天后，底物中的菌丝体由最初发的黄白色变化为棕黄色(SE7)。最初的黄白色气生菌丝体逐渐变成均匀灰色(5E1)。
微观形态用放大400倍和1000倍的光学显微镜直接检验放在玻片上的孢子链形态。在酵母麦芽提取物琼脂上培养7、14和21天后观测。从底物中大量的分支菌丝中生出气生菌丝体。在气生菌丝顶尖部或二次分枝菌丝中生出子实体。它们形成圆环状短而致密的不规则孢子链，此后经较长时间的培养联合起来。在其他试验培基中可观察到不同结合程度的类似形态学变化，但在甘油天冬素琼脂中菌株生长为不育的营养型菌丝体。
化学分类学分析。
对细胞壁组分的分析表明，在全-有机水解物中，菌株ATCC#PTA-5316(MA7327)和ATCC#PTA-5317(MA7331)的全部有机水解物中含有LL-A2pm，这是链霉菌属的特征。菌株ATCC#PTA-5316(MA7327)的主要细胞壁糖为葡萄糖，而葡萄糖和半乳糖是菌株ATCC#PTA-5317(MA7331)的特征糖。两个菌株都富含饱和的直链的、异和反异脂肪酸，但存在完全不同的脂肪酸模式。表2中列出了全部脂肪酸组分。菌体的全部甲醇分解物中主要的脂肪酸相当于15:0的反异脂肪酸和16:0的异脂肪酸，这也是典型的链霉菌属特征。所有这些化学分类分析表明，这两个菌株都属于链霉菌属的种。
生理特性。
这些菌株在碳的利用方式上存在着微小不同(表3)
ATCC#PTA-5316(MA7327)可很好利用D-葡萄糖、蔗糖、I-肌醇、D-甘露糖醇、D-果糖和棉子糖；中度利用D-木糖；利用L-阿拉伯糖和纤维素的能力较差，不能利用鼠李糖。
ATCC#PTA-5317(MA7331)可很好地利用蔗糖、D-木糖、I-肌醇、D-果糖和棉子糖；中度利用D-葡萄糖和D-甘露糖醇；利用L-阿拉伯糖的能力较差，不能利用纤维素和鼠李糖。
16S rDNA序列和系统分析。
测定了两个菌株的16S rDNA全序列(图2)。与基因库(AB045882)的链霉菌属核苷酸序列核对，两个菌株的分类学位置经与126种确认的链菌属细菌的16SrDNA序列比对用系统分析法确定。以这些16S rDNA序列为基础，用最大简化法建立属于同一支序系统树。用每次分组的交叉反馈法确定统计学上的可信限。一次分组的交叉反馈值达到95％则认为有统计学意义。
菌株ATCC#PTA-5316(MA7327)和ATCC#PTA-5317(MA7331)似与扁平链霉菌ATCC 13865属于同一支序。交叉反馈值(92％)高度支持这一密切关系，表明两者可通过扁平链霉菌的不同菌株来鉴定。
表1.
链霉菌ATCC#PTA-5316(MA7327)和ATCC#PTA-5317(MA733(21天，28℃)的培养特征
ATCC#PTA-5316(MA7327)菌株
ATCC#PTA-5317(MA7331)菌株
表2存在于菌株ATCC#PTA-5316(MA7327)和ATCC#PTA-5317(MA7331)中的主要脂肪酸
表3.菌株ATCC#PTA-5316(MA7327)和ATCC#PTA-5317(MA7331)利用碳水化合物的方式
用表中所列化合物作为碳源监控培养物的生长28℃下，在7、14和21天进行观察，利用各种碳源的情况列表如下。增长水平3＝利用良好；2＝中度利用；1＝利用较差；0＝不能利用。
图2.菌株ATCC#PTA-5316(MA7327)和ATCC#PTA-5317(MA7331)及数据库中的16S rDNA序列
菌株ATCC#PTA-5316(MA7327)16S rDNA区域(从1到1449)-SEQ.ID.-No.1
1 CCGTCAGGAC GGACGCTGGC GGCGTGCTTA ACACATGCAA GTTCCAACGA
51TGAACCTCCT TCGGGAGGGG AATTAGTGGC GAACGGGTGA GTAACACGTG
101 GGCAATCTGC CCTTCACTCT GGGACAAGCC CTGGAAACGG GGTCTAATAC
151 CGGATACGAC CACCGACCGC ATGGTCGTGG TGGTGGAAAG CTCCGGCGGT
201 GAAGGATGAG CCCGCGGCCT ATCAGCTTGT TGGTGGGGTG ATGGCCTACC
251 AAGGCGACGA CGGGTAGCCG GCCTGAGAGG GCGACCGGCC ACACTGGGAC
301 TGAGACACGG CCCAGACTCC TACGGGAGGC AGCAGTGGGG AATATTGCAC
351 AATGGGCGAA AGCCTGATGC AGCGACGCCG CGTGAGGGAT GACGGCCTTC
401 GGGTTGTAAA CCTCTTTCAG CAGGGAAGAA GCGAGAGTGA CGGTACCTGC
451 AGAAGAAGCG CCGGCTAACT ACGTGCCAGC AGCCGCGGTA ATACGTAGGG
501 CGCAAGCGTT GTCCGGAATT ATTGGGCGTA AAGAGCTCGT AGGCGGCTTG
551 TCACGTCGGA TGTGAAAGCC CGGGGCTTAA CCCCGGGTCT GCATTCGATA
601 CGGGCAGGCT AGAGTTCGGT AGGGGAGATC GGAATTCCTG GTGTAGCGGT
651 GAAATGCGCA GATATCAGGA GGAACACCGG TGGCGAAGGC GGATCTCTGG
701 GCCGATACTG ACGCTGAGGA GCGAAAGCGT GGGGAGCGAA CAGGATTAGA
751 TACCCTGGTA GTCCACGCCG TAAACGTTGG GAACTAGGTG TGGGCGACAT
801 TCCACGTCGT CCGTGCCGCA GCTAACGCAT TAAGTTCCCC GCCTGGGGAG
851 TACGGCCGCA AGGcTAAAAC TCAAAGGAAT TGACGGGGGC CCGCACAAGC
901 AGCGGAGCAT GTGGCTTAAT TCGACGCAAC GCGAAGAACC TTACCAAGGC
951 TTGACATACA CCGGAAACGT CTGGAGACAG GCGCCCCCTT GTGGTCGGTG
1001 TACAGGTGGT GCATGGCTGT CGTCAGCTCG TGTCGTGAGA TGTTGGGTTA
1051 AGTCCCGCAA CGAGCGCAAC CCTTGTTCTG TGTTGCCAGC ATGCCCTTCG
1101 GGGTGATGGG GACTCACAGG AGACTGCCGG GGTCAACTCG GAGGAAGGTG
1151 GGGACGACGT CAAGTCATCA TGCCCCTTAT GTCTTGGGCT GCACACGTGC
1201 TACAATGGCC GGTACAATGA GCTGCGATAC CGCGAGGTGG AGCGAATCTC
1251 AAAAAGCCGG TCTCAGTTCG GATTGGGGTC TGCAACTCGA CCCCATGAAG
1301 TCGGAGTTGC TAGTAATCGC AGATCAGCAT TGCTGCGGTG AATACGTTCC
1351 CGGGCCTTGT ACACACCGCC CGTCACGTCA CGAAAGTCGG TAACACCCGA
1401 AGCCGGTGGC CACAACGCCC TCTGTGCGAG GCAATCTGTC CGAAGGTCG
菌株ATCC#PTA-5317(MA7331)16S rDNA区域(从1到1496)-SEQ.ID.No.2
1 TCCTGGCTCA GGACGAACGC TGGCGGCGTG CTTAAACACA TGCAAGTCGA
51ACGATGAACC TCCTTCGGGA GGGGATTACT GGCGAACGGG TGAGTAACAC
101 GTGGGCAATC TGCCCTTCAC TCTGGGACAA GCCCTGGAAA CGGGGTCTAA
151 TACCGGATAC GACACACGAC CGCATGGTCT GTGTGTGGAA AGCTCCGGCG
201 GTGAAGGATG AGCCCGCGGC CTATCAGCTT GTTGGTGGGG TGATGGCCTA
251 CCAAGGCGAC GACGGGTAGC CGGCCTGAGA GGGCGACCGG CCACACTGGG
301 ACTGAGACAC GGCCCAGACT CCTACGGGAG GCAGCAGTGG GGAATATTGC
351 ACAATGGGCG AAAGCCTGAT GCAGCGACGC CGCGTGAGGG ATGACGGCCT
401 TCGGGTTGTA AACCTCTTTC AGCAGGGAAG AAGCGAGAGT GACGGTACCT
451 GCAGAAGAAG CGCCGGCTAA CTACGTGCCA GCAGCCGCGG TAAATAACGT
501 AGGGCGCAAG CGTTGTCCGG AATTATTGGG CGTAAAGAGC TCGTAGGCGG
551 CTTGTCACGT CGGATGTGAA AGCCCGGGGC TTAACCCCGG GTCTGCATTC
601 GATACGGGCA GGCTAGAGTT CGGTAGGGGA GATCGGAATT CCTGGTGTAG
651 CGGTGAAATG CGCAGATATC AGGAGGAACA CCGGTGGCGA AGGCGGATCT
701 CTGGGCCGAT ACTGACGCTG AGGAGCGAAA GCGTGGGGAG CGAACAGGAT
751 TAGATACCCTG GTAGTCCACG CCGTAAACG TTGGGAACTA GGTGTGGGCG
801 ACATTCCACG TCGTCCGTGC CGCAGCTAAC GCATTAAGTT CCCCGCCTGG
851 GGAGTACGGC CGCAAGGCTA AAACTCAAAG GAATTGACGG GGGCCCGCAC
901 AAGCAGCGGA GCATGTGGCT TAATTCGACG CAACGCGAAG AACCTTACCA
951 AGGCTTGACA TACACCGGAA ACGTCTGGAG ACAGGCGCCC CCTTGTGGTC
1001 GGTGTACAGG TGGTGCATGG CTGTCGTCAG CTCGTGTCGT GAGATGTTGG
1051 GTTAAGTCCC GCAACGAGCG CAACCCTTGT TCTGTGTTGC CAGCATGCCC
1101 TTCGGGGTGA TGGGGACTCA CAGGAGACTG CCGGGGTCAA CTCGGAGGAA
1151 GGTGGGGACG ACGTCAAGTC ACATGCCCCT TTATGTCTTG GGCTGCACAC
1201 GTGCTACAAT GGCCGGTACA ATGAGCTGCG ATACCGCGAG GTGGAGCGAA
1251 TCTCAAAAAG CCGGTCTCAG TTCGGATTGG GGTCTGCAAC TCGACCCCAT
1301 GAAGTCGGAG TTGCTAGTAA TCGCAGATCA GCATTGCTGC GGTGAATACG
1351 TTCCCGGGCC TTGTACACAC CGCCCGTCAC GTCACGAAAG TCGGTAACAC
1401 CCGAAGCCGG TGGCCCAACC CCTTGTGGGA GGGAATCGTC GAAGGTGGGA
1451 CTGGCGATTG GGACGAAGTC GTAACAAGGT AGCCGTACCG GAAGGT
用于测定化合物I抗菌活性的原始记录如下所述。
原料
阳离子可调的Mueller Hinton肉汤培基(MH；BBL)
50％溶解马血(LHB；BBL)(冷冻贮藏)
RPMI 1640(Bio Whittaker)
人血清(Pel-Freez)
RPMI 1640(Bio Whittaker)
嗜血菌属试验培基(HTM，Remel)
胰蛋白酶大豆肉汤培基(TSB，5mL/tube；BBL)
0.9％氯化钠(盐水；Baxter)
胰蛋白酶大豆+5％羊血琼脂平板(TSA；BBL)
Sabouraud葡萄糖琼脂平板(BBL)
巧克力琼脂平板(BBL)
2X脱脂乳(Remel)
微玻珠(Kramer Scientific)
MIC 2000微量滴定板注液器.
2X胰酶大豆肉汤培基(TSB，BBL)+15％甘油/50％马血清.
96-孔微量滴定板，盖子，接种碟(Dynex Laboratories)
0.5-10μL容量的8-通道芬兰多道移液器
方法
培基制备
阳离子可调的Mueller Hinton肉汤培基(BBL)按厂家说明书制备(22克溶于1000mL水；高压灭菌22分钟).冷冻贮藏。用前使用0.45Tm乙酸纤维素滤纸过滤消毒。
50％溶解马血脱纤维蛋白的马血以灭菌蒸馏水1∶1稀释；冷冻、解冻、再冷冻(至少7次)，随后离心。在-20℃冷冻贮藏。
阳离子可调的Mueller Hinton肉汤培基+2.5％溶解马血以无菌操作将5毫升50％溶解马血加入100毫升阳离子可调的Mueller Hinton肉汤培基中。使用之前用0.45Tm乙酸纤维素滤纸过滤灭菌。
阳离子可调的Mueller Hinton肉汤培基+50％人血清以无菌操作将50毫升人血清于50毫升2X阳离子可调的Mueller Hinton肉汤培基中。使用之前用0.45Tm乙酸纤维素滤纸过滤灭菌。
嗜血杆菌属试验培基(Remel)按生产者说明制备。使用之前用0.45Tm乙酸纤维素滤纸过滤灭菌。
0.9％氯化钠(盐水；Abbott研究室)已由制造商制备。
2X脱脂乳(Remel)已由制造商制备。
所有的琼脂板已由制造商制备。
测试的最高抗菌浓度＝64μg/mL(从50％DMSO中以1mg/mL sol′n开始时)
每凹孔DMSO的最终浓度＝3.2％
分离物的筛选和保存
使用的菌株由Merck菌种库、Merck临床菌库或临床检验室分离得到。流感嗜血杆菌的菌株是一种小鼠病原菌，在Merck作体内实验用。大肠杆菌的菌株是具可透性细胞壁的菌株。白色念珠菌的菌株用作对照。这些培养物于-80℃下冷冻保存在a.)微玻珠；b.)2X脱脂乳；c.)2X胰蛋白酶大豆肉汤+15％甘油/50％马血清(嗜血杆菌和肺炎链球菌)。
种菌制备
在巧克力琼脂平板上(流感嗜血杆菌)、在胰蛋白酶大豆肉汤+5％羊血琼脂平板上(肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠球菌、芽胞杆菌)或者在Sabouraud葡萄糖琼脂(念珠菌)上，35℃下对选出的分离物传代培养。嗜血杆菌和肺炎链球菌在5％二氧化碳中培育；其他所有的分离物在大气中培育。试验之前将分离物传代培养2次。
从平板上选取的接种物菌落，用以制备相当于在胰蛋白酶大豆肉汤培基中0.5McFarland标准的接种物。为肺炎链球菌制备一个密度相当于1.0McFarland标准的接种物。所有培养物的接种物密度均为TSB～108CFU/mL.TSB接种物用灭菌盐水做1∶10稀释(4mL接种物+36mL盐水，相当于～107CFU/mL)，保存在冰上，直至用来接种微量滴定板。
随机选择分离物进行菌落计数以确定CFU/槽(TSB接种物以10-5，10-6涂板在TSAII+5％SB或巧克力琼脂平板上培养过液，35℃，CO2)
装板
在96-槽微量滴定板(Dynex)的各凹槽中滴加100TL培基。制备嗜血菌属试验培基板测试流感嗜血菌；制备阳离子可调的Mueller Hinton肉汤+5％溶解马血培基板测试肺炎链球菌；制备阳离子可调的Mueller Hinton肉汤肠球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草杆菌。用RPMI 1640测试念珠菌。抗金黄色链球菌的MICs用阳离子可调的Mueller Hinton肉汤和阳离子可调的MuellerHinton肉汤+50％人血清培基测定，以确定化合物是否会由于血清中的一些成分失活(通过在MIC的增加指示)。填充好的平板包在塑料袋中(以使蒸发减到最小)冷冻贮藏，使用之前解冻。
化合物的制备
化合物以重量为基础制备。在100％DMSO中制备2mg/mL化合物，然后以DMSO/2x CAMHB(最后浓度＝50％DMSO/50％CAMHB)作1∶1稀释至1mg/mL。用96槽BD生物深槽聚丙烯，以50％DMSO/50％CAMHB对化合物做1∶1连载稀释(起始浓度1mgl/mL)。
微量肉汤培基稀释测定
用芬兰自动多道移液管，(容量0.5-10uL)将64TLs的抗菌工作液加入到已填充好的微量滴定板各槽中(第一个槽中的抗菌剂浓度＝64mg/mL；DMSO浓度＝3.2％)。抗菌剂用这样的方式添加，以使每个槽中DMSO的量保持不变(以保持化合物呈溶解状态并说明被DMSO非特异性破坏的可能原因)。最后一排槽为3.2％DMSO的生长对照。
每个试验都设对照。对照为青霉素G和氯霉素，以与化合物同样的方法制备。血清蛋白结合试验的对照也包括厄他培南(Ertapenem)。
平板培养
用MIC 2000系统(一种自动的接种平板的仪器，可在滴定板的每个槽中滴加1.5TL接种物)给微量滴定板的所有各槽中接种用盐水稀释的培养物。将滴定板在35℃下空气中培养。将一块未接种培养物的平板也作为无菌来培养。培育22-24小时后记录结果。平板上没有培养物生长。经22-24小时培育后没有培养物生长的MIC定义为最低抗菌剂水平。
化合物I对金黄色链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、枯草杆菌、肺炎链球菌和大肠杆菌的各种菌株显示出抗菌活性。化合物I也显示出对那些对多种已知抗生素有抗药性的各种菌种的抗菌活性如抗甲氧西林金黄色链球菌(MRSA)、抗万古霉素链球菌(VRE)、抗多种药物的屎肠球菌、抗大环内酯的金黄色链球菌和表皮葡萄球菌以及抗利耐唑酮的金黄色链球菌和屎肠球菌。这些实验菌株的最小抑菌浓度(MIC)值为0.1到32ug/mL。所得到的MICs值与NCCLS指标一致。
权利要求
1.一种结构式I的化合物
或其药学上可接受的盐。
2.制备结构式I化合物的方法
包括在一种营养培基中用ATCC#PTA-5316(MA7327)或ATCC#PTA-5317(MA7331)或其天然或人工突变株培养链霉菌，并且从发酵的液体培基中再分离出化合物I。
3.权利要求2的方法，其中发酵在约10℃到40℃的温度下进行。
4.权利要求3的方法，其中发酵在约28℃的温度下进行。
5.具有ATCC登记号码ATCC#PTA-5316(MA7327)的链霉菌。
6.具有ATCC登记号码ATCC#PTA-5317(MA7331)的链霉菌。
7.一种药物组分，包括一种药学上可接受的载体和有效量的权利要求1的式I化合物。
8.一种在宿主需要上述治疗时治疗细菌感染的方法，包括给宿主施用有效剂量的式I化合物。
全文摘要
用一种营养培养基与一种链霉菌属的真细菌发酵，生产一种结构式I的新型抗菌化合物。
文档编号C12P17/08GK1849313SQ20048002108
公开日2006年10月18日 申请日期2004年7月20日 优先权日2003年7月24日
发明者S·B·辛, J·王, A·巴西利奥, O·格尼罗德, P·埃尔南德斯, J·R·托尔莫 申请人:默克公司, 默沙东西班牙股份有限公司