专利名称：微型细胞中空纤维反应器的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微型细胞中空纤维反应器。
背景技术：
现有的药物药理毒理研究基于动物模型、体外原代细胞模型和连续细胞系模型三种。动物模型有实验周期长，效率低，个体差异大导致结果偏差过大，不利于动物保护等缺点，而不可消除种属差异，是动物模型致命的弱点。连续细胞系虽然培养方式简单，效率高成本低，但连续细胞系与原代培养细胞在结构和功能上仍有较大差别，并不能完全体现药物在人体或动物体内的代谢和毒性作用。
目前，国内外研究者开始重视体外原代细胞模型在药物研究上的应用。它所需细胞量少，可能从根本上消除种属差异和个体差异，干扰因素小，所得的结果重复性好。用于药物研究的体外细胞模型主要有孔板培养和平皿培养等，此种二维的方式虽然操作简单，但保持细胞活性时间短，细胞功能易丧失，不能很好的模拟体内细胞的结构和功能，这些缺陷使其应用受到了限制。而三维培养方式，如中空纤维生物人工肝反应器，虽能较长时间保持细胞功能，模拟肝脏环境，但结构复杂，需要有多路供氧和培养基循环，体积庞大，成本也相当高，显然不适用于需要小型化的药物代谢研究和高通量的药物筛选。
同时，实验室研究细胞培养条件和生产细胞代谢产物，需要一种小型化，适合进行条件实验、优化、筛选的装置。而工业生产用的大型中空纤维反应器显然无法满足这个要求。如果能找到一种既操作简单，又容易放大的培养方式，对于动物细胞工业化生产的前期研究有一定的意义。
发明内容
为了克服现有的药物研究模型的不足，从生物人工肝反应器和人工器官得到启发，本发明的目的在于提供一种微型细胞中空纤维反应器，大大简化了一般反应器所需的结构和操作，以三维培养的方式达到仿生学效果，并能长期维持动物细胞功能。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是包括硅胶管，硅胶塞，1根以上的中空纤维丝；中空纤维丝装在硅胶管中，硅胶管两头用硅胶塞封口。
所说的硅胶管和硅胶塞材料为传氧硅胶材料。
所说的中空纤维丝的材料是其截留分子量在100KDa～1000KDa的聚丙烯、聚砜、聚丙烯腈或聚乙烯；中空纤维丝中空纤维丝为1-100根。
所说的中空纤维反应器的体积为0.1ml-10ml。
本发明具有的有益的效果是能对动物细胞进行长期三维培养，保持了动物细胞的生物活性，一是作为药物代谢和药理毒理的研究的动物肝细胞体外模型，二是用于细胞培养条件和产物生产的实验室研究。并且可作为动物细胞培养条件研究的载体，为工业化生产奠定基础。
图1是本发明的结构示意图；图2是实施例1在中空纤维反应器中培养9h和129h的大鼠肝细胞存活情况照片；图3是实施例1在平皿中培养9h和129h的大鼠肝细胞存活情况照片；图4是实施例3的白蛋白和尿素产量曲线；图5是实施例4的细胞照片。
具体实施例方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
如附图1所示，本发明包括硅胶管1，硅胶塞2，1根以上的中空纤维丝3；中空纤维丝3装在硅胶管1中，硅胶管1两头用硅胶塞2封口。
具体实施例1(中空纤维反应器和平皿培养的比较)硅胶管1长13cm，内径0.8cm，外径1.2cm。硅胶塞2细端0.75cm，粗端1.35cm。中空纤维丝3聚丙烯腈材质，外径0.110cm-0.120cm，截留分子量为1000KDa。
将收获活率高于90％的大鼠肝细胞按106cells/ml密度接种于4倍浓缩培养基和鼠尾胶原溶液混合液(1∶3；v∶v)中，注入中空纤维丝3，37℃放置10分钟使之凝固。将中空纤维丝3剪短，8cm×12根，装入硅胶管1，加入5ml含5％胎牛血清Williams’E培养基，放入37℃，5％CO2培养箱静置培养。
将同批大鼠肝细胞按0.8×106cells/ml接入5ml含5％胎牛血清Williams’E培养基，在铺有鼠尾胶原的平皿培养。培养条件与上述相同。
待平皿中细胞贴壁后(12-18h)，在中空纤维反应器和平皿中分别加入含待测药物10mM醋氨酚培养基和不含药物培养基(作为空白对照)。其后每60h更换新的培养基。
各重复三组，测定肝功能指标尿素和白蛋白，观察细胞形态。
结果如下表1及附图2，3所示。
表1
附图2表示了中空纤维反应器内培养9h和129h的大鼠肝细胞存活情况，经过台盼兰染色后，图中暗色细胞为死细胞，亮色细胞为活细胞。附图3表示了平皿培养9h和129h的大鼠肝细胞存活情况，左图中细胞贴壁良好，说明细胞活率高，右图中细胞脱附成悬浮状态，贴壁消失，说明细胞活率降低。
由附图2，3和上表可见，大鼠肝细胞在中空纤维反应器内的存活状态比平皿单层培养良好，且中空纤维反应器组对肝毒性药物醋氨酚的反应比平皿组更显著，说明了中空纤维反应器比平皿更适用于药物毒性研究。
一般多孔板常被用做细胞体外的载体，而多孔板培养与平皿培养都是二维的单层培养方式，有很多的共同点。因此，实验发现中空纤维反应器培养细胞比平皿更优越，也可说明本发明与多孔板的差异。
具体实施例2(中空纤维反应器用于药物代谢的研究)硅胶管1长13cm，内径0.8cm，1.2cm。硅胶塞2细端0.75cm，粗端1.35cm。中空纤维丝3聚砜材质，外径0.110cm-0.120cm，截留分子量为1000KDa。
将收获活率高于90％的大鼠肝细胞按106cells/ml密度接种于4倍浓缩培养基和鼠尾胶原溶液混合液(1∶3；v∶v)中，注入中空纤维丝3，37℃放置10分钟使之凝固。将中空纤维丝3剪短，8cm×12根，装入硅胶管1，加入5ml含5％胎牛血清Williams’E培养基，放入37℃，5％CO2培养箱静置培养。
将同批大鼠肝细胞按0.8×106cells/ml接入5ml含5％胎牛血清Williams’E培养基，在铺有鼠尾胶原的平皿培养。培养条件与上述相同。
培养60h后，各组加入约40uM的非那西丁溶液，经过3h的药物代谢，HPLC法测定非那西丁和代谢产物醋氨酚的含量。结果如表2所示表2
由上表可见，大鼠肝细胞在中空纤维反应器内代谢非那西丁的能力高于平皿培养细胞，说明细胞色素P450活性比平皿单层培养良好，因此中空纤维反应器比平皿更适用于药物代谢研究。
具体实施例3(中空纤维反应器用于药物肝毒性的研究)硅胶管1长13cm，内径0.8cm，外径1.2cm。硅胶塞2细端0.75cm，粗端1.35cm。中空纤维丝3聚砜材质，外径0.110cm-0.120cm，截留分子量为1000KDa。
将收获活率高于90％的大鼠肝细胞按106cells/ml密度接种于4倍浓缩培养基和鼠尾胶原溶液混合液(1∶3；v∶v)中，注入中空纤维丝3，37℃放置10分钟使之凝固。将中空纤维丝3剪短，8cm×12根，装入硅胶管1，加入5ml含5％胎牛血清Williams’E培养基，放入37℃，5％CO2培养箱静置培养。
培养12-18h后，各组分别换入含药物浓度为利福平10mg/ml，异烟肼15mg/ml的培养基和不含药物的培养基，每24h取样一次，每60h换培养基一次。重复三次，测定样品的尿素和白蛋白产量。结果如附图4所示，白蛋白生成量随时间变化曲线(左)，尿素产量随时间变化曲线(右)。
由图可见，该浓度的利福平和异烟肼作用下，白蛋白和尿素的产量均低于空白对照组，因此药物对大鼠肝细胞有损伤作用，从而导致细胞肝功能的部分丧失。说明了本发明用于肝毒性药物研究的可行性。
具体实施例4(中空纤维反应器用于连续细胞株的培养)硅胶管1长13cm，内径0.8cm，1.2cm。硅胶塞2细端0.75cm，粗端1.35cm。中空纤维丝3聚丙烯材质，外径0.110cm-0.120cm，截留分子量分别为30KD和100KD。
将小鼠成纤维细胞L929按106cells/ml密度接种于4倍浓缩培养基和鼠尾胶原溶液混合液(1∶3；v∶v)中，注入如上所述的两种中空纤维丝3，37℃放置10分钟使之凝固。将中空纤维丝3剪短，8cm×12根，装入硅胶管身1，加入5ml含10％小牛血清1640培养基，放入37℃，5％CO2培养箱静置培养。
培养60h后经EB/FDA染色后的荧光显微镜照片如附图5所示，为培养60h后L929的生长情况，EB/FDA染色，×100倍荧光显微镜照片。截留分子量为100KD的聚砜中空纤维丝培养(左)，截留分子量为30KD的聚砜中空纤维丝培养(右)。
可见L929细胞在截留分子量100KD的中空纤维反应器内的生长情况(细胞增殖数量)优于相同材质的截留分子量30KD。从而筛选得到100KD聚砜中空纤维丝适合用于细胞培养。
具体实施例5(中空纤维反应器用于保肝药物的筛选)硅胶管1长13cm，内径0.8cm，外径1.2cm。硅胶塞2细端0.75cm，粗端1.35cm。中空纤维丝3聚砜材质，外径0.110cm-0.120cm，截留分子量为1000KDa。
将收获活率高于90％的大鼠肝细胞按106cells/ml密度接种于4倍浓缩培养基和鼠尾胶原溶液混合液(1∶3；v∶v)中，注入中空纤维丝3，37℃放置10分钟使之凝固。将中空纤维丝3剪短，8cm×12根，装入硅胶管1，加入5ml含5％胎牛血清Williams’E培养基，放入37℃，5％CO2培养箱静置培养。
培养12-18h后，各组分别换入含药物浓度为10mM醋氨酚培养基、10mM醋氨酚+4mM谷胱甘肽、10mM醋氨酚+4mM N-乙酰半胱氨酸、10mM醋氨酚+4mM半胱氨酸和不含药物培养基(作为空白对照)。
24h后观察细胞形态，发现10mM醋氨酚+4mM谷胱甘肽组的细胞活率较高。即从三种待选的保肝药物中筛选得到谷胱甘肽对醋氨酚的药物性肝损有保护作用。这是本发明用于保肝药物筛选的一例。
权利要求
1.一种微型细胞中空纤维反应器，其特征在于包括硅胶管(1)，硅胶塞(2)，1根以上的中空纤维丝(3)；中空纤维丝(3)装在硅胶管(1)中，硅胶管(1)两头用硅胶塞(2)封口。
2.根据权利要求1所述的一种微型细胞中空纤维反应器，其特征在于所说的硅胶管(1)和硅胶塞(2)材料为传氧硅胶材料。
3.根据权利要求1所述的一种微型细胞中空纤维反应器，其特征在于所说的中空纤维丝的材料是其截留分子量在100KDa-1000KDa的聚丙烯、聚砜、聚丙烯腈或聚乙烯；中空纤维丝(3)为1-100根。
4.根据权利要求1所述的一种微型细胞中空纤维反应器，其特征在于所说的中空纤维反应器的体积为0.1ml-10ml。
全文摘要
本发明公开了一种微型细胞中空纤维反应器，它是由透气硅胶材料的硅胶管，透气硅胶塞和中空纤维丝组成。将细胞用胶原凝胶包埋在中空纤维丝内，因微型细胞中空纤维反应器有适合细胞生存的传氧和传质能力，保持了细胞的药物代谢等功能。它结合了孔板的微型化优势和人工肝反应器的三维仿生培养优势，保持了动物细胞的生物活性，一是作为药物代谢和药理毒理的研究的动物肝细胞体外模型，二是用于细胞培养条件和产物生产的实验室研究。并且可作为动物细胞培养条件研究的载体，为工业化生产奠定基础。
文档编号C12N11/00GK1587403SQ200410053499
公开日2005年3月2日 申请日期2004年8月1日 优先权日2004年8月1日
发明者孟琴, 沈冲 申请人:浙江大学