专利名称：与大豆油分含量相关的一个数量性状基因位点的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域中与大豆油分含量相关的一个数量性状基因位点。
背景技术：
大多数重要农艺性状，如产量、品质、熟期等均表现数量性状的遗传特点，即受许多数量基因座位(或位点)(Quantitative Trait Loci，QTLs)和环境因子的共同作用。长期以来，数量遗传学是以统计推理为基础的，即将控制数量性状的多基因作为一个整体，通过数理统计学的一级和二级统计量来剖析描述QTLs的遗传特征。但这无法确定控制数量性状的QTLs的数目，更无法确定单个QTL的遗传效应以及它们在染色体上的位置。如果能将多基因性状分解成若干个单一的遗传组分，则可实现用研究单基因的方法去研究QTLs，并进而定位乃至克隆QTLs。许多学者运用传统标记在不同生物上进行了类似的研究，但由于所用的常规标记的局限性，难以实现对单个QTL的遗传效应的追踪。DNA分子标记技术及分子连锁图谱的迅猛发展，提供了这种可能。
微卫星是以少数几个核苷酸为核心单位多次串联重复的DNA序列，是一种简单序列重复(simple sequence repeats，SSR)，两侧一般是保守序列。由于它具有多态性高、共显性、容易用PCR检测和结果稳定可靠等特点，因此是一种十分理想的分子标记。
全球大豆总产量的85％用于榨油，油分含量是大豆的一种重要数量性状。国内外在这方面开展了一些研究。Mian等(1996)利用Young×PI416937的F4代120个株系对油分进行分析，得到了3个QTL位点，位于A1和L连锁群上。Qiu等(1999)利用Peking×Essex的F3代200个株系找到了1个与油分相关的QTL位点，位于H连锁群。Specht等(2001)利用Minsoy×Noir的236株RIL群体找到了9个与油分相关的QTL位点，分别位于A1、D1a、D1b、F、G、I、J、L、O等连锁群上。Chapman等(2003)利用Essex×Williams的F2代207个株系转到了5个与油分相关的QTL位点，分别位于D2、B1等连锁群上。国内只有吴晓雷等(2001)利用科丰1号×南农1138-2的RIL群体的201株系，找到了2个与油分相关的QTL位点，分别位于B2、M等连锁群上。
发明创造内容本发明的目的是提供与大豆油分含量相关的一个数量性状基因位点。
本发明所提供的与大豆油分含量相关的数量性状基因位点，名称为Qsoil2，定位于大豆的GM7-D1a连锁群，位于SSR引物位点Sat_001和Sat_114之间，与Sat_001的遗传距离为0.0cM，与Sat_114的遗传距离为7.3cM。
其中，Qsoil2的LR值为37.82(对应LOD值为8.21)，可解释18.10％的遗传变异，加性效应为0.52。
GM7-D1a连锁群如图1所示，包括Satt358、Sat_001、Sat_114、Satt226、Satt528、Satt342等28个SSR引物位点；位于“0cM”的SSR标记是Satt358；Sat_001与Satt358的遗传距离为43.0cM，Sat_114与Satt358的遗传距离为50.6cM。
实验证明，以15个高油大豆品种品系的总DNA为模板，以Sat_001(序列表中的序列1和序列2)或Sat_114(序列表中的序列3和序列4)为引物进行PCR扩增，结果表明Sat_001扩增的结果在15个高油大豆品种品系中，共有14个扩增带型与高油亲本Charleston带型一致，符合率为93.3％；Sat_114扩增的结果在15个高油品种品系中，共有13个扩增带型与高油亲本Charleston带型一致，符合率为86.7％。说明Qsoil2位点与大豆油分含量关系密切，证明Qsoil2是与大豆油分含量相关的一个数量性状基因位点。
在实际应用中，可以油分含量未知的大豆品种品系的总DNA为模板，以Sat_001(序列表中的序列1和序列2)或Sat_114(序列表中的序列3和序列4)为引物进行PCR扩增，如果扩增得到的带型与已知的高油大豆品种带型一致，则该油分含量未知的大豆品种品系为高油品种品系。
本发明定位了一个与大豆油分含量相关的数量性状基因位点Qsoil2，可用该SSR引物位点进行高油辅助育种，快速高效地选择高油后代个体，选育高油品种。因此本发明的与大豆油分含量相关的数量性状基因位点，将在高油大豆的育种和生产中发挥重要作用。
图1为大豆GM7-D1a连锁群遗传图谱图2为群体油分含量频率分布3为GM7-D1a连锁群油分QTL分析图谱具体实施方式
实施例1、Qsoil2的获得1、准备材料以美国半矮杆大豆品种Charleston(♀)为母本和以东北农业大学大豆研究所的东农594(♂)为父本，按常规方法得到由154个株系构成的F10代重组自交系(RIL)群体。
种植F10代RIL群体的154个株系，随机区组设计，5m行长，三次重复。秋季株行收获，利用Perten 8620测定油分含量，并去除不能正常成熟的11个单株(油分含量不准确)。该群体的油分含量频率分布结果如图2所示，表明油分含量呈正态分布，符合重组自交系群体理论分布。
2、总DNA的提取采用改良的SDS法(Keim P，Olson TC，and Shoemaker RC.A rapid protocolfor isolating soybean DNA.Soybean Genetics Newsletter，1988，15150-152)提取步骤1中大豆各株系的总DNA。
3、SSR分析按照soybase网址(http//129.186.26.94/)上提供的大豆微卫星序列合成共500对SSR引物，其名称分别为Satt225、Satt300、Satt276、Satt409、Satt455、Satt470、Satt233、Satt119、Satt589、Satt453、Satt415、Satt298、Satt197、SattS09、Satt063、Satt020、Satt416、Satt126、Satt338、Satt565、Satt371、Satt316、Satt286、Satt305、Satt408、Satt436、Satt203、Satt603、Satt502、Satt271、Satt141、Satt290、Satt095、Satt186、Satt389、Satt154、Satt002、Satt231、Satt369、Satt045、Satt573、Satt144、Satt334、Satt516、Satt423、Satt146、Satt218、Satt554、Satt335、Satt510、Satt472、Satt288、Satt012、Satt303、Satt130、Satt309、Satt142、Satt302、Satt314、Satt192、Satt148、Satt330、Satt049、Satt239、Satt587、Satt431、Satt596、Satt285、Satt588、Satt381、Satt242、Satt373、Satt006、Satt182、Satt551、Satt323、Satt463、Satt590、Satt387、Satt530、Satt152、Satt479、Satt259、Satt487、Sat_001、Sat_003、Sat_009、Sat_020、Sat_022、Sat_033、Sat_036、Sat_038、Sat_039、Sat_040、Sat_042、Sat_043、Sat_044、Sat_062、Sat_064、Sat_069、Sat_071、Sat_074、Sat_076、Sat_077、Sat_083、Sat_084、Sat_085、Sat_086、Sat_087、Sat_088、Sat_089、Sat_090、Sat_091、Sat_092、Sat_093、Sat_094、Sat_095、Sat_096、Sat_097、Sat_099、Sat_103、Sat_104、Sat_105、Sat_106、Sat_107、Sat_108、Sat_109、Sat_110、Sat_111、Sat_112、Sat_113、Sat_114、Sat_115、Sat_116、Sat_117、Sat_118、Sat_119、Sat_120、Sat_121、Sat_122、Sat_123、Sat_124、Sat_125、Sat_126、Sat_127、Sat_128、Sat_129、Sat_130、Sat_131、Sat_132、Sat_133、Sat_134、Sat_135、Sat_136、Sct_001、Sct_010、Sct_026、Sct_028、Sct_033、Sct_034、Sct_046、Sct_064、Sct_065、Sct_067、Sct_094、Sct_137、Sct_147、Sct_186、Sct_187、Sct_188、Sct_189、、Scaa001、Scaa003、Satt385、Satt165、Satt538、Satt187、Satt359、Satt583、Satt474、Satt556、Satt294、Satt476、Satt307、Satt184、Satt368、Satt157、Satt537、Satt458、Satt543、Satt185、Satt355、Satt269、Satt394、Satt138、Satt253、Satt434、Satt440、Satt571、Satt380、Satt244、Satt167、Satt326、Satt398、Satt462、Satt540、Satt536、Satt584、Satt393、Satt473、Satt243、Satt042、Satt511、Satt236、Satt519、Satt430、Satt168、Satt070、Satt272、Satt390、Satt429、Satt597、Satt190、Satt524、Satt164、Satt422、Satt277、Satt482、Satt402、Satt198、Satt579、Satt600、Satt350、Satt528、Satt311、Satt256、Satt230、Satt452、Satt569、Satt030、Satt490、Satt324、Satt566、Satt505、Satt442、Satt279、Satt293、Satt419、Satt127、Satt270、Satt414、Satt287、Satt132、Satt247、Satt046、Satt260、Satt446、Satt523、Satt284、Satt567、Satt308、Satt245、Satt022、Satt159、Satt009、Satt477、Satt188、Satt358、Satt038、Satt050、Satt076、Satt079、Satt080、Satt082、Satt094、Satt117、Satt134、Satt139、Satt149、Satt150、Satt151、Satt153、Satt155、Satt160、Satt162、Satt163、Satt166、Satt169、Satt172、Satt173、Satt174、Satt175、Satt179、Satt180、Satt189、Satt191、Satt193、Satt195、Satt196、Satt199、Satt200、Satt201、Satt202、Satt204、Satt211、Satt216、Satt220、Satt226、Satt229、Satt237、Satt240、Satt248、Satt249、Satt251、Satt252、Satt254、Satt257、Satt258、Satt262、Satt263、Satt266、Satt267、Satt273、Satt274、Satt278、Satt289、Satt292、Satt301、Satt318、Satt320、Satt321、Satt325、Satt327、Satt329、Satt331、Satt336、Satt341、Satt342、Satt343、Satt349、Satt354、Satt365、Satt370、Satt372、Satt376、Satt382、Satt383、Satt413、Satt420、Satt421、Satt424、Satt426、Satt428、Satt435、Satt437、Satt439、Satt445、Satt449、Satt457、Satt459、Satt460、Satt468、Satt495、Satt504、Satt514、Satt515、Satt521、Satt522、Satt527、Satt539、Satt541、Satt545、Satt547、Satt555、Satt558、Satt570、Satt574、Satt576、Satt581、Satt586、Satt031、Satt041、Satt100、Satt123、Satt145、Satt156、Satt238、Satt241、Satt264、Satt282、Satt337、Satt345、Satt348、Satt353、Satt356、Satt375、Satt396、Satt405、Satt417、Satt467、Satt471、Satt520、Satt531、Satt549、Satt550、Satt552、Satt560、Satt564、Satt592、GMABAB、GMENOD2B、GMGLPSI2、GMRUBP、SOYHSP176、SOYGPATR、SOYLBC、SOYNOD26A、SOYPRP1、GMSC514、Sat_181、Sat_182、Sat_183、Sat_185、Sat_186、Sat_187、Sat_189、Sat_190、Sat_191、Sat_192、Sat_193、Sat_217、Sat_218、Sat_219、Sat_220、Sat_221、Sat_222、Sat_223、Sat_224、Sat_226、Sat_227、Sat_228、Sat_247、Sat_250、Sat_251、Sat_252、Sat_253、Sat_254、Sat_255、Sat_256、Sat_258、Sat_259、Sat_260、Sat_319、Sat_320、Sat_321、Sat_322、Sat_324、Sat_325、Sat_326、Sat_330、Sat_331、Sat_332、Sat_333、Sat_352、Sat_353、Sat_354、Sat_355、Sat_356、Sat_357、Sat_358、Sat_359、Sat_360、Sat_361、Sat_362、Satt613、Satt614、Satt615、Satt617、Satt618、Satt619、Satt620、Satt621、Satt622、Satt623、Satt633、Satt634、Satt635、Satt636、Satt637、Satt638、Satt640、Satt641、Satt643、Satt644、Satt646、Satt716、Satt717、Satt718、Satt720、Satt723。其中引物Satt358、Sat_001、Sat_114、Satt226、Satt528的序列分别如表1所示。
表1.部分SSR引物核苷酸组成
以步骤2中提取的总DNA为模板，利用上述SSR引物进行PCR扩增。其中PCR反应体系为采用20μl反应体系，包括30ng大豆总DNA，各1.5μmol/L上游引物和下游引物，2.5μmol/L dNTP，1.5μl 10×缓冲液，1U Taq酶，用超纯水补足20μl。循环扩增程序为95℃预变性5min，进入循环94℃变性30sec；47℃复性30sec；72℃延伸30sec；循环20次后在72℃延伸5min，置于4℃下保存。扩增产物利用银染法显示，照相，统计带型。
4、数据处理将来源于亲本Charleston(♀)带型记为1，来源于东农594(♂)带型记为2，双亲杂合带型为3，缺失或模糊带型记为0。利用Mapmaker/EXP3.0作图软件，构建分子标记连锁图谱。应用Group命令进行连锁分析和分组(LOD＝5.0)，连锁标记少于8个的用Compare命令进行优化排序，多于8个的用Ripple命令排序，错误检测水平设为1％，利用Kosambi函数将重组率转化为遗传图距(cM)。根据已由Cregan等定位的SSR标记作为锚定标记以确定相应的连锁群，构建的大豆遗传图谱如图1所示。
利用MapChart 2.1版本绘制连锁图谱。利用Windows QTL Cartographer V2.0进行复合区间作图扫描农艺性状的QTLs，以似然比LR(Likehood Ratio)大于11.5，即对应LOD值大于2.5作为QTLs存在的阈值，并分析确定由Sat 001与Sat 114两个引物区间得到的Qsoil2为与大豆油分含量相关的一个数量性状基因位点。结果如图3所示，表明Qsoil2定位于大豆的GM7-D1a连锁群，位于SSR引物位点Sat_001和Sat_114之间，与Sat_001的遗传距离为0.0cM，与Sat_114的遗传距离为7.3cM。Qsoil2的LR值为37.82(对应LOD值为8.21)，可解释18.10％的遗传变异，加性效应为0.52。图3中，连锁群-7(D1a)，是代表大豆公共遗传连锁图谱上的第七条连锁群，代号为D1a。
实施例2、Qsoil2是与大豆油分含量相关的一个数量性状基因位点的证实实验材料包括高油亲本Charleston和高油大豆品种品系红丰9号、东农46、东农47、瑞士CH21507、绥农10号、垦农18、瑞士SIERA、东农Q012、东农Q028、东农Q059、东农Q072、东农Q082、东农Q114、东农Q156、东农32299。
按照实施例1的方法进行以下操作提取上述大豆品种的总DNA，以上述大豆品种的总DNA为模板，分别以Sat_001(序列表中的序列1和序列2)和Sat_114(序列表中的序列3和序列4)为引物进行PCR扩增，结果表明Sat_001扩增的结果在15个高油品种品系中，共有14个扩增带型与高油亲本Charleston带型一致，符合率为93.3％；Sat_114扩增的结果在15个高油品种品系中，共有13个扩增带型与高油亲本Charleston带型一致，符合率为86.7％。说明Qsoil2位点与大豆油分含量关系密切，证明Qsoil2是与大豆油分含量相关的一个数量性状基因位点。
序列表<160>4<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1gcggatacga ccaaaaattg tt 22<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2gcgaactgcg aagatactac cc 22<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3aactcaaatc caaactcact 20<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4actcagtaaa taacaaaagt catt2权利要求
1.一个与大豆油分含量相关的数量性状基因位点，定位于大豆的GM7-D1a连锁群，位于SSR引物位点Sat_001和Sat_114之间，与Sat_001的遗传距离为0.0cM，与Sat_114的遗传距离为7.3cM。
2.根据权利要求1所述的数量性状基因位点，其特征在于所述数量性状基因位点的LR值为37.82，可解释18.10％的遗传变异，加性效应为0.52。
3.根据权利要求1或2所述的数量性状基因位点，其特征在于所述GM7-D1a连锁群包括Satt358、Sat_001、Sat_114、Satt226、Satt528、Satt342在内的28个SSR引物位点。
全文摘要
本发明公开了一个与大豆油分含量相关的数量性状基因位点。本发明所提供的与大豆油分含量相关的数量性状基因位点，定位于大豆的GM7－D1a连锁群，位于SSR引物位点Sat 001和Sat 114之间，与Sat 001的遗传距离为0.0cM，与Sat 114的遗传距离为7.3cM。所述数量性状基因位点的LR值为37.82(对应LOD值为8.21)，可解释18.10％的遗传变异，加性效应为0.52。可用该位点的DNA克隆制备转基因大豆，分析油分含量，逐步缩小DNA范围寻找主基因。本发明的与大豆油分含量相关的数量性状基因位点，将在高油大豆的育种和生产中发挥重要作用。
文档编号C12N15/11GK1757729SQ20041008046
公开日2006年4月12日 申请日期2004年10月10日 优先权日2004年10月10日
发明者陈庆山, 李文滨, 张忠臣, 杨庆凯, 刘春燕, 张文慧, 张力军, 陈立君, 藤伟丽 申请人:东北农业大学