养2地。然后，W初始菌体浓度0D6Q() = 0.1分别接种于装有lOOmL SC-化a培养基的250血锥形 瓶中和装有lOOmL SX-化a培养基的250血锥形瓶中，于30°C、150巧m条件下培养，使用722型 分光光度计测定菌体生长曲线。葡萄糖浓度、木糖浓度、木糖醇浓度、乙醇浓度、乙酸浓度用 高效液相色谱(Watersl515)测定，色谱柱为Aminex HPX-87H，柱溫:65°C，检测器:Waters示 差检测器2421，流动相为5mM硫酸溶液，流速0.6mL/min，进样量为10化。每组实验重复3次。 结果见图2和图3。
[0047] 3、实验结果：
[0048] 如图2所示，在W葡萄糖为单一碳源的情况下，乙酸对菌株SyBEOOe利用葡萄糖基 本没有抑制作用。添加乙酸的实验组葡萄糖消耗速率、乙醇生成速率和生长速率略低于对 照组，但是差别不大。由此可知，乙酸对于SyBEOOe利用葡萄糖仅有轻微抑制作用。
[0049] 由图3所示，在W木糖为单一碳源的情况下，乙酸对菌株SyBEOOe利用木糖有明显 抑制作用。相同菌株SyBEOOe添加乙酸实验组的木糖消耗速率、乙醇生成速率和菌株生长速 率都明显低于对照组。对照组木糖在150小时消耗尽，150小时进入稳定期，而实验组则需 200多小时进入稳定期，完全消耗尽木糖。由此可知，乙酸对于菌株SyBEOOe利用木糖有明显 抑制作用，木糖利用速率明显减慢。
[0050] 实施例3:高浓度乙酸下两菌等比例混合培养发酵
[0051 ] 1、实验材料:菌株 SyBEOOe、菌株 SyBE0036
[0化2] 2、试验方法
[0053] Yra培养基:木糖20g/L，酵母浸粉lOg/L，蛋白腺20g/L，12rc灭菌20min。木糖单独 115°C灭菌 15min。
[0054] SC培养基:葡萄糖20g/L，酵母氮源6.7g/L，氨基酸粉末2g/L，115°C灭菌15min。
[0055] YPDX培养基:葡萄糖20g/L，木糖20g/L，酵母浸粉lOg/L，蛋白腺20g/L，121°C灭菌 20min。木糖单独115°C灭菌15min。培养基中添加5.0g/L乙酸。
[0化6] 挑取Sy邸006单菌落，接种于装有5血YPX培养基的试管中，在30°C、200rpm条件下 培养24h，取0.5血接种于装有100血Yra培养基的250血锥形瓶中，在30°C、200巧m条件下培 养2地。
[0化7] 挑取Sy肥0036单菌落，接种于5mLSC-化a培养基的是试管中，在30°C、200巧m条件 下培养16h，取0.5mL接种于装有100血SC-Ura培养基的250mL锥形瓶中，在30 °C、200巧m条 件下培养12h。
[0化引然后将菌株Sy肥006和菌株Sy肥0036同时W初始菌体浓度00600 = 0.5接种于同一 瓶装有lOOmLYPDX培养基的250mL锥形瓶中，于30°C、15化pm条件下培养；同时，将菌株 Sy肥006W初始菌株浓度0D=1.0单独接种于装有lOOmLYPDX培养基的250mL锥形瓶中，使用 722型分光光度计测定菌体生长曲线。葡萄糖浓度、木糖浓度、木糖醇浓度、乙醇浓度、乙酸 浓度用高效液相色谱(Watersl515)测定，色谱柱为Aminex HPX-87H，柱溫：65°C，检测器： Waters示差检测器2421，流动相为5mM硫酸溶液，流速0.6mL/min，进样量为10化。每组实验 重复3次。结果见图4。
[0化9] 3、实验结果
[0060] 如图4所示，在添加高浓度5 . Og/L乙酸浓度的培养基中，菌株SyBEOOe和菌株 Sy肥0036等比例混菌培养在30小时左右，生长进入稳定期，消耗尽全部葡萄糖，开始利用木 糖。而单独培养菌株SyBEOOe需要100小时才可W达到稳定期，将葡萄糖消耗尽，开始利用木 糖。混菌培养较单菌培养，加快了五六碳糖的发酵进程，缩短了 70小时，对于工业利用可W 缩短时间，减少成本，提高效率。
[0061] 实施例4:高浓度乙酸下两菌不同比例混合培养发酵
[0062] 1、实验材料:菌株 SyBEOOe、菌株 SyBE0036
[0063] 2、试验方法
[0064] Yra培养基:木糖20g/L，酵母浸粉lOg/L，蛋白腺20g/L，121°C灭菌20min。木糖单独 115°C灭菌 15min。
[00化]SC培养基:葡萄糖20g/L，酵母氮源6.7g/L，氨基酸粉末2g/L，115°C灭菌15min。
[0066] SCX培养基:葡萄糖20g/L，木糖20g/L，酵母氮源6.7g/L，氨基酸粉末2g/L，12 rC灭 菌2〇111；[]1。木糖单独115"€灭菌151]1；[]1。培养基中添加5.0旨/1^乙酸。
[0067] 挑取Sy邸006单菌落，接种于装有5血YPX培养基的试管中，在30°C、200rpm条件下 培养24h，取0.5血接种于装有100血Yra培养基的250血锥形瓶中，在30°C、200巧m条件下培 养2地。
[0068] 挑取Sy肥0036单菌落，接种于5mLSC-化a培养基的是试管中，在30°C、200巧m条件 下培养16h，取0.5mL接种于装有100血SC-Ura培养基的250mL锥形瓶中，在30 °C、200巧m条 件下培养12h。
[0069] 然后，将菌株SyBEOOe和菌株SyBE0036同时W初始菌体浓度按如下接种比例 (Sy 邸006:Sy 邸0036 = 0:1、0.02:0.98、0.5:0.5、0.98:0.2、1:0)，初始总0〇6〇〇=1.0保持不 变，接种于同一瓶装有1 OOmL SCX培养基的250mL锥形瓶中，于30°C、150巧m条件下培养。葡 萄糖浓度、木糖浓度、木糖醇浓度、乙醇浓度用高效液相色谱(Watersl515)测定，色谱柱为 Aminex HPX-87H，柱溫:65°C，检测器:Waters示差检测器2421，流动相为5mM硫酸溶液，流速 0.6mL/min，进样量为10化。每组实验重复3次。结果见图5。
[0070] 3、实验结果
[0071] 如图5所示，在添加5. Og/L乙酸浓度的培养基中，SyBEOOe: SyBE0036 = 0.02:0.98、 0.5:0.5、0.98:0.02比例的混菌培养都在30-40小时左右进入稳定期，消耗尽全部葡萄糖， 与单独培养的Sy邸0036利用情况接近。混合培养的菌株，消耗尽葡萄糖后，30-40小时左右 开始立即代谢木糖，而单独培养的SyBEOOe需要将近100小时才可W进入稳定期，消耗尽葡 萄糖，开始利用木糖。
[0072] 实施例5:高浓度乙酸下两菌等比例混合培养发酵
[0073] 1、实验材料:菌株 SyBEOOe、菌株 SyBE0036
[0074] 2、试验方法
[00巧]Yra培养基:木糖20g/L，酵母浸粉lOg/L，蛋白腺20g/L，121°C灭菌20min。木糖单独 115°C灭菌 15min。
[0076] SC培养基:葡萄糖20g/L，酵母氮源6.7g/L，氨基酸粉末2g/L，115°C灭菌15min。
[0077] SCX培养基:葡萄糖20g/L，木糖20g/L，酵母氮源6.7g/L，氨基酸粉末2g/L，115 °C灭 菌15min。木糖单独115°C灭菌15min。培养基中添加3.75g/L乙酸。
[0078] 挑取Sy邸006单菌落，接种于装有5血YPX培养基的试管中，在30°C、200rpm条件下 培养24h，取0.5血接种于装有100血Yra培养基的250血锥形瓶中，在30°C、200巧m条件下培 养2地。
[00巧]挑取Sy肥0036单菌落，接种于5mLSC-化a培养基的是试管中，在30°C、200巧m条件 下培养16h，取0.5mL接种于装有100血SC-Ura培养基的250mL锥形瓶中，在30 °C、200巧m条 件下培养12h。
[0080] 然后，将菌株Sy邸006和Sy邸0036同时W初始菌体浓度OD6〇o = 0.1接种于同一瓶装 有lOOmLSCX培养基的250mL锥形瓶中，于30°C、150巧m条件下培养；同时，将菌株Sy邸006 W 初始菌株浓度00 = 0.2单独接种于装有lOOmLSCX培养基的250mL锥形瓶中，使用722型分光 光度计测定菌体生长曲线。葡萄糖浓度、木糖浓度、木糖醇浓度、乙醇浓度、乙酸浓度用高效 液相色谱(Watersl515)测定，色谱柱为Aminex HPX-87H，柱溫:65°C，检测器:Waters示差检 测器2421，流动相为5mM硫酸溶液，流速0.6mL/min，进样量为10化。每组实验重复3次。结果 见图6。
[0081] 3、实验结果
[0082] 如图6所示，在添加3.75g/L乙酸浓度的培养基中，混菌培养在30小时左右，生长进 入稳定期，消耗尽全部葡萄糖，开始利用木糖。而单独培养菌株SyBEOOe需要100小时才可W 达到稳定期，将葡萄糖消耗尽，开始利用木糖。由此可知，混菌培养在菌体量较低的情况下， 仍可W发挥作用，加快发酵进程，较单菌发酵更快的耗尽葡萄糖，利用木糖。
【主权项】
1. 一种混菌体系，其特征在于，包括酵母菌株SyBE006、酵母菌株SyBE0036。2. 根据权利要求1所述的混菌体系，其特征在于，所述酵母菌株SyBE006与菌株 SyBE0036的浓度比为1:49~49:1。3. 根据权利要求2所述的混菌体系，其特征在于，所述酵母菌株SyBE006与菌株 SyBE0036的浓度比为1:1。4. 权利要求1-3任意一种所述混菌体系在抑制剂存在下五碳糖、六碳糖共发酵中的应 用。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抑制剂为乙酸;所述五碳糖为木糖，所 述六碳糖为葡萄糖。6. -种在抑制剂存在下五碳糖、六碳糖共发酵的方法，其特征在于，接种权利要求1所 述混菌体系于含抑制剂的五碳糖与六碳糖混合液中发酵。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述抑制剂为乙酸，乙酸的浓度为3.5g/L- 5. Og/L;所述五碳糖为木糖，所述六碳糖为葡萄糖。8. 根据权利要求6所述的发酵方法，其特征在于，所述混菌体系中所述酵母菌株 SyBE006与酵母菌株SyBE0036的浓度比为1:49~49:1。9. 根据权利要求6-8任意一项所述的发酵方法，其特征在于，所述混菌体系的接种浓度 为初始菌体浓度0D600 = 0.1~1.0。10. 根据权利要求6-9任意一项所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵为30°C、150rpm 条件下培养。
【专利摘要】本发明涉及发酵技术领域，公开了含乙酸的环境中快速利用五碳糖的混菌体系。本发明所述混菌体系包括酵母菌株SyBE006和酵母菌株SyBE0036。酵母菌株SyBE006和酵母菌株SyBE0036混合发酵在解决纤维素预处理水解液中副产物乙酸对酵母发酵的抑制的同时通过木糖利用菌实现五、六碳糖的共利用。本发明通过混菌发酵成功解决了纤维素乙醇生产过程中存在条件下的木糖利用的问题，实现在酵母抑制剂存在条件下五、六碳糖共发酵。此外，通过酵母菌株SyBE006和酵母菌株SyBE0036混菌发酵，加速了发酵进程，缩短发酵周期，提高效率，降低成本。
【IPC分类】C12P7/14, C12N1/16, C12P7/10
【公开号】CN105670951
【申请号】CN201610015565
【发明人】元英进, 白雪, 李炳志, 王昕 , 査建
【申请人】天津大学
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年1月7日