专利名称：细胞膜被修饰的细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及被生理活性物质或探针修饰的细胞。更详细地说，本发明涉及生理活性物质或探针与两亲性化合物的反应生成物通过非共价键与细胞膜结合的细胞。
在特表2000-507849号报道了使之与相对于细胞表面存在的官能基的生物体适合性聚合物反应，通过共价键进行表面修饰的方法。另外，在The FASEB Journal，10，574？586，1996中报道了使用GPI-锚连蛋白(GPI-anchored protein)的细胞表面的修饰方法。另外，在Polymer Preprints，Japan，47，10，2499-2500，1998和蛋白质·核酸·酶，45，11，1859-1864，2000中，公开了包含使用聚丙烯酰胺作为水溶性高分子，使该高分子末端的反应性基团与膜蛋白或糖链反应工序的细胞表面的修饰方法，通过配位体与细胞膜上的受体结合修饰细胞表面的方法，和使用疏水性锚修饰细胞表面的方法。
这样，虽然已知几种通过使细胞膜蛋白和糖链与高分子末端的反应性基团结合进行细胞表面的修饰的方法，但是，直接在细胞膜上进行这样的化学修饰，使细胞表面物质的性质变化，恐怕会给细胞带来障碍。另外，使用GPI-锚连蛋白的方法，由于GPI-锚连蛋白本身的获得是困难的，存在适用范围有限的问题。另外，使用疏水性锚的方法是只用聚丙烯酰胺链对表面修饰，达到细胞凝聚的抑制、修饰后的稳定性很差，而且也未证实在细胞膜表面可固定化聚丙烯酰胺链。另外，用这些方法都不可能在细胞表面结合生理活性物质。
另外，在The Journal of Immunology，2433-2443，2000中，公开了使用含有烃基的螯合物，将该螯合物在细胞膜上锚定后，在该螯合物上离子键合生理活性物质的方法。但是，使用该方法，由于生理活性物质与细胞膜的结合是离子键合，结合容易受到盐浓度或pH的影响，是不稳定的，也存在在细胞上的应用范围受到限制的问题。另外，由于该螯合物不含亲水性基团，亲油性强，向细胞的添加是困难的，因此采用通过脂质体化细胞融合使之摄取到细胞中的方法等，但通过该方法细胞修饰不是简便的。
如上所述，不对细胞造成伤害，通过共价键使生理活性物质结合到该细胞膜上的改质细胞膜的方法不是已知的。
本发明者们为解决上述课题进行了积极地研究，发现使用使生理活性物质或探针等修饰对象物质与两亲性化合物反应得到的反应生成物，可非共价键地修饰细胞膜，以及通过使用具有脂肪族烃基的特定两亲性化合物，可不对细胞产生伤害，极其有效地进行修饰。本发明是基于这些知识完成的。
即，本发明是提供，具有下述特征的两亲性化合物(1)在1个末端中含有1个以上脂肪族烃基，(2)在分子中具有1个以上含有亲水性基团的部分，和(3)在与(1)不同的末端中具有1个以上可与修饰对象物质共价结合的反应性官能基和修饰对象物质的反应生成物通过非共价键结合在细胞膜上的细胞。按照本发明的优选方案，提供修饰对象物质是生理活性物质或探针的上述细胞；和细胞是动物细胞的上述细胞。
按照本发明更优选的方案，提供脂肪族烃基是含有1个以上碳原子数11～18的脂肪族烃基的化合物残基的上述细胞；脂肪族烃基是含有1个以上油基或碳原子数17的不饱和脂肪族烃基的化合物残基的上述细胞；和亲水性基团是含有聚氧化烯基的化合物残基的上述细胞。
按照本发明特别优选的方案，两亲性化合物是，下述通式(1) (式中，Z表示具有2～10个羟基的化合物残基；AO表示碳原子数2～4的氧亚烷基；R1表示氢原子或碳原子数1～3的烃基；R2表示含有碳原子数7～22的脂肪族烃基的化合物残基；X表示含有1个以上选自琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺基、氨基、羧基、醛基、缩水甘油基、和巯基的反应性官能基的基团；a表示0或1；n1、n2、和n3表示碳原子数2～4的氧亚烷基的平均加成摩尔数，且n1、n2、n3、k1、k2、和k3是满足下列条件的数0≤n1、n2≤500、2≤n3≤500，且2≤n1+n2+n3≤5000≤k1≤8、1≤k2≤4、1≤k3≤4、且2≤k1+k2+k3≤10)所表示的化合物的上述细胞。
按照上述本发明更优选的方案，提供R2是含有1个以上碳原子数11～18的直链脂肪族烃基的化合物残基的上述细胞；R2是含有1个以上油基或碳原子数17的不饱和脂肪族烃基的化合物残基的上述细胞；和R2是下述通式(2) (R3和R4分别独立地表示碳原子数7～21的烃基；R5表示碳原子数2～4的烃基，b是0或1)所示的基团的上述细胞。
另一方面，本发明提供了为使与生理活性物质或探针的反应生成物通过非共价键与细胞膜结合使用的上述两亲性化合物；和用于细胞膜修饰的上述两亲性化合物的用途。另外，本发明提供了细胞膜的修饰方法，含有下述工序(1)使生理活性物质或探针与上述两亲性化合物反应的工序；和(2)使上述工序(1)得到的反应生成物通过非共价键与细胞膜结合的工序。
图2是用与聚氧化乙烯油基醚(n＝90，平均分子量4400)-生物素缀合物结合的荧光素标识的链霉抗生物素进行膜修饰的小鼠成纤维细胞株NIH3T3(例2)的切片的显微照片。
图3是表示用流式细胞仪观察的通过聚氧化乙烯油基醚(n＝90，平均分子量4400)-EGFP缀合物膜修饰的浮游细胞(例6)的结果的图。
图4是用与聚氧化乙烯油基醚(n＝180，平均分子量8400)-生物素缀合物结合的荧光素标识的链霉抗生物素膜修饰的小鼠成纤维细胞株NIH3T3(例9)的显微照片。
图5是用荧光标识(荧光素)-聚氧化乙烯修饰的二油酰基磷脂酰乙醇胺膜修饰的小鼠成纤维细胞株NIH3T3(例11)的显微照片。
图6是尝试通过聚氧化乙烯(n＝114，平均分子量5000)-生物素进行膜修饰的小鼠成纤维细胞株NIH3T3(例16比较例)的显微照片。
对于适合与细胞结合的修饰对象物质的种类没有特别的限制，可使用任何具有至少一个可与两亲性化合物共价结合的官能基的物质。作为可共价结合的官能基，可列举例如，氨基、羟基、巯基、羧基等。作为修饰对象化合物，优选可使用生理活性物质或探针。本发明的细胞中可结合两种以上的修饰对象物质，例如，也可组合生理活性物质和探针后与细胞结合。
对于生理活性物质的种类没有特别的限制，例如，除了作为酶抑制剂或受体·拮抗剂或激动剂等药物有效成分的化合物以外，可使用氨基酸、寡肽、多肽、蛋白质、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、糖蛋白、单糖类、多糖类、和维生素类等，低分子物质到高分子物质的各种物质。优选作为生理活性物质可列举多肽如明胶、抗体、粘附分子、受体、增殖因子等细胞因子。在本说明书中使用的“生物活性物质”的用语是应是包含可引起至少一种生理反应的物质，或在生物体内可利用的生物体关联物质等的最广义的解释，不是任何意义中限定的解释。
作为探针，可使用为检出氨基酸、寡肽、多肽、蛋白质、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、酶底物、金属离子等的探针，可使用荧光探针、发光探针、磁性探针、放射性探针、和金胶体等微粒子探针等。理所当然的，可利用的探针并不限于以上述物质为对象的探针和具备上述检出手段的探针。
该两亲性化合物是具有下述特征的化合物(1)在1个末端中含有1个以上脂肪族烃基，(2)在分子中具有1个以上含有亲水性基团的部分，和(3)在与(1)不同的末端中具有1个以上可与修饰对象物质共价结合的反应性官能基。
作为亲水性基团，可使用合成和天然的水溶性化合物，优选水溶性高分子化合物的残基。作为提供亲水性基团的水溶性化合物，可列举例如，聚亚烷基二醇、多糖、聚乳酸、聚乙烯基醇、聚丙烯酸和聚丙烯酰胺等，优选聚亚烷基二醇、多糖、聚乳酸、聚乙烯基醇，更优选聚亚烷基二醇。
作为脂肪族烃基，可以是合成或天然的脂肪族烃由来的基团，优选碳原子数6～24的饱和或不饱和的直链或支链脂肪族烃基(在本说明书中所说的“不饱和”的情况是对于分子或官能基中存在的双键或三键的数没有特别的限制，可组合含有双键和三键)，更优选含有碳原子数11～18的饱和或不饱和的脂肪族烃基的基团，更优选含有油基或碳原子数17的不饱和脂肪族烃基的基团。该烃基可以是单独一种，也可以是两种以上的组合。组合两种以上时，对其组合方式没有限制。
两亲性化合物中的反应性官能基，优选在亲水部分末端配置。作为反应性官能基，可使用任何与生理活性物质的氨基、羧基、巯基、和羟基等官能基可反应的反应性官能基。可列举例如，琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺基、氨基、羧基、醛基、缩水甘油基或巯基等。
作为两亲性化合物，可使用式(1)所示的化合物。作为Z表示的具有2～10个羟基的化合物残基，具体可列举，乙二醇、丙二醇、甘油、二甘油、季戊四醇、三甘油、四甘油、五甘油、六甘油、七甘油、和八甘油等化合物残基。作为Z优选可使用具有2～8个羟基的化合物的残基。
AO是碳原子数2～4，优选碳原子数2或3的氧亚烷基，可列举例如，氧亚乙基、氧亚丙基、氧三亚甲基、氧亚丁基、氧四亚甲基等。其中，特别优选氧亚乙基。分子内虽然只存在n个氧亚烷基，但该氧亚烷基可以是单独一种，或也可以是2种以上的组合。在2种以上组合的情况下，对其组合方式没有特别的限制。另外，氧亚烷基可以是嵌段状也可以是无规的。条件是，由于相对于全体氧亚烷基的氧亚乙基的比率低的话，水溶性降低，因此优选相对于全体氧亚烷基的氧亚乙基的比率在50～100摩尔％。
式(1)中n1+n2+n3表示氧亚烷基的平均加成摩尔数，该总和例如在2～500范围内，优选8～300，更优选12～200。加成摩尔数，例如，可由与R1或R2的疏水性基团的亲水性和疏水性平衡决定。在k2是2以上，或R2是磷脂化合物残基时，显示疏水性的脂肪族烃基存在2链以上，氧亚烷基的平均加成摩尔数n1+n2+n3优选20～500，更优选30～200。
前述式(1)所示的k1+k2+k3的值是对应于Z的分支数，为2～10，优选是2～4的整数。在k1+k2+k3的值比2小时，由于得不到一个末端是脂肪族烃基的疏水性基团，另一个末端是具有反应性官能基的化合物，因此对于细胞表面的修饰是不利的。另外，在k1+k2+k3的值比10大时，由于分子的立体结构变得过大，由于立体障碍不能进行稳定的表面修饰。
在前述式(1)中，k1是聚氧化烯分支末端的残基为氢原子或碳原子数1～3的烃基(具体为甲基、乙基、正丙基、或异丙基)的残基的合计数，是0～8范围内的整数。在前述式(1)中，k2是在聚氧化烯末端残基中含有碳原子数8～22的脂肪族烃基的化合物残基的结合数，是1～4的整数。K2是0时，由于不存在疏水性基团，不能完成细胞的修饰，在5以上时，由于体积大不能在细胞膜上锚定。
在前述式(1)中a是0或1，a是0情况是指R2所示的含有脂肪族烃基的化合物残基在聚氧化烯残基的末端醚键合，a是1的情况是指R2所示的含有脂肪族烃基的化合物残基在聚氧化烯残基的末端通过羰基酯键合。
在前述式(1)中，k3是X所示的含有反应性基团的基团与末端残基结合的聚氧化烯残基的数，为1～4的整数，优选1～3。K3是2以上的情况，X中含有的反应性基团可以是单独一种，也可以是2种以上的组合。在2种以上的情况下，可使同种或不同种的生理活性物质结合，导入细胞膜。
在前述式(1)中，R1是氢原子、甲基、乙基、或直链或支链丙基。K2是1以上时，含有R2的脂肪族烃基的化合物残基作为式(1)化合物的疏水性基团作用。
在前述式(1)中，R2是含有碳原子数7～22的脂肪族烃基的化合物残基。优选碳原子数7～22的饱和或不饱和的直链或支链的脂肪族烃基，或具有1个以上碳原子数7～22的饱和或不饱和的直链或支链的脂肪族烃基的含有磷酸基的化合物残基。作为R2的具体例，a是0时，可列举辛基、癸基、月桂基、肉豆蔻基、肉豆蔻脑基、棕榈基、棕榈油基、硬脂基、异硬脂基、油基、亚油基、二十烷基、二十烯基、二十二烷基、芥基(エルカイル基)等饱和或不饱和直链或支链的烃基。优选碳原子数10～20的饱和或不饱和的脂肪族烃基或具有碳原子数10～20的饱和或不饱和脂肪族烃基的磷脂残基，更优选碳原子数11～18的饱和或不饱和直链脂肪族烃基或具有碳原子数11～18的饱和或不饱和直链烃基的磷脂残基，最优选碳原子数18的饱和或不饱和直链脂肪族烃基或具有碳原子数17的饱和或不饱和的直链脂肪族烃基的磷脂残基。作为磷脂，可列举磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸等。另外，a是1时，作为R2CO的具体例可列举，例如，辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻脑酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、异硬脂酸、油酸、亚油酸、花生酸、二十二烷酸、芥酸等饱和或不饱和直链或支链脂肪酸由来的酰基，优选油酸由来的酰基。
在前述式(1)中，X是含有琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺基、氨基、羧基、醛基、缩水甘油基、或巯基等反应性官能基的基团。对于在聚氧化烯残基末端的X的结合方式没有特别的限制，可使用JMS-REV.MACROMOL.CHEM.PHYS.，C25(3)，325-372(1985)等报告的一般的结合方式，但是为了简便导入上述反应基团，优选通过2价烃基、酯或酰胺键进行导入。作为在该目的中使用的烃基，可列举例如，亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基和亚己基等，或亚苯基等环状化合物基团，酯键可以是单羧酸或二羧酸由来的酯键，作为二羧酸可列举琥珀酸、戊二酸和马来酸等，作为酰胺键可列举乙酰胺和丙酰胺由来的酰胺键。
前述式(2)是含有1个以上碳原子数7～21的饱和或不饱和的直链或支链脂肪族烃基的含磷酸基的化合物残基，即含有磷脂酰乙醇胺的残基。在前述式(2)中，R3和R4分别独立地是碳原子数7～21的饱和或不饱和的直链或支链烃基，优选碳原子数11～17的饱和或不饱和直链烃基，更优选碳原子数17的不饱和脂族烃基。R3和R4通常可使用R3CO和R4CO形式的脂肪酸由来的酰基。作为R3CO和R4CO的具体例可列举，例如，辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻脑酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、异硬脂酸、油酸、亚油酸、花生酸、二十二烷酸、芥酸等饱和或不饱和直链或支链脂肪酸由来的酰基，更优选油酸由来的酰基。
R3和R4可相同或不同。R3和R4的碳原子数分别超过21时，由于疏水性变强柔软性小，可能与细胞膜的结合变得困难，另外，碳原子数比7小时，与细胞膜结合后，由于疏水性弱，可能从细胞膜脱落。R2是式(2)所示的含磷脂化合物的残基时，由于有2个酰基，细胞膜修饰后的稳定性比一根链高，以与细胞膜锚定的状态很难发生分子的脱落。
在前述式(2)中，R5是碳原子数2～4的2价烃基，可以是直链、支链、环状、或它们的组合的任一种，可以是饱和或不饱和的。具体可列举-CH2CH2-、-(CH2)3-、或(CH2)4-基等。
B表示0或1。
在本发明细胞中，在两亲性化合物具有1个以上不对称碳原子时，作为两亲性化合物，可使用任意的光学活性体或非对映异构体等纯形式的立体异构体、立体异构体的任意混合物、外消旋体等任意物质。另外，含有烯烃类双键时，可以使用纯粹形式的E体或Z体，或它们的混合物中的任一种。
本发明提供的细胞膜的修饰方法，特征在于包含下述工序(1)使生理活性物质或探针与上述两亲性化合物反应的工序；和(2)将上述工序(1)得到的反应生成物通过非共价键与细胞膜结合的工序。
在前述工序(1)反应工序中使用的溶剂的种类，只要是与反应无关的溶剂都可以，对此没有特别的限制，可使用磷酸缓冲液、硼酸缓冲液、Tris缓冲液、醋酸缓冲液、碳酸缓冲液、グッド缓冲液等缓冲液或其等渗液，或有机溶剂或上述水性介质和有机溶剂的混合物等，这可以是单独溶剂体系，也可以是混合溶剂体系。优选使用不使生理活性物质等的修饰对象物质变性失活的与反应无关的乙腈、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺等有机溶剂。反应温度只要是不使生理活性物质等的修饰对象物质变性失活的温度都可以，对此没有特别的限制，例如，0～100℃，优选0～40℃。反应时间通常为1分钟～48小时左右，优选0.5～3小时。反应后，可使用透析、超滤、凝胶过滤等常用的蛋白质纯化法等纯化反应生成物，但也可以不进行反应生成物的纯化用于工序(2)中。
在工序(2)中，可将工序(1)得到的反应生成物加入培养细胞中，但也可以将在细胞培养液或等渗液中使用的上述工序(1)得到的反应生成物稀释为临界胶束形成浓度(以下简称为CMC)的0.1～1000倍，优选其CMC的1～500倍，更优选其CMC的10～100倍后添加。工程(1)得到的反应生成物向细胞的结合通常在0～40℃进行，进行1秒～120分钟，优选在25～37℃进行10秒～20分钟。在该工序中，也可添加工序(1)得到的反应生成物以外的添加剂。在细胞膜上使上述反应生成物结合后，可向细胞中添加等渗液洗净。作为使用的等渗液只要是对细胞没有伤害的溶剂都可以，对此没有特别的限制，可使用磷酸缓冲液生理盐水、细胞培养液等等渗液。
聚氧化乙烯油基醚(n＝90，平均分子量4400)-生物素缀合物的制备将4.4mg(1nmol)的活性化聚氧化乙烯油基醚(n＝90，平均分子量4400)溶于二甲基亚砜0.1ml中，形成活性化聚氧化乙烯油基醚(n＝90，平均分子量4400)溶液，将1nmol的EZ-linkTM生物素-PEO-胺(PIERCE社制；Cat#21346)溶于0.1ml的二甲基亚砜形成生物素-PEO-胺溶液，向其中加入聚氧化乙烯油基醚(n＝90，平均分子量4400)溶液形成反应液。将反应液在室温(约25℃)搅拌后，放置1小时。向反应液中加入1M的Tris缓冲液(pH8.0)0.02ml和组织培养用磷酸缓冲生理食盐水(用Dulbecco PBS(-)组织培养用“Nissui”粉末(日水制药(株)；Cat#05913)配制的)0.78ml，得到聚氧化乙烯油基醚(n＝90，平均分子量4400)-生物素缀合物溶液。实施例2聚氧化乙烯油基醚(n＝90，平均分子量4400)-生物素缀合物向小鼠成纤维细胞株NIH3T3的锚定小鼠成纤维细胞株NIH3T3的培养使用玻璃底微孔培养皿(35mm培养皿，未涂层的，No.0盖玻片)容器使用添加了10％胎牛血清的Dulbecco改良伊格尔培养基将小鼠成纤维细胞NIH3T3在37℃，5％二氧化碳浓度的条件下培养。达到约80％辅满为止培养20小时到45小时。将实施例1得到的聚氧化乙烯油基醚(n＝90，平均分子量4400)-生物素缀合物原液用Dulbecco改良伊格尔培养基稀释至1/100倍，配制聚氧化乙烯油基醚(n＝90，平均分子量4400)-生物素缀合物液。用过滤灭菌处理过的磷酸缓冲液生理食盐水(同上)2ml将附着了NIH3T3细胞的玻璃底微孔培养皿容器冲洗后，向玻璃表面附着的NIH3T3加入0.1ml的聚氧化乙烯油基醚-生物素缀合物液，在37℃反应5分钟。反应后，用磷酸缓冲液生理盐水2ml将细胞洗涤2次，向细胞中添加6.7nM链霉抗生物素荧光缀合物(分子探针Cat#S-869)(以下，称为荧光标识的链霉抗生物素)磷酸缓冲液生理盐水溶液0.1ml后，在37℃保温20分钟。
用磷酸缓冲生理盐水2ml将细胞洗涤3次后，向细胞中添加磷酸缓冲生理盐水1ml，得到被与聚氧化乙烯油基醚(n＝90，平均分子量4400)-生物素缀合物结合的荧光标识的链霉抗生物素膜修饰的细胞。细胞的膜修饰，通过将细胞在共焦点激光扫描显微镜(Leica社制)观察确认细胞膜的修饰。结果在表1和
图1中显示。其结果，在视野(1000倍)中观察到所有细胞的细胞膜上都有来自荧光素的荧光。可确认聚氧化乙烯油基醚(n＝90，平均分子量4400)-生物素缀合物在5分钟与所有的细胞膜锚定。另外，生物素与链霉抗生物素的结合也没有被阻碍。
细胞的立体观察与实施例2相同，将用聚氧化乙烯油基醚(n＝90，平均分子量4400)-生物素缀合物处理的NIH3T3用荧光标识的链霉抗生物素染色，用共焦点激光扫描显微镜捡出高度方向(Z轴方向)2.3μm间隔的0.86μm宽的光学切片观察。其结果如图2所示。在所有细胞中，可观察到只对细胞膜特异性的来自荧光素的荧光，通过立体的细胞观察可确认液相中露出的细胞膜的所有部分与聚氧化乙烯油基醚(n＝90，平均分子量4400)-生物素缀合物结合。
与实施例4相同，将CHO细胞与聚氧化乙烯油基醚(n＝90，平均分子量4400)-EGFP缀合物保温，用共焦点激光扫描显微镜观察。其结果如表1所示。其结果，在所有用聚氧化乙烯油基醚(n＝90，平均分子量4400)-EGFP缀合物液处理的CHO细胞的细胞膜上可观察到来自EGFP的荧光，可确认也可锚定在小鼠细胞以外的细胞上。
用流式细胞仪(コ一ルタ一社、EPICS-C)观察分别处理的细胞悬浮液。其结果如表2和图3所示。其结果，与只用EGFP处理的浮游细胞相比，用聚氧化乙烯油基醚-EGFP缀合物处理时，可观察到荧光强度强的细胞数增加了。由此可知，通过用聚氧化乙烯油基醚-EGFP缀合物处理，在所有的浮游细胞膜上付与了EGFP，确认了在浮游细胞中可锚定聚氧化乙烯油基醚-EGFP。
实施例7到9的结果如表1所示。而且，实施例9的结果如图4所示。观察到在所有用聚氧化乙烯油基醚-生物素缀合物液处理的NIH3T3细胞的细胞膜上都有来自荧光素的荧光，确认了即使聚氧化乙烯的氧化乙烯加成摩尔数从15到180变化，任一个都可在细胞膜上锚定。
其结果，在所有用生物素-NH2溶液处理的细胞中完全观察不到来自荧光素的荧光。由此可确认，生物素本身不与细胞结合。
表1 表中，++表示在视野(1000倍)中在所有细胞的细胞膜可观察到很强的荧光活性；+表示在视野(1000倍)中在所有细胞的细胞膜可观察到荧光活性；-表示在视野(1000倍)中在所有细胞的细胞膜上几乎观察不到荧光活性。
表2
评价细胞的荧光强度的相对值产业上的可利用性本发明的细胞具有如下特征，由于用生理活性物质或探针等修饰对象物质稳定地修饰了细胞膜，在细胞膜修饰中不对细胞产生伤害，通过细胞膜修饰可稳定且长期地表达所期望的特性。另外，本发明提供的细胞膜的修饰方法，特征在于可有效且稳定地提供具有上述特征的细胞。
权利要求
1.具有下述特征的两亲性化合物(1)在1个末端中含有1个以上脂肪族烃基，(2)在分子中具有1个以上含有亲水性基团的部分，和(3)在与(1)不同的末端中具有1个以上可与修饰对象物质共价结合的反应性官能基和修饰对象物质的反应生成物通过非共价键结合在细胞膜上的细胞。
2.权利要求1记载的细胞，其中修饰对象物质是生理活性物质或探针。
3.权利要求1记载的细胞，其中细胞是动物细胞。
4.权利要求1记载的细胞，其中脂肪族烃基是含有1个以上碳原子数11～18的脂肪族烃基的化合物残基。
5.权利要求4记载的细胞，其中脂肪族烃基是含有1个以上油基或碳原子数17的不饱和脂肪族烃基的化合物残基。
6.权利要求1记载的细胞，其中亲水性基团是含有聚氧化烯基的化合物残基。
7.权利要求5记载的细胞，其中亲水性基团是含有聚氧化烯基的化合物残基。
8.权利要求6记载的细胞，其中两亲性化合物是，下述通式(1)所示的化合物 式中，Z表示具有2～10个羟基的化合物残基；AO表示碳原子数2～4的氧亚烷基；R1表示氢原子或碳原子数1～3的烃基；R2表示含有碳原子数7～22的脂肪族烃基的化合物残基；X表示含有1个以上选自琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺基、氨基、羧基、醛基、缩水甘油基、和巯基的反应性官能基的基团；a表示0或1；n1、n2、和n3表示碳原子数2～4的氧亚烷基的平均加成摩尔数，且n1、n2、n3、k1、k2、和k3是满足下列条件的数0≤n1、n2≤500、2≤n3≤500，且2≤n1+n2+n3≤5000≤k1≤8、1≤k2≤4、1≤k3≤4、且2≤k1+k2+k3≤10。
9.权利要求8记载的细胞，其中R2是含有1个以上碳原子数11～18的直链脂肪族烃基的化合物残基。
10.权利要求8记载的细胞，其中R2是含有1个以上油基或碳原子数17的不饱和脂肪族烃基的化合物残基。
11.权利要求8记载的细胞，其中R2是下述通式(2)所示基团 R3和R4分别独立地表示碳原子数7～21的烃基；R5表示碳原子数2～4的烃基，b是0或1。
12.权利要求1记载的两亲性化合物，用于使与生理活性物质或探针的反应生成物通过非共价键与细胞膜结合。
13.权利要求8记载的两亲性化合物，用于使与生理活性物质或探针的反应生成物通过非共价键与细胞膜结合。
14.权利要求11记载的两亲性化合物，用于使与生理活性物质或探针的反应生成物通过非共价键与细胞膜结合。
15.细胞膜的修饰方法，含有下述工序(1)使生理活性物质或探针与权利要求1记载的两亲性化合物反应的工序；和(2)使上述工序(1)得到的反应生成物通过非共价键与细胞膜结合的工序。
16.细胞膜的修饰方法，含有下述工序(1)使生理活性物质或探针与权利要求8记载的两亲性化合物反应的工序；和(2)使上述工序(1)得到的反应生成物通过非共价键与细胞膜结合的工序。
17.细胞膜的修饰方法，含有下述工序(1)使生理活性物质或探针与权利要求11记载的两亲性化合物反应的工序；和(2)使上述工序(1)得到的反应生成物通过非共价键与细胞膜结合的工序。
全文摘要
具有下述特征的两亲性化合物(1)在1个末端中含有1个以上脂肪族烃基，(2)在分子中具有1个以上含有亲水性基团的部分，和(3)在与(1)不同的末端中具有1个以上可与修饰对象物质共价结合的反应性官能基和修饰对象的反应生成物通过非共价键结合在细胞膜上的细胞。
文档编号C12N5/00GK1405300SQ02128658
公开日2003年3月26日 申请日期2002年8月9日 优先权日2001年8月9日
发明者长栋辉行, 伊藤智佳, 安河内彻, 大桥俊辅, 久保和弘 申请人:日本油脂株式会社, 长栋辉行