CRY1EA和CRY1CA的嵌合型δ－内毒素蛋白的制作方法

专利名称：CRY1EA和CRY1CA的嵌合型δ－内毒素蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及高活性嵌合型δ-内毒素的发现。通过将Cry1Ea蛋白的多肽结构域(530-587位)用Cry1Ca的多肽结构域(533-602位)进行替换从而在策略上设计出长度为641个氨基酸残基的新型δ-内毒素(此处称为嵌合型Cry1E)。在这种方式中，嵌合型毒素含有Cry1Ea的氨基酸残基1-529、Cry1Ca的氨基酸残基530-599和Cry1Ea的氨基酸残基600-616。25个氨基酸残基的新的多肽作为δ-内毒素的C-末端而包括在其中。换句话说就是该多肽构成了嵌合型毒素的氨基酸残基617-641。通过将Cry1Ea的不同部分用在策略上设计出的氨基酸序列或者其他毒素的部分进行替换可以形成几个嵌合型毒素。在理论上设计出1.99kb的核苷酸序列以编码上面提及的嵌合型δ-内毒素。设计出编码毒素蛋白的基因(此处称为cry1E)以便通过引入植物首选的密码子来获得植物中的高水平表达。每个氨基酸的植物首选的密码子均匀地分布以促进有效的翻译。在5’-末端引入适合于植物中的基因表达的翻译起始邻近序列(TAAACCATGGCT)，并在嵌合型毒素的读码框的末端引入两个翻译终止密码子(信号)。将总共33个唯一的限制位点以40-80bp的间距均匀地引入基因的全部长度之中。在基因的上游创建BamHI和HindIII限制位点，并在基因的下游创建BamHI和EcoRI限制位点，以便使得其克隆变得容易。(请参考图2)。
翻译起始邻近序列自动在基因的紧靠着起始的地方形成NcoI位点。将基因分成58个重叠的寡核苷酸(长度为40-65个核苷酸)，它们相互之间有长度为6-26个碱基的间隙(请参考

图1)。每个寡核苷酸具有长度为13-18个核苷酸的重叠，并且其紧邻的寡核苷酸位于互补链上。设计互补的重叠以保持Tm值位于48-50℃。在DNA合成仪(GeneAssembler Special，Pharmacia，瑞典)上以200nmole的规模合成寡核苷酸，并在变性尿素-PAGE上进行纯化。依照Singh等人(1996)的无连接基因合成方法将所有58个寡核苷酸装配成1.99kb的双链DNA(此处称为嵌合型cry1E基因)，这显示在图1中。用HindIII和EcoRI限制性内切酶消化该DNA，并克隆进pBluescriptII SK(+)(Stratagene，La Jolla，CA)中。将该质粒命名为pPK200。合成DNA的核苷酸序列通过在自动DNA测序系统(Applied Biosystems 373A型)上对克隆得到的合成DNA进行测序而加以确认。
还构建了盒(cassette)以用于在T71ac启动子的控制下于大肠杆菌中表达嵌合型毒素。用限制性内切酶NcoI和BamHI消化质粒pPK200，并克隆进表达载体pET-19b(Novagen，Madison WI)中。将该质粒命名为pPK206。通过聚合酶链反应扩增编码Cry1Ca和Cry1Ea毒素的DNA，其使用能够在扩增子的上游和下游形成NcoI和BamHI限制位点的合适的引物。将扩增出的产物克隆进pET-19b载体中。将具有编码Cry1Ca和Cry1Ea毒素的DNA的构建体分别命名为pPK135和pPK141。用构建体pPK206、pPK135和pPK141转化大肠杆菌BL21DE3菌株。(请参考图3)。通过用合适浓度的IPTG进行诱导而表达毒素蛋白。表达于15℃进行以避免可能的错误折叠。用溶菌酶裂解大肠杆菌细胞，并进行超声处理，以释放出δ-内毒素。在包含体中发现有毒素蛋白。将这些包含体于28℃溶解在50mM的碳酸氢盐缓冲液(pH9.5)中。毒素蛋白通过光密度测定方法进行定量。将系列稀释的毒素混合入半合成饲料中，并将混合物倒入培养皿中。总大肠杆菌蛋白质用作对照饲料。将15条斜纹灰翅夜蛾的新生幼虫释放到置于100-ml烧杯中的饼状饲料混合物之上，并用薄纱织物覆盖杯口以允许空气交换。每个实验重复进行六次。每隔一天之后更换一次饲料。生物测定以16/8小时的光周期于25±0.2℃进行。在饲养7天之后记录毒性数据。EC50通过标准的log-概率值分析来测定。全部三种蛋白质同时进行测定。具有代表性的结果显示于下面的表1中。 表1δ-内毒素(S)EC50(μg/ml半合成饲料) Cry1Ea ＞108 Cry1Ca 29.48±1.77 嵌合型Cry1E 6.27±0.59 结果显示了表达嵌合型毒素的大肠杆菌菌株具有超过Cry1Ea蛋白几倍的毒性，和具有超过Cry1Ca蛋白4倍以上的毒性。Cry1Ea毒素蛋白不能对灰翅夜蛾幼虫产生任何影响。结果表明成功地改造了Cry1Ea毒素而形成新型蛋白质即嵌合型Cry1E，其具有生物活性，并且为经改良的毒素。经改造的蛋白质具有比Cry1Ca蛋白高4倍的毒性，Cry1Ca蛋白是最众所周知的抗灰翅夜蛾属物种的δ-内毒素。
还将全部三种δ-内毒素进行抗实夜蛾属物种的72小时大小的幼虫的测试。将每只幼虫释放在置于分离的盒中的饲料上。用每种浓度的毒素测试40只幼虫。毒性结果显示出嵌合型毒素对于实夜蛾也具有毒性。具有代表性的结果显示于下面的表2中。
表2δ-内毒素(S) EC50(μg/ml半合成饲料)Cry1Ea ＞176Cry1Ca 136.22±8.77嵌合型Cry1E 26.71±1.39 在此处使用时，“毒素”表示对于杀昆虫害虫的活性起着重要作用的N-末端部分。本领域熟练技术人员能够通过添加同源或异源δ-内毒素的部分或完整C-末端片段而将该毒素转化为前毒素。这种前毒素将会是在微生物细胞(例如大肠杆菌、假单胞菌(Pseudomonas)等等)中非常稳定的分子，并可以用于形成微生物配剂。这种配剂可以用作杀虫剂。用由我们开发出的新型毒素来形成这种前毒素和配剂也在我们所要求保护的发明的范围之内。
根据本发明有用的基因和毒素不仅包括长度为641氨基酸的毒素，而且包括所述新的序列的片段、变体和突变体，它们保持了此处特别地举例说明的毒素的特征性杀虫活性。在此处使用时，术语基因的“变体”或“变异体”是指编码同样的毒素或编码具有较低或相等杀虫活性的毒素的核苷酸序列。在此处使用时，术语“相等的杀虫活性”是指具有与所要求保护的毒素具有类似的或基本上同样的抗目标害虫生物活性的毒素。
本领域经训练的技术人员可以很容易地创建出另外的编码同样或基本同样的毒素的DNA序列。这些变体DNA序列在本发明的范围之内。在此处使用时，“基本上同样的”序列是指具有氨基酸的替换、缺失、添加或插入但没有实质性地影响杀虫活性的序列。保持了杀虫活性的片段也包括在此定义之内。
本发明的新型嵌合型毒素已经在此处特别地进行了举例说明。应当显而易见的是，本发明包括具有与举例说明的毒素同样或类似的杀虫活性的变体或者相当的毒素(和编码相当的毒素的核苷酸序列)。相当的毒素会与举例说明的毒素具有氨基酸同源性。这一氨基酸同源性通常会高于75％，优选高于90％，最优选高于95％。这一氨基酸同源性在毒素的关键性区域中是最高的，这些关键性区域造成了生物活性的出现，或者参与了三维构型的决定，这种三维构型最终对于生物活性起着重要作用。在这一点上，某些氨基酸替换是可接受的和可以希望的，如果这些替换位于对于生物活性来说不是关键性的区域之中，或者这些替换是不影响分子的三维构型的保守氨基酸替换。例如，氨基酸可以分为下列类别非极性的、无电荷的极性的、碱性的和酸性的。将一个类别的一个氨基酸用同一类别的另一个氨基酸进行替换的保守替换在本发明的范围之内，只要该替换不实质性地改变δ-内毒素的生物活性。下面给出的表3提供了属于每个类别的氨基酸的例子的列表。
表3氨基酸的类别氨基酸的例子非极性的Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trp无电荷的极性的Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln酸性的Asp、Glu碱性的Lys、Arg、His 在一些情况下，也可以进行非保守的替换。关键性的因素是这些替换一定不能显著地降低毒素的生物活性。在蛋白质工程领域经训练的技术人员的能力之内，可以用丙氨酸替换嵌合型毒素的任何氨基酸。任何氨基酸的这种替换是最安全的，因为丙氨酸是常见的氨基酸。这种替换也正好位于本发明的范围之内。
可以将编码本发明的嵌合型毒素的基因导入很多种微生物或植物宿主中。毒素基因的表达直接或间接地导致在细胞内产生和维持杀虫嵌合型毒素。使用合适的微生物宿主例如假单胞菌可以将微生物施用于害虫增殖的地点。这将会导致控制住害虫。可选择地，含有毒素基因的微生物可以在延长毒素的活性和稳定细胞的条件下进行处理。然后可以将保持了毒性活性的经处理的细胞施用于目标害虫的环境中。当将编码嵌合型毒素的基因通过合适的载体导入微生物宿主中，并将该宿主以有生命状态施用于环境中时，必要的是使用某些宿主微生物。选择那些已知占据了一种或多种目标农作物的“植物圈”(叶面、叶圈、根际和/或根面)的微生物。选择这些微生物以致能够成功地在特殊环境(农作物和其他昆虫生活环境)中与野生型微生物进行竞争，从而能够稳定地维持和表达表达多肽杀虫剂的基因，和按希望能够更好地保护杀虫剂不受环境降解和失活的影响。
已知大量的微生物存在于很多种重要农作物的叶面(植物叶片的表面)和/或根际(围绕植物根的土壤)。这些微生物包括细菌、藻类和真菌。其中特别感兴趣的微生物例如为细菌，如假单胞菌属(Pseudomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、根瘤菌属(Rhizobium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、嗜甲基菌属(Methylophilius)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、醋杆菌属(Acetobacter)、乳杆菌属(Lactobacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azotoba cter)、明串珠菌属(Leuconostoc)和产碱菌属(Alcaligenes)；真菌，特别是酵母，如酵母属(Saccharomyces)、隐球酵母属(Cryptococcus)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、红酵母属(Rhodotorula)和短梗霉属(Aureobasidium)。其中特别感兴趣的是那些植物圈的细菌物种，如丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、木醋杆菌(Acetobacter xylinum)、根瘤土壤杆菌(Agrobactetiumtumefaciens)、类球红假单胞菌(Rhodopseudomonas spheroids)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、苜蓿根瘤菌(Rhozobiummelioti)、真养产碱菌(Alcaligenes entrophus)和棕色固氮菌(Azotobacter vinlandii)；和那些植物圈的酵母物种，如深红酵母(Rhodotorula rubra)、黏红酵母(R.glutinis)、海滨红酵母(R.marina)、橙黄红酵母(R.aurantiaca)、浅白隐球酵母(Cryptococcusalbidus)、流散隐球酵母(C.diffluens)、罗伦隐球酵母(C.laurentii)、罗斯酵母(Saccharomyces rosei)、普地酵母(S.pretoriensis)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、掷孢酵母(Sporobolomycesroseus)、香气掷孢酵母(S.odorus)、佛地克鲁维酵母(Kluyveromycesveronae)和出芽短梗霉(Aureobasidium pollulans)。其中特别感兴趣的是有颜色的微生物。有很多种方法可用于在这样的情况下将编码嵌合型毒素的基因导入微生物宿主之中，即这种情况使得能够稳定地维持和表达该基因。这些方法对于本领域的熟练技术人员来说是熟知的，并描述于例如U.S.Pat.No.5,135,867之中，此处引用作为参考。
构建植物转化载体以形成转基因植物。将质粒pPK58(含有具有双重增强子的CaMV35S启动子)用BamHI和HindIII进行消化，并将质粒pPK200用HindIII和EcoRI进行消化，以便分别切出具有双重增强子的CaMV35S启动子和嵌合型cr1E基因。施行三重连接以便将这两个片段克隆进pLITMUS38克隆载体(New England Biolabs)中。该质粒即pPK59在嵌合基因的上游含有具有双重增强子的CaMV35S启动子。pPK59的限制性内切酶酶切分析显示在图2中。在嵌合基因的下游克隆了nos转录终止子。扩增nos聚腺苷酸化元件的DNA，这是使用pBI101.1作为模板并使用能够分别在上游和下游形成MfeI和EcoRI限制位点的合适的引物来进行的。用EcoRI消化质粒pPK59，并在用MfeI和EcoRI限制性内切酶消化之后克隆PCR产物。挑选出这样的克隆并命名为pPK201，即在该克隆中合成基因的EcoRI限制位点与nos终止子的MfeI位点相连(因为它们具有匹配末端)。通过限制性内切酶酶切分析还可以通过测序来确认nos终止子的正确方向。将表达盒(具有E-35S启动子和nos终止子的合成的cry基因)克隆进Ti二元载体中。将质粒pPK201的BamHI-EcoRI片段克隆进pBI101.1中以替换pBI101.1的BamHI-EcoRI片段(uidA基因和nos终止子)。将该二元载体命名为pPK202。大肠杆菌和植物表达载体的图谱显示在图3中。
为了研究嵌合型Cry1E毒素在植物中的效能，选择烟草用于表达。根据由Cangelosi等人(1991)所讨论的“土壤杆菌的电穿孔”的修改方案，用二元载体pPK202转化含有辅助质粒pAL4404的根瘤土壤杆菌菌株LBA 4404，并将经转化的菌落对于抗生素链霉素、利福平和卡那霉素进行选择。根据Horsch等人(1985)的方法进行土壤杆菌介导的烟草栽培品种Patit Havana(Nicotiana tobacum cv.Patit Havana)的转化，并将转基因植物对于抗生素卡那霉素进行选择。编码嵌合型毒素的基因的存在通过PCR和Southern分析来确认，转基因的表达通过RT-PCR、Western分析和ELISA来加以确定。ELISA结果显示出，在选择出的转基因品系中，在总溶解叶蛋白质之中毒素蛋白有0.5％的表达。该高水平的表达是设计了在其中专门使用植物首选密码子的基因的结果。在该研究中使用的植物首选翻译起始邻近序列也会在获得增强的表达中起重要的作用。
使用两个月大小的转基因植物和斜纹灰翅夜蛾的1龄与5龄幼虫来施行昆虫生物测定。(请参考图4-6)。将15cm2的转基因植物和对照植物的叶片圆盘置于在底部含有弄湿的纸的圆柱形盒子之中，然后在它们上面释放10条1龄幼虫。盒口用湿的薄纱织物覆盖以保持足够的湿度和空气交换。于25±0.2℃重复三次进行毒性实验，并保持16/8小时的光周期。在使用5龄幼虫的生物测定中，使用完整的转基因植物和对照植物的叶片。将叶柄置于位于含有MS盐溶液的250ml烧瓶上方的棉花塞之中，以克服叶片的萎蔫。在每个叶片上允许饲养5条昆虫幼虫。对照植物的叶片每8小时之后进行更换，它们被昆虫幼虫完全吃光了。
结果(图4和6)表明，1龄以及5龄幼虫在48-72小时之内死亡。被1龄幼虫吃掉的叶片的数量与被狼吞虎咽地吃掉的对照植物叶片圆盘相比是可以忽略的。摄取大约1cm2的转基因叶片就足够杀死5龄幼虫。这些幼虫在转基因叶片上饲养8-16小时之后显现出濒死的状态，并最后在2-3天之内死亡。在叶片表面上观察到具有高水份含量的绿色排泄物。一些幼虫在死亡之前显示出严重的体重损失。在一个分开的实验中，让不同龄期的幼虫在转基因植物的叶片上饲养1小时、2小时、4小时、8小时和16小时，然后将它们转移至对照植物叶片上。观察到在转基因植物上饲养8小时足够引起处于所有发育阶段的幼虫的100％死亡率，甚至是在非转基因植物上饲养之后。年幼的幼虫摄取非常少量的毒素，这将它们的蛹化从15天的正常幼虫周期延迟了10-15天。少数逃脱死亡的幼虫发育成蛾。40％的使用这种蛾的配对交配得到了卵。可是，这些卵是不育的和不能孵化。从转基因烟草植物中提取总溶解蛋白质，并上载至Sepharose Q离子交换柱上。用梯度增加的氯化钠洗脱下蛋白质，汇集含有δ-内毒素的峰，并在G10柱上进行脱盐。将洗脱下的蛋白质混合入半合成饲料中。也进行类似的从非转基因烟草植物的叶片中的蛋白质提取和纯化，并将这种植物蛋白质用作对照。依照前面的讨论施行毒性实验。对于斜纹灰翅夜蛾和棉铃虫的EC50为37ng/ml人工饲料和285ng/ml人工饲料。结果再次确认了嵌合型δ-内毒素对于目标昆虫害虫的效能。
用于控制昆虫害虫的新型δ-内毒素和用于该新型δ-内毒素在植物中高水平表达的基因，这包括下列步骤在理论上设计一种新型δ-内毒素(此处称为嵌合型Cry1E)，这是通过将Cry1Ea蛋白的多肽结构域(530-587位)用Cry1Ca的多肽结构域(533-602位)进行替换，并在蛋白质的C-末端加入新的长度为25个氨基酸残基的多肽以增加稳定性，从而设计出来的；在理论上设计出用于在植物中以高水平表达嵌合型δ-内毒素的基因；设计并化学合成代表了理论上设计出的基因的寡核苷酸；将寡核苷酸装配成双链DNA，克隆，并对于克隆得到的合成DNA进行序列分析；构建用于在大肠杆菌和植物中表达嵌合基因的载体；在大肠杆菌中表达合成基因；比较嵌合蛋白与亲本蛋白抗斜纹灰翅夜蛾的毒性；用嵌合基因转化植物如烟草；在转基因植物中高水平表达经改造的蛋白质；和评价嵌合型毒素在转基因植物中抗斜纹灰翅夜蛾的保护能力。
在本发明的另一个实施方案中，涉及Cry1Ea的氨基酸1-529、Cry1Ca的氨基酸530-599、Cry1Ea的氨基酸600-616和新型多肽的氨基酸617-641，以及其在结构上和/或在功能上相当的变体或其片段。
在本发明的另一个实施方案中，所述毒素具有SEQ ID No.1中显示的氨基酸序列；并且显示出比亲本毒素Cry1Ea和Cry1Ca高几倍的对于目标鳞翅目昆虫的毒性。
在本发明的另一个实施方案中，编码具有抗鳞翅目昆虫活性的嵌合型毒素的嵌合型cry1E基因具有SEQ ID No.2中显示的核苷酸序列或其片段。
在本发明的另一个实施方案中，使用该蛋白质控制鳞翅目害虫的方法使用有效剂量的就这样应用的毒素，或者使用有效剂量的作为化学或微生物配剂的组分进行应用的毒素。
在本发明的另一个实施方案中，重组DNA转移载体含有编码具有抗鳞翅目昆虫活性的毒素的多核苷酸序列，其中该多核苷酸序列具有SEQID No.2的核苷酸序列或其片段。
在本发明的另一个实施方案中，用该基因转化重组宿主。
在本发明的另一个实施方案中，所述宿主为微生物，例如大肠杆菌、假单胞菌、酵母、蓝细菌和/或其他微生物。
在本发明的另一个实施方案中，所述的经转化的宿主为表达毒素的植物，例如烟草、棉花、鹰嘴豆、pegeonpea、花生、花椰菜、甘蓝、红辣椒、辣椒和/或其他植物，其中该毒素具有SEQ ID No.1的氨基酸序列，或者其具有相等的抗鳞翅目昆虫活性的变体。
在本发明的进一步的实施方案中，本申请清楚地表明，在蛋白质中更特别是在内毒素的领域中，没有发现序列的高度同源性能够造成任何显著的活性上的差异。上面提及的内毒素Cry1Aal至Cry1Aa6的例子清楚地反映了本工作的本质。在本申请中，申请者观察到了特别高的杀虫活性。此外，也发现在本申请的嵌合蛋白Cry1E的序列中的70％及以上同源性没有显示出活性上的显著变化。这意味着与嵌合蛋白Cry1E具有70％及以上序列同源性的蛋白质可用作杀虫剂。
下面的实施例是作为举例说明而给出的，因此不应当将它们解释为限制了本发明的范围。
实施例1 在大肠杆菌中表达的新型嵌合型Cry1E对于鳞翅目昆虫害虫的幼虫的相当的毒性 通过将Cry1Ea蛋白的多肽结构域(530-587位)用Cry1Ca的多肽结构域(533-602位)进行替换从而在策略上设计出长度为616个氨基酸残基的嵌合型δ-内毒素(此处称为嵌合型Cry1E)。如前所述在C-末端附加地包含有25个氨基酸残基的多肽。在理论上设计出1.99kb的核苷酸序列以编码上面提及的嵌合型δ-内毒素。每个氨基酸的密码子均匀地分布以避免在翻译期间暂时的tRNA缺乏。在所设计的基因中形成几个6碱基切割体限制性内切酶酶切位点。在所设计的基因的5’-末端形成BamHI、HindIII和NcoI限制位点，和在3’-末端形成EcoRI限制位点。将基因分成58个重叠的寡核苷酸(长度为40-65个核苷酸)。每个寡核苷酸具有长度为13-18个核苷酸的重叠，其紧邻的寡核苷酸位于互补链上(Tm位于48-50℃)。在DNA合成仪(Gene Assembler Special，Pharmacia，瑞典)上以200nmole的规模合成寡核苷酸，并在变性尿素-PAGE上进行纯化。依照Singh等人(1996)的无连接基因合成方法将所有58个寡核苷酸装配成双链DNA(此处称为嵌合型cry1E基因)，这显示在图1中。用HindIII和EcoRI限制性内切酶消化该DNA，并克隆进pBluescriptII SK(+)(Stratagene)中。将该质粒命名为pPK200。合成DNA的核苷酸序列通过在自动DNA测序系统(Applied Biosystems373型)上对克隆得到的合成DNA进行测序而加以确认。
还构建了盒以用于在T7启动子的控制下于大肠杆菌中表达嵌合型毒素。为此，用限制性内切酶NcoI和BamHI消化质粒pPK200，并克隆进表达载体pET-19b(Novagen)中。将该质粒命名为pPK206。通过聚合酶链反应扩增编码Cry1Ea和Cry1Ca的毒素部分的DNA，其使用分别在两个DNA中能够在扩增子的上游和下游形成NcoI和BamHI限制位点的合适的引物。将扩增出的产物于NcoI和BamHI位点克隆进同一载体(pET-19b)中。如前所述将具有Cry1Ea毒素DNA的构建体命名为pPK141，和将具有Cry1Ca毒素DNA的构建体命名为pPK135。用构建体pPK141、pPK135和pPK206转化大肠杆菌BL21DE3菌株。通过用合适浓度的IPTG进行诱导而表达毒素蛋白。表达于15℃进行以避免任何可能的毒素的错误折叠。毒素蛋白在变性聚丙烯酰胺凝胶上通过光密度测定方法进行定量。将系列稀释的毒素混合入半合成饲料中。总大肠杆菌蛋白质用作饲料中的对照。将15条斜纹灰翅夜蛾的新生幼虫释放到置于100-ml烧杯中的饼状饲料混合物之上，并用薄纱织物覆盖杯口以允许空气交换。每个实验重复进行六次。每隔一天之后更换一次饲料。生物测定以16/8小时的光周期于25±0.2℃进行。在饲养7天之后记录毒性数据。EC50通过标准的log-概率值分析来测定。全部三种蛋白质同时进行测定。具有代表性的结果显示于下面给出的表4中。
表4δ-内毒素(S) EC50(μg/ml半合成饲料)Cry1Ea ＞108Cry1Ca 29.48±1.77嵌合型Cry1E 6.27±0.59 结果显示了嵌合型毒素具有超过Cry1Ea蛋白几倍的毒性，和具有超过Cry1Ca蛋白4倍的毒性。Cry1Ea毒素蛋白不能引起任何灰翅夜蛾幼虫的死亡或生长阻滞。结果表明成功地改造了Cry1Ea毒素而将其转变为具有生物活性并得到改善的毒素。经改造的蛋白质具有比Cry1Ca蛋白更高的毒性，Cry1Ca蛋白是最众所周知的抗灰翅夜蛾属物种的δ-内毒素。
用棉铃虫的幼虫来施行类似的毒性实验。在这种情况下，将72小时大小的幼虫释放在含有三种蛋白质中的一种的半合成饲料上，并且每个盒中只释放1条幼虫。在饲养7天之后记录体重损失。具有代表性的结果显示于下面的表5中。表5 δ-内毒素(S) EC50(μg/ml半合成饲料) Cry1Ea ＞176 Cry1Ca 136.22±8.77 嵌合型Cry1E 26.71±1.39 结果表明，由我们设计的新型嵌合型δ-内毒素不仅对于灰翅夜蛾更具有毒性，而且抗实夜蛾也是有效的。该设计已经扩大了毒素的宿主范围，以及以相当大的程度将毒性增强至超过亲本蛋白。
实施例2 表达新型嵌合型Cry1E蛋白的转基因植物的高度幼虫毒性 为了确认新型嵌合型毒素在植物中的效能，构建一个植物转化载体以用于形成转基因植物。将质粒pPK58(含有具有双重增强子的CaMV35S启动子)用BamHI和HindIII进行消化，并将质粒pPK200用HindIII和EcoRI进行消化，以便分别切出具有双重增强子的CaMV35S启动子和嵌合型cry1E基因。施行三重连接以便将这两个片段克隆进pLITMUS38克隆载体(New England Biolabs)中。将该质粒命名为pPK59，其在嵌合基因的上游含有具有双重增强子的CaMV35S启动子。在嵌合基因的下游克隆了nos转录终止子。扩增nos聚腺苷酸化元件，这是使用pBI101.1作为模板并使用能够分别在上游和下游形成MfeI和EcoRI限制位点的合适的引物来进行的。用EcoRI消化质粒pPK59，并在用MfeI和EcoRI限制性内切酶消化之后克隆PCR产物。挑选出这样的克隆并命名为pPK201，即在该克隆中合成基因的EcoRI限制位点与nos终止子的MfeI位点相连(因为它们具有匹配末端)。通过限制性内切酶酶切分析还可以通过DNA测序来确认nos终止子的正确方向。将表达盒(具有E-35S启动子和nos终止子的合成的cry基因)克隆进Ti二元载体中。将质粒pPK201的BamHI-EcoRI片段克隆进pBI101.1中以替换pBI101.1的BamHI-EcoRI片段(uidA基因和nos终止子)。将该二元载体命名为pPK202。大肠杆菌和植物表达载体的构建示意性地显示在图3中。该构建体具有多核苷酸序列TAAACCATG GCT作为植物首选的翻译起始邻近序列，在合成基因中导入TAA TGA用于翻译终止。根据由Cangelosi等人(1991)所讨论的“土壤杆菌的电穿孔”的修改方案，用二元载体pPK202转化含有辅助质粒pAL4404的根瘤土壤杆菌菌株LBA4404，并将经转化的菌落对于抗生素链霉素、利福平和卡那霉素进行选择。根据Horsch等人(1985)的方法进行土壤杆菌介导的烟草栽培品种Patit Havana(Nicotiana tobacum cv.Patit Havana)的转化，并将转基因植物对于抗生素卡那霉素进行选择。编码嵌合型毒素的基因的存在通过PCR和Southern分析来确认，转基因的表达通过RT-PCR、Western分析和ELISA来加以确定。ELISA结果显示出，在选择来用于这些实验的转基因品系中，在总溶解叶蛋白质之中毒素蛋白有0.5％的表达。该高水平的表达是设计了在其中专门使用植物首选密码子的基因的结果。植物首选的翻译起始邻近序列也会在表达中起重要的作用。使用两个月大小的转基因植物和斜纹灰翅夜蛾的新生幼虫来施行昆虫生物测定。将15cm2的转基因植物和对照植物的叶片圆盘置于在底部含有弄湿的纸的圆柱形盒子之中，然后在它们上面释放10条1龄幼虫。盒口用湿的薄纱织物覆盖以保持足够的湿度和允许空气交换。于25±0.2℃重复六次进行毒性实验，并保持16/8小时的光周期。结果(图4)显示出表达新型嵌合蛋白的转基因植物对于斜纹灰翅夜蛾的新生幼虫具有高度的毒性，其在饲养48小时之内引起100％的死亡率。昆虫幼虫对于叶片圆盘所造成的损害与被几乎完全吃光的对照植物叶片圆盘相比是可以忽略的。转基因植物的高水平的保护以及由于在转基因植物上进行饲养而造成的灰翅夜蛾幼虫的死亡再次证明了嵌合型毒素和转基因植物的效能。
实施例3 嵌合型Cry1E蛋白对于灰翅夜蛾物种处于所有发育阶段的幼虫的高毒性 对于1龄(3天大小)、3龄(7天大小)和5龄(12天大小)幼虫进行生物测定以确定在转基因植物中表达的经改造的蛋白质的效能。用1龄幼虫所进行的生物测定已经在实施例2中进行了讨论。使用完整的转基因植物和对照植物的叶片来饲养高级阶段的幼虫。将叶柄置于位于含有MS盐溶液的250ml烧瓶上方的棉花塞之中，以克服叶片的萎蔫。在每个叶片上允许饲养5条昆虫幼虫。饲养3龄(图5)和5龄(图6)幼虫的对照植物的叶片分别在16小时和8小时之后进行更换，因为它们被昆虫幼虫完全吃光了。结果表明，在转基因叶片上饲养引起处于所有发育阶段的幼虫在48小时之内死亡。摄取大约1cm2的转基因叶片就足够杀死5龄幼虫。这些幼虫在转基因叶片上饲养8-16小时之后显现出濒死的状态，并最后在2天之内死亡。在叶片表面上观察到具有高水份含量的绿色排泄物。一些幼虫在死亡之前显示出严重的体重损失。
在一个分开的实验中，让不同龄期的幼虫在转基因植物的叶片上饲养1小时、2小时、4小时、8小时和16小时，然后将它们转移至对照植物叶片上。观察到在转基因植物上饲养4小时足够引起处于所有发育阶段的幼虫的100％死亡率，甚至是当它们随后在非转基因植物上进行饲养。年幼的幼虫摄取非常少量的毒素，这会超过15天的正常幼虫周期而将它们的蛹化延迟10-15天。少数逃脱死亡的幼虫发育成蛾。40％的使用这种蛾的配对交配得到了卵。可是，这些卵是不育的和不能孵化。至今还没有在文献中报道δ-内毒素对于高级阶段的昆虫幼虫的毒性。高水平的毒性可能是由于嵌合型毒素在昆虫幼虫中肠中的更高的稳定性，或者是由于改善了的δ-内毒素的受体结合能力和成孔能力。该实施例再次表明嵌合型毒素抗灰翅夜蛾物种的能力。因为实夜蛾不喜欢吃烟草叶，所以不能对实夜蛾进行使用转基因烟草植物的毒性实验。
实施例4 从表达δ-内毒素的转基因烟草植物的叶中制备得到的新型嵌合型Cry1E蛋白的高毒性 从转基因烟草的叶中制备总溶解蛋白质。将新鲜的叶组织在液氮条件下磨成粉，然后悬浮在5倍体积的蛋白质提取缓冲液(Tris Cl，20mM，pH9.5；EDTA 2mM，pH8.0；NaCl，50mM；DTT，1mM；PVP2％和PMSF，100mM)中。将该悬浮液充分混合，并离心两次(20,000×g，20分钟和4℃)。将上清液上载至Sepharose Q柱(10cm×2.5cm)上。用在提取缓冲液中的梯度增加的NaCl洗脱下蛋白质，并收集100个5ml的级分。用ELISA检测δ-内毒素。汇集含有δ-内毒素的级分。将已知数量的从植物中纯化出的δ-内毒素混合入半合成饲料中。如前面实施例的描述，用3天大小的斜纹灰翅夜蛾和棉铃虫的幼虫进行毒性试验。结果显示出，对于灰翅夜蛾和实夜蛾的EC50(对于50％的致死率所需的浓度)为42.39±1.72ng/ml半合成饲料和283.11±8.29ng/ml半合成饲料。该结果进一步证明了对于灰翅夜蛾和实夜蛾的幼虫的高水平毒性。值得注意的一点是，在植物组织中制造出的杀虫晶体蛋白比在大肠杆菌中制造出的同样的蛋白质更具有毒性。可能是δ-内毒素在植物细胞质中折叠得更好，不能否认一些未鉴定的侣伴蛋白在这种折叠中的作用。
实施例5 嵌合型δ-内毒素在植物组织中的稳定性 如前面所讨论的，提取转基因植物的总溶解叶蛋白质，并于4℃和28℃进行温育。将它们用于毒性试验。在前者的情况下每2天取出样品，在后者的情况下每天取出样品。将总的粗制蛋白质混合入半合成饲料中，并用斜纹灰翅夜蛾的新生幼虫进行毒性实验。在饲养7天之后记录昆虫死亡率数据，并计算LC50。结果显示在下面的表6和表7中。表6 S.No 粗制蛋白质在4℃的温育时间(天) LD50(ng/ml半合成饲料) 1. 2 48.71±2.4 2. 4 57.87±2.96 3. 6 66.44±3.65 4. 8 70.19±3.55 5. 12 73.82±3.1 6. 16 74.37±3.67 表7 S.No粗制蛋白质在28℃的温育时间(天) LD50(ng/ml半合成饲料) 1.1 76.44±3.3 2.2 98.13±4.6 3.3 143.46±8.5 4.4 --- 5.5 --- 结果证实了由我们所设计的嵌合型δ-内毒素抗植物蛋白酶的稳定性。嵌合型毒素在4℃温育多于16天是稳定的，在28℃温育3天是稳定的，并引起超过80％的死亡率。LC50随着时间的增加大概是由于毒素有一些降解。
本发明的主要优点为 1.改造Cry1Eaδ-内毒素以获得新型嵌合型毒素，此处称为嵌合型Cry1E。嵌合蛋白的毒性比亲本毒素或其他据报道具有抗灰翅夜蛾的功能的δ-内毒素高几倍。当该嵌合蛋白在植物中形成时，其杀幼虫活性是非常高的。
2.设计编码嵌合型毒素的基因以便在大肠杆菌和植物中表达。因此，其可以用于改造微生物以表达嵌合型毒素，该嵌合型毒素可以用于制备微生物配剂。同样的基因还可以用于遗传工程改造植物以获得昆虫抗性。我们已经表明了，我们所设计的序列造成嵌合型毒素在转基因烟草和棉花叶(此处未包括结果)中的非常高水平的表达(总溶解蛋白质的0.5％)。
3.表达嵌合型毒素的转基因植物具有非常高度的抗处于所有发育阶段的斜纹灰翅夜蛾幼虫的保护。它们在于转基因植物上饲养2-3天之内死亡。至今还没有报道这种转基因植物抗任何鳞翅目昆虫的高水平毒性。该蛋白质还可能有效地抗许多其他的昆虫幼虫。我们的结果表明该毒素对于抗实夜蛾也是有效的。
4.通过在转基因植物上进行短期的饲养进一步证实了嵌合型毒素在转基因植物中的效能。饲养4小时引起处于所有发育阶段的灰翅夜蛾幼虫的100％死亡率。饲养非常短的时间(1小时以内)延缓了幼虫的发育和干扰了变态。这种蛋白质可能在保护农业经济上重要的农作物和森林中非常有价值。编码嵌合型毒素的基因可以用于形成转基因植物和/或在微生物中产生可用于微生物配剂的毒素。
5.因为表达新型嵌合型毒素的转基因植物引起灰翅夜蛾幼虫在非常短时间的饲养中的100％死亡率，所以昆虫形成抗该δ-内毒素的抗性的可能性将会是非常低的。
SEQ ID No.1的信息
1.序列特征
A长度 641
B类型 氨基酸
C拓扑学 线性
D分子类型 蛋白质
2.序列描述SEQ ID No.1
1 M A I V N N Q N Q C V P Y N C L N N P E N E I L D I E R S N
31 S T V A T N I A L E I S R L L A S A T P I G G I L L G L F D
61 A I W G S I G P S Q W D L F L E Q I E L L I D Q K I E E F A
91 R N Q A I S R L E G I S S L Y G I Y T E A F R E W E A D P T
121 N P A L K E E M R T Q F N D M N S I L V T A I P L F S V Q N
151 Y Q V P F L S V Y V Q A A N L H L S V L R D V S V F G Q A W
181 G F D I A T I N S R Y N D L T R L I P I Y T D Y A V R W Y N
211 T G L D R L P R T G G L R N W A R F N Q F R R E L T I S V L
241 D I I S F F R N Y D S R L Y P I P T S S Q L T R E V Y T D P
271 V I N I T D Y R V G P S F E N I E N S A I R S P H L M D F L
301 N N L T I D T D L I R G V H Y W A G H R V T S H F T G S S Q
331 V I T T P Q Y G I T A N A E P R R T I A P S T F P G L N L F
361 Y R T L S N P F F R R S E N I T P T L G I N V V Q G V G F I
391 Q P N N A E V L Y R S R G T V D S L N E L P I D G E N S L V
421 G Y S H R L S H V T L T R S L Y N T N I T S L P T F V W T H
451 H S A T N T N T I N P D I I T Q I P L V K G F R L G G G T S
481 V I K G P G F T G G D I L R R N T I G E F V S L Q V N I N S
511 P I T Q R Y R L R F R Y A S S R D A R V I V L T G A A S T G
541 V G G Q V S V N M P L Q K T M E I G E N L T S R T F R Y T D
571 F S N P F S F R A N P D I I G I S E Q P L F G A G S I S S G
601 E L Y I D K I E L I L A D A T F K R R R W S V H K A S R P L
631 H L H Q Q A G L A A D
SEQ ID No.2的信息
1.序列特征
A长度 1990bp
B类型 核酸
C标准 双链
D拓扑学 线性
E分子类型 合成的
F来源 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)
G特征 嵌合基因
2.序列描述SEQ ID No.2
10 20 30 40 50
| | | | |
1 CCCGCATGCCCCGGGGGATCCAAGCTTTAAACCATGGCTATCGTTAACAA
GGGCGTACGGGGCCCCCTAGGTTCGAAATTTGGTACCGATAGCAATTGTT
51
CCAGAACCAGTGCGTCCCTTACAATTGCCTCAACAACCCAGAGAACGAGA
GGTCTTGGTCACGCAGGGAATGTTAACGGAGTTGTTGGGTCTCTTGCTCT
101TCTTGGACATCGAAAGATCCAATTCTACCGTGGCCACCAACATTGCTCTT
AGAACCTGTAGCTTTCTAGGTTAAGATGGCACCGGTGGTTGTAACGAGAA
151GAGATTTCCAGATTGCTCGCTAGCGCAACTCCCATTGGTGGCATCCTCCT
CTCTAAAGGTCTAACGAGCGATCGCGTTGAGGGTAACCACCGTAGGAGGA
201
TGGATTGTTCGACGCCATTTGGGGTTCCATCGGACCATCACAATGGGATC
ACCTAACAAGCTGCGGTAAACCCCAAGGTAGCCTGGTAGTGTTACCCTAG
251
TCTTCCTTGAACAGATCGAGTTGCTCATTGACCAGAAGATCGAAGAGTTT
AGAAGGAACTTGTCTAGCTCAACGAGTAACTGGTCTTCTAGCTTCTCAAA
301
GCTAGGAACCAGGCAATTAGCCGTCTCGAGGGGATCTCTTCCCTTTACGG
CGATCCTTGGTCCGTTAATCGGCAGAGCTCCCCTAGAGAAGGGAAATGCC
351
AATCTATACAGAGGCCTTCAGAGAGTGGGAAGCTGACCCTACTAATCCAG
TTAGATATGTCTCCGGAAGTCTCTCACCCTTCGACTGGGATGATTAGGTC
401
CATTGAAGGAAGAGATGCGTACTCAATTCAACGATATGAACTCTATCTTG
GTAACTTCCTTCTCTACGCATGAGTTAAGTTGCTATACTTGAGATAGAAC
451GTCACCGCCATTCCTCTCTTCTCAGTGCAGAACTACCAAGTGCCATTCCT
CAGTGGCGGTAAGGAGAGAAGAGTCACGTCTTGATGGTTCACGGTAAGGA
501CTCCGTCTATGTTCAAGCTGCAAACTTGCACCTTTCTGTCCTTCGCGACG
GAGGCAGATACAAGTTCGACGTTTGAACGTGGAAAGACAGGAAGCGCTGC
551TGTCCGTCTTTGGTCAAGCCTGGGGCTTCGATATCGCTACTATCAACTCC
ACAGGCAGAAACCAGTTCGGACCCCGAAGCTATAGCGATGATAGTTGAGG
601CGTTACAACGACCTCACAAGGTTGATTCCTATCTACACTGACTACGCTGT
GCAATGTTGCTGGAGTGTTCCAACTAAGGATAGATGTGACTGATGCGACA
651
TAGATGGTACAATACTGGGCTTGACAGACTCCCACGTACCGGCGGATTGA
ATCTACCATGTTATGACCCGAACTGTCTGAGGGTGCATGGCCGCCTAACT
701
GGAATTGGGCTCGCTTCAACCAGTTTAGGCGTGAGCTCACCATTAGCGTG
CCTTAACCCGAGCGAAGTTGGTCAAATCCGCACTCGAGTGGTAATCGCAC
751TTGGACATCATTTCCTTCTTCAGAAACTACGACTCTAGACTTTATCCTAT
AACCTGTAGTAAAGGAAGAAGTCTTTGATGCTGAGATCTGAAATAGGATA
801
TCCAACTAGTTCTCAACTCACCAGGGAGGTCTACACCGATCCTGTGATCA
AGGTTGATCAAGAGTTGAGTGGTCCCTCCAGATGTGGCTAGGACACTAGT
851
ACATTACCGACTATCGTGTGGGTCCCTCCTTCGAGAACATTGAAAACAGC
TGTAATGGCTGATAGCACACCCAGGGAGGAAGCTCTTGTAACTTTTGTCG
901GCTATCAGATCTCCACACCTTATGGACTTCCTCAATAACTTGACTATCGA
CGATAGTCTAGAGGTGTGGAATACCTGAAGGAGTTATTGAACTGATAGCT
951
TACAGACCTTATCAGAGGTGTTCACTACTGGGCTGGCCATAGGGTCACCT
ATGTCTGGAATAGTCTCCACAAGTGATGACCCGACCGGTATCCCAGTGGA
1001
CTCACTTTACCGGTAGTTCCCAAGTGATCACAACCCCTCAATACGGAATT
GAGTGAAATGGCCATCAAGGGTTCACTAGTGTTGGGGAGTTATGCCTTAA
1051
ACTGCCAACGCAGAGCCAAGACGTACCATTGCTCCAAGTACCTTTCCCGG
TGACGGTTGCGTCTCGGTTCTGCATGGTAACGAGGTTCATGGAAAGGGCC
1101GTTGAACCTCTTCTACCGCACATTGTCAAATCCATTCTTCAGGAGATCTG
CAACTTGGAGAAGATGGCGTGTAACAGTTTAGGTAAGAAGTCCTCTAGAC
1151
AGAACATCACCCCTACCCTTGGGATCAACGTTGTCCAGGGAGTGGGTTTC
TCTTGTAGTGGGGATGGGAACCCTAGTTGCAACAGGTCCCTCACCCAAAG
1201
ATCCAGCCAAACAATGCTGAGGTGCTCTACAGGTCTAGAGGCACAGTGGA
TAGGTCGGTTTGTTACGACTCCACGAGATGTCCAGATCTCCGTGTCACCT
1251
CTCCTTGAACGAACTTCCAATTGACGGTGAGAACTCACTCGTCGGATACA
GAGGAACTTGCTTGAAGGTTAACTGCCACTCTTGAGTGAGCAGCCTATGT
1301GTCACCGTCTTAGCCACGTTACTTTGACCAGGTCTCTCTATAACACTAAT
CAGTGGCAGAATCGGTGCAATGAAACTGGTCCAGAGAGATATTGTGATTA
1351
ATCACTAGTTTGCCCACCTTCGTGTGGACTCACCACTCAGCCACCAACAC
TAGTGATCAAACGGGTGGAAGCACACCTGAGTGGTGAGTCGGTGGTTGTG
1401
AAACACTATCAATCCCGATATCATTACACAAATCCCCCTTGTCAAGGGCT
TTTGTGATAGTTAGGGCTATAGTAATGTGTTTAGGGGGAACAGTTCCCGA
1451
TCCGCTTGGGTGGAGGGACCTCCGTCATTAAAGGGCCCGGATTCACCGGT
AGGCGAACCCACCTCCCTGGAGGCAGTAATTTCCCGGGCCTAAGTGGCCA
1501
GGCGATATCCTCCGTAGAAACACCATTGGTGAGTTTGTGTCCCTCCAGGT
CCGCTATAGGAGGCATCTTTGTGGTAACCACTCAAACACAGGGAGGTCCA
1551
TAACATTAACTCTCCTATCACACAAAGGTACCGTCTTAGGTTCCGCTACG
ATTGTAATTGAGAGGATAGTGTGTTTCCATGGCAGAATCCAAGGCGATGC
1601
CTTCCTCTAGAGACGCAAGAGTCATTGTGCTTACCGGTGCCGCTTCCACA
GAAGGAGATCTCTGCGTTCTCAGTAACACGAATGGCCACGGCGAAGGTGT
1651
GGAGTCGGTGGCCAAGTCAGCGTTAACATGCCATTGCAAAAGACTATGGA
CCTCAGCCACCGGTTCAGTCGCAATTGTACGGTAACGTTTTCTGATACCT
1701
GATCGGAGAGAACCTCACTAGTAGAACCTTCAGGTATACCGACTTCTCTA
CTAGCCTCTCTTGGAGTGATCATCTTGGAAGTCCATATGGCTGAAGAGAT
1751
ACCCTTTCTCCTTCCGTGCTAACCCAGATATCATTGGCATCAGCGAACAA
TGGGAAAGAGGAAGGCACGATTGGGTCTATAGTAACCGTAGTCGCTTGTT
1801
CCTCTCTTCGGCGCCGGCTCCATCAGCTCTGGTGAACTCTACATCGATAA
GGAGAGAAGCCGCGGCCGAGGTAGTCGAGACCACTTGAGATGTAGCTATT
1851
GATCGAGTTGATCCTTGCTGACGCCACATTCAAGAGGAGACGATGGAGCG
CTAGCTCAACTAGGAACGACTGCGGTGTAAGTTCTCCTCTGCTACCTCGC
1901
TGCACAAAGCCTCACGCCCTCTTCACCTCCACCAACAAGCTGGACTCGCT
ACGTGTTTCGGAGTGCGGGAGAAGTGGAGGTGGTTGTTCGACCTGAGCGA
1951GCTGATTAATGAGAATTCGGATCCAAGCTTGGGCCCGCTC
CGACTAATTACTCTTAAGCCTAGGTTCGAACCCGGGCGAG
权利要求
1.SEQ ID No.1的嵌合型δ-内毒素蛋白Cry1E，和其他在序列上具有75％及以上同源性的蛋白质。
2.权利要求1所述的蛋白质，其中所述SEQ ID No.1的蛋白质的长度为641个氨基酸残基。
3.权利要求1所述的蛋白质，其中所述SEQ ID No.1的嵌合蛋白是从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的δ-内毒素Cry1Ea和Cry1Ca中设计出来的。
4.权利要求2所述的蛋白质，其中所述长度为641个残基的嵌合蛋白的组成如下残基1-529来自内毒素Cry1Ea的相同位置、残基530-599来自Cry1Ca的533-602位、残基600-616来自Cry1Ea的588-604位、残基617-641为合成多肽。
5.权利要求1所述的蛋白质，其中Cry1Ea的530-587的肽结构域可以用任何其他δ-内毒素的进行替换。
6.权利要求2所述的蛋白质，其中最后25个氨基酸残基改善了抵抗植物蛋白酶的稳定性。
7.权利要求1所述的蛋白质，其中所述嵌合蛋白在4-35℃的温度是稳定的。
8.SEQ ID No.2的嵌合体基因。
9.权利要求8所述的嵌合体，其中所述嵌合体编码SEQ ID No.1的嵌合蛋白。
10.权利要求8所述的嵌合体，其中所述嵌合体的长度为1990个碱基对(bp)。
11.权利要求8所述的嵌合体，其中所述嵌合体为1.99kb的双链DNA。
12.权利要求8所述的嵌合体，其中所述嵌合体含有均匀分布的植物首选的密码子以促进有效的翻译。
13.权利要求8所述的嵌合体，其中所述嵌合体在5’-末端含有植物首选的翻译起始密码于ATGGCT。
14.权利要求8所述的嵌合体，其中所述嵌合体含有植物首选的翻译终止密码子TAATGA。
15.权利要求8所述的嵌合体，其中所述嵌合体含有33个限制位点，这些限制位点以大约40-80bp的间距均匀地分布于基因的全部长度之中。
16.权利要求15所述的嵌合体，其中限制位点为选自HindIII、EcoRI和BamHI的酶。
17.权利要求8所述的嵌合体，其中所述嵌合体分成58个长度为40-65bp的重叠的寡核苷酸，它们每个以6-26个碱基对(bp)的间距进行分布。
18.权利要求8所述的嵌合体，其中所述嵌合体含有所述重叠的核苷酸，这些重叠的核苷酸具有13-18个核苷酸的重叠，并且其紧邻的寡核苷酸位于互补链上。
19.权利要求8所述的嵌合体，其中所述嵌合体具有44-55℃的Tm值。
20.在微生物中过表达杀虫嵌合蛋白Cry1E的方法，该方法包括
(a)将编码所述嵌合蛋白的SEQ ID No.2的基因Cry1E克隆进载体中，
(b)用所述克隆载体转化微生物，和
(c)在所述微生物中过表达所述嵌合蛋白。
21.权利要求20所述的方法，其中所述嵌合体在选自细菌、藻类和真菌的微生物中表达。
22.权利要求20所述的方法，其中用于所述克隆的限制性内切酶选自HindIII、EcoRI、Ncol、MfeI和BamHI。
23.权利要求20所述的方法，其中使用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)来诱导所述蛋白质的过表达。
24.权利要求20所述的方法，其中于15℃过表达所述蛋白质以避免所述蛋白质的错误折叠。
25.权利要求20所述的方法，其中所述载体选自质粒、病毒DNA和粘粒。
26.权利要求20所述的方法，其中嵌合体在微生物中的表达通过RT-PCR、Western分析和ELISA来确认。
27.权利要求20所述的方法，其中嵌合体在微生物中的存在通过PCR和Southern分析来确认。
28.用权利要求1的杀虫嵌合蛋白处理受昆虫侵害的植物的方法，该方法包括
(a)将编码嵌合蛋白Cry1E的基因整合入受昆虫侵害的植物中，
(b)将转基因植物暴露于昆虫，和
(c)测定所述转基因植物的杀虫活性。
29.权利要求28所述的方法，其中昆虫害虫选自灰翅夜蛾属物种和实夜蛾属物种。
30.权利要求28所述的方法，其中植物选自烟草、棉花、鹰嘴豆、pegeonpea、花生、花椰菜、甘蓝、红辣椒和辣椒。
31.权利要求28所述的方法，其中用于所述克隆的限制性内切酶选自HindIII、EcoRI、Ncol和BamHI。
32.权利要求28所述的方法，其中嵌合蛋白显示出在植物中的高度表达，其占植物总溶解蛋白质的大约0.5％。
33.权利要求28所述的方法，其中所述嵌合蛋白在所述转基因植物中是稳定的。
34.权利要求28所述的方法，其中暴露于所述嵌合蛋白的昆虫在死亡之前显示出体重损失。
35.权利要求28所述的方法，其中所述嵌合蛋白显示出抗处于所有发育阶段的昆虫的杀虫特性。
36.权利要求28所述的方法，其中所述嵌合蛋白为具有比亲本蛋白高几倍的能力的杀虫剂。
37.权利要求28所述的方法，其中所述嵌合蛋白的杀虫活性为，在大约4小时的暴露中有80-100％的昆虫害虫死亡率。
38.权利要求28所述的方法，其中暴露于所述嵌合蛋白大约1小时的昆虫显示出延缓的发育、不育和中断的变态。
39.权利要求28所述的方法，其中对于实夜蛾属物种的EC50为250-350ng/ml人工昆虫饲料。
40.权利要求2 8所述的方法，其中对于灰翅夜蛾属物种的EC50为25-50ng/ml人工饲料。
41.权利要求28所述的方法，其中所述方法对于转化植物的正常生长没有显示出不利影响。
全文摘要
本发明涉及SEQ ID No.1的嵌合型δ－内毒素蛋白Cry1E，其具有特别高的杀虫特性，以及SEQ ID No.2的嵌合体基因，其编码来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的δ－内毒素cry1Ea和cry1Ca的该嵌合蛋白，还涉及用该嵌合体蛋白处理受昆虫侵害的植物的方法。
文档编号C12N15/62GK1625562SQ0282885
公开日2005年6月8日 申请日期2002年3月28日 优先权日2002年3月27日
发明者R·图里 申请人:科学与工业研究会