专利名称：一株核桃根际促生乙酸钙不动杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株核桃根际促生乙酸钙不动杆菌及其应用。
背景技术：
核桃(Juglans regia L)为核桃科、核桃属植物,列世界四大坚果之首,素有“木本油料之王”的称号，其种仁有极高营养价值和保健功能。核桃又是重要用材和生态绿化树种，被广泛种植于山区、丘陵、田园和城乡，具有经济、生态和社会多重效益。中国是世界上最大的核桃生产国和消费国，核桃栽培面积和坚果总产量均居世界首位，全国有20多个省(自治区、直辖市)有核桃分布。据统计，2010年中国核桃种植总面积超过200万公顷，年坚果总产量突破90万吨。近年来，随着核桃种植效益的迅速提高，核桃施肥投入不断增加，施肥已经成为核桃丰产栽培的一项重要管理措施。现阶段核桃施用的肥料，主要是化肥组合成的复合肥料、农家肥为主的有机肥料等。由于核桃多种植在丘陵山区，土壤保水保肥能力差，复合肥的肥料养分利用率低下，造成了地表水的富营养化和地下水的污染；以农家肥为主的有机肥料虽能改善土壤理化性质，但其中的有机质性质良莠不齐、含有的病菌和病虫卵等易造成土壤污染。微生物肥料不仅能改良土壤，改善土壤生态环境，还能有效提高植物对土壤养分的吸收利用。因此，探寻适用于核桃的新型肥料，尤其是微生物肥料，以减少化肥用量、提升有机肥效应的研究倍受关注。国内关于核桃微生物肥料的研究报道较少。杨春华等(1998)从林木叶分离选育了 6个细菌菌株制剂，对核桃实生苗均有促生效果；顾斌等(2002)选用以芽孢杆菌为主要成份的生物磷肥和以硅酸盐菌为主要成份的生物钾肥等商品生物肥，在优种核桃幼龄果园中进行了应用试验；唐周斌等(2003)利用已在多种农作物上应用的PGPR菌剂，对核桃苗喷施，产生了较好的促生作用。
植物根际促生菌(plantgrowth-promoting rhizobacteria, PGPR)是微生物肥料有效菌株的重要来源。PGPR是指生存于植物根际、根表，对植物生长有促进或对病原菌有拮抗作用的有益细菌统称。大量研究证实，PGPR具有一定的专用型、土著性，因此将一些常用的微生物直接在核桃生产中应用，很难持续稳定的产生类似于农作物中的实验效果。核桃生长周期长，相对于一般的农作物来说，更容易形成一些相对稳定的微生物群落结构。因此，有必要针对核桃筛选具有促生作用的PGPR。目前，针对核桃专用PGPR的筛选未见报道。
发明内容
本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一株核桃根际促生乙酸钙不动杆菌及其应用。本发明是通过以下技术方案实现的一株核桃根际促生乙酸钙不动杆菌，其分类命名为乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)X128,已于2012年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为=CGMCC No. 7071。所述核桃根际促生乙酸钙不动杆菌的菌落特征及菌体形态将该菌在LB平板上培养24h后形成菌落有光泽，圆形，半透明。表面光滑，扁平，边缘整齐；菌体细胞大小为(1-1. 2) μ mX (O. 5-0. 6) μ m ;产芽孢，G-,细胞呈短杆状。所述核桃根际促生乙酸钙不动杆菌的生理生化特征明胶水解试验阴性，柠檬酸盐试验阳性，葡萄糖产酸试验阳性，谷氨酸转移酶试验阳性，生长温度试验37°C阳性(可生长)，41°C阴性，44°C阴性。将所述核桃根际促生乙酸钙不动杆菌的16S rDNA序列与GenBank数据库中的序列比对，结果表明X128与Acinetobacter calcoaceticus同处于一个最小分支上，其 16S rDNA 序列与 Acinetobacter calcoaceticus (AJ888983)的相似性达 99%。结合菌落形态，生理生化特征和16S rDNA序列分析,鉴定为乙酸I丐不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticu)。
所述核桃根际促生乙酸钙不动杆菌可产吲哚乙酸(IAA)，对调节植物生长和发育具有重要作用。本发明的有益效果本发明的核桃根际促生乙酸钙不动杆菌制成菌剂接种到核桃，可明显促进根系生长，提高侧根数，增加核桃地径和苗高的生长，与对照相比，差异达到显著水平。因此，本发明为将来开发核桃专用的微生物肥料提供了优良的菌株资源。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明进一步说明。一株核桃根际促生乙酸钙不动杆菌，其分类命名为乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)X128,已于2012年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为=CGMCC No. 7071。实施例1核桃根际促生乙酸钙不动杆菌的筛选( I)筛选过程通过梯度稀释法，从山东省章丘市曹范镇核桃根际土样中分离出342株分离物。通过三区划线法对分离到的细菌进行纯化，并通过镜检判断菌株是否纯化，对纯化后的细菌进行编号，挑取单菌落，转接到LB斜面上保存备用。通过保绿法筛选出21株保绿效果较好的菌株，结合萝卜子叶增重法，最终筛选出I株具有良好促生效果的细菌，记为X128。( 2 )菌落特征及菌体形态将X128在LB平板上培养24h后形成菌落有光泽，圆形，半透明。表面光滑，扁平，边缘整齐；菌体细胞大小为(1-1. 2) μ mX (0. 5-0. 6) μ m ;产芽孢，G-,细胞呈短杆状。(3)生理生化特征明胶水解试验阴性，柠檬酸盐试验阳性，葡萄糖产酸试验阳性，谷氨酸转移酶试验阳性，生长温度试验37°C阳性(可生长)，41°C阴性，44°C阴性。(4 )产IAA能力测定将X128接种于LB培养基，28 V，180rpm摇床培养4d。用分光光度法测定菌悬液的0D600值，然后将菌悬液IOOOOrpm离心lOmin，取上清液加入等体积Salkowski (50mL35%HC104+lmL0. 5M FeCl3)比色液，避光静置 30min，测定其 0D530 值。计算菌浓度0D600值为I时，单位体积发酵液中IAA的含量，通过IAA梯度稀释的标准曲线计算IAA的含量。通过测定，乙酸钙不动杆菌X128产IAA含量为26. 44yg/(mL · OD600)'(5) 16S rDNA 序列分析16S rDNA基因序列，见核苷酸序列表所示。将所测16S rDNA序列与GenBank数据库中的序列比对，结果表明X128与Acinetobacter calcoaceticus同处于一个最小分支上，其 16S rDNA 序列与 Acinetobacter calcoaceticus (AJ888983)的相似性达 99%。结合菌落形态，生理生化特征和16S rDNA序列分析,鉴定为乙酸I丐不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticu)。实施例2盆栽试验将保存的核桃根际促生乙酸钙不动杆菌X128在LB斜面上活化，挑取一环接入牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏O. 3%，蛋白胨1%，氯化钠O. 5%，琼脂2%，pH7. 0-7. 2，以上均质量百分比)中，于37°C, 180rpm条件下振荡培养2天，发酵液6000rpm下离心5min,用无菌生理盐水润洗菌体3次后，无菌生理盐水调节菌悬液活菌数为2. 5 X 108cfu/m(悬液A)，备用。将核桃苗在悬液A中沾根后定植。用无菌生理盐水将悬液A的菌液浓度调至IX 108cfu/ml(悬液B)，再取50ml悬液B均匀浇灌于核桃苗根部周围。将核桃根系在无菌生理盐水中沾根后，浇灌等量无菌生理盐水作为对照(CK)，正常管理，两个月后测定核桃根系的主根长、侧根数、苗高和地径。结果如表所示。从表中可以看出，核桃根际促生乙酸钙不动杆菌悬液A处理的核桃的主根长、侧根数、苗高和地径均分别比对照提高了 19. 65%、18. 68%,23. 07%和20. 27%。差异均达显著水平。以上表明菌株X128对核桃的生长具有明显的促进作用。
权利要求
1.一株核桃根际促生乙酸钙不动杆菌，其特征在于，其分类命名为乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)Xl28,已于2012年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为=CGMCC No. 7071。
2.权利要求1所述的核桃根际促生乙酸钙不动杆菌在促进核桃生长中应用。
全文摘要
本发明公开了一株核桃根际促生乙酸钙不动杆菌，其分类命名为乙酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)X128，已于2012年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7071。本发明还提供该核桃根际促生乙酸钙不动杆菌在促进核桃根系生长中的应用。本发明的核桃根际促生乙酸钙不动杆菌，以浇灌的方式均匀施入核桃根系的周围，可明显促进根系生长，提高侧根数，增加核桃底径和苗高的生长，与对照相比，差异达到极显著水平。因此，本发明为将来开发核桃专用的微生物肥料提供了优良的菌株资源。
文档编号C12N1/20GK103060241SQ20131001653
公开日2013年4月24日 申请日期2013年1月17日 优先权日2013年1月17日
发明者马海林, 邢尚军, 刘方春, 杜振宇, 马丙尧, 杜秉海, 丁延琴, 姚良同, 陈波 申请人:山东省林业科学研究院